岳亞光， 檀薇薇， 王文川， 殷建敏， 李 鑫△

（邢臺市人民醫(yī)院 1消化內(nèi)科，2中西醫(yī)結(jié)合肝病科，3超聲科，河北邢臺 054001）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種從單純性脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）的代謝綜合征，是世界上發(fā)病率最高的肝臟疾病，進展為NASH 是肝硬化和癌變的嚴(yán)重危險因素［1］。肝臟鐵沉積的存在與NAFLD 患者的不同組織學(xué)特征相關(guān)，10%～50%的NAFLD患者表現(xiàn)出肝臟鐵積累和/或高鐵蛋白血癥［2］；并且肝臟中鐵的積累被認(rèn)為是NASH 的加重因素［3-4］。鐵死亡是最近公認(rèn)的一種細(xì)胞死亡形式，是鐵依賴性和脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)的非凋亡性細(xì)胞死亡；該死亡方式依賴于細(xì)胞內(nèi)鐵和活性氧（reactive oxygen species，ROS），以脂質(zhì)過氧化為特征。當(dāng)細(xì)胞的內(nèi)源性抗氧化狀態(tài)受到損害時，它就會被觸發(fā)，導(dǎo)致脂質(zhì)ROS 積累，這對膜結(jié)構(gòu)具有毒性和破壞性。因此，細(xì)胞的氧化應(yīng)激和抗氧化水平是誘導(dǎo)這種新型細(xì)胞死亡脂質(zhì)過氧化的重要調(diào)節(jié)劑［5］。

越來越多的證據(jù)表明，鐵死亡在調(diào)節(jié)肝臟多種病理進展中起著不可忽視的作用，肝鐵死亡作為引發(fā)NASH 炎癥的觸發(fā)因素起著重要作用，并且可能是預(yù)防NAFLD 發(fā)作的治療靶點［6-7］。谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，Gpx4）是鐵死亡的調(diào)節(jié)劑，核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）的轉(zhuǎn)錄激活與抗鐵死亡有關(guān)［8］。在鐵死亡途徑中，大多數(shù)級聯(lián)或相互作用的酶和蛋白質(zhì)，例如胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白（cystine/glutamate antiporter system light chain，xCT）、Gpx4、鐵轉(zhuǎn)運蛋白和血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）等均受抗氧化反應(yīng)元件Nrf2 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。Nrf2 基因的失活、抑制和敲低會增強細(xì)胞的鐵死亡；激活Nrf2信號通路減少鐵死亡可改善NAFLD［9］。

二甲雙胍（metformin，Met）是2 型糖尿病的一線治療藥物，可減少胰島素抵抗和2 型糖尿病患者的心血管事件。Met減少了肝臟葡萄糖的產(chǎn)生［10］，肝臟被認(rèn)為是其作用的靶組織。據(jù)報道，Met可通過多種作用途徑減輕NAFLD 的肝損傷，但其具體作用機制還有待進一步研究探討［11-12］。Met 對胰島素抵抗的改善作用與其調(diào)控Nrf2信號通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)從而改善氧化應(yīng)激有關(guān)［13］，并且其可通過激活Nrf2/HO-1 信號通路減輕糖尿病大鼠肝臟損傷［14］。另有研究顯示Met 可通過激活Nrf2 信號通路發(fā)揮抗鐵死亡作用，增強血管平滑肌細(xì)胞的抗氧化能力，減弱高脂血癥相關(guān)的血管鈣化［15］，但其對NAFLD 中細(xì)胞鐵死亡現(xiàn)象是否具有調(diào)控作用尚未有研究。因此，本研究通過高脂飲食（high-fat diet，HFD）構(gòu)建大鼠NAFLD 模型，探究Met 對NAFLD 大鼠肝細(xì)胞鐵死亡現(xiàn)象的影響并進一步探討其發(fā)揮抗鐵死亡作用的具體機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠46只，6 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自濟南朋悅動物繁育有限公司，合格證號為SCXK（魯）20190003。大鼠在溫度（20±2）℃、濕度（45～55）%、12 h 光照/12 h 黑暗周期的條件下飼養(yǎng)，可自由飲食和攝水。實驗前，所有大鼠均用普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，然后開始實驗。實驗經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 試劑 Met（格華止，中美上海施貴寶制藥有限公司）；Nrf2 抑制劑鴉膽子苦醇（brusatol），購自Med-ChemExpress；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate amino transferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；大鼠白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；普魯士藍(lán)染色試劑盒（Perls stain，核固紅法）購自北京索萊寶科技有限公司；ROS 測定試劑盒（化學(xué)熒光法）購自南京建成生物工程研究所；油紅O 染色試劑盒和鐵測定試劑盒（比色法）購自Sigma-Aldrich；HE 染色、RIPA 裂解液和BCA 試劑盒均購自碧云天生物科技公司；兔源I抗Gpx4、xCT、Nrf2、HO-1、β-actin 及羊抗兔IgG H＆amp;L（HRP）購自Abcam；Gpx4、xCT、Nrf2及HO-1的引物序列購自上海GenePharma。

2 方法

2.1 模型的建立與分組 SD 大鼠46 只，隨機選取11 只大鼠為對照（control）組，以普通飼料喂養(yǎng)，其余35 只大鼠為造模組，給予高脂飼料（73.6%基礎(chǔ)飼料、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉、10%蛋黃粉、15%豬油）連續(xù)喂養(yǎng)8 周復(fù)制NAFLD 模型［16-17］。8 周后從對照組和造模組中隨機抽取3 只大鼠處死，進行肝功能（ALT 和AST）、血脂（TG、TC、LDL-C 和HDL-C）水平檢測及肝組織HE染色，判斷造模是否成功。結(jié)果顯示，造模大鼠肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯脂肪變性，脂肪空泡、小葉炎癥，同時肝功能和血脂均異常，造模成功。

將造模大鼠隨機分為NAFLD 組、低劑量（100 mg/kg）Met（Met-low dose，Met-L）組、高劑量（200 mg/kg）Met（Met-high dose，Met-H）組和Met+brusatol（Nrf2 抑制劑）組［18］，每組8 只。分組完成后，Met 各劑量組灌胃相應(yīng)的藥物，每天1 次，連續(xù)給藥6 周；Met+brusatol 組大鼠在給予200 mg/kg Met 灌胃的同時隔天腹腔注射Nrf2 抑制劑2 mg/kg brusatol（溶于1%二甲基亞砜中），連續(xù)給藥6 周；control 組和NAFLD組給予等量生理鹽水灌胃和腹腔注射。

2.2 血清肝功能、血脂和炎癥因子水平檢測 給藥結(jié)束后，麻醉大鼠，腹主動脈取血，靜置后以1 008×g離心15 min，分離血清，按照試劑盒說明書的操作檢測血清中ALT、AST、TG、TC、LDL-C、HDL-C、TNF-α和IL-6水平。

2.3 肝組織鐵離子和氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測 取血完成后，處死大鼠，取出肝臟，預(yù)冷的生理鹽水洗凈殘血，于冰上用無菌手術(shù)刀片切分為4 部分，第1 部分置于凍存管中，-80 ℃保存；第2部分用4%多聚甲醛固定；第3 部分做冰凍切片，OCT 包埋；第4 部分稱重后，加預(yù)冷的生理鹽水研磨，制備10%的勻漿，離心取上清液。BCA 法測定蛋白濃度后，TBA 法檢測勻漿中MDA 含量，微量酶標(biāo)法檢測GSH 含量，比色法檢測鐵離子含量；并按照ROS 試劑盒說明書于熒光酶標(biāo)儀中在593 nm 處檢測各孔吸光度（A）值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣品中ROS水平。

2.4 HE 染色檢測肝組織病理學(xué)變化 取4%多聚甲醛固定的肝組織，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切4 μm 薄片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯，蒸餾水沖洗；常規(guī)HE染色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)變化，對肝組織HE 染色切片進行病理分析，并對NAFLD 活動評分（NAFLD activity score，NAS）進行統(tǒng)計學(xué)評估［19］，每張切片選取4 個不同的視野，總得分0～8分，具體情況見表1。

表1 NAS評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1. NAS scoring standard

2.5 油紅O染色檢測肝細(xì)胞脂質(zhì)積累 取2.3項下部分肝組織在15%和30%蔗糖溶液中脫水48 h，然后包埋OCT 中，切10 μm 切片，油紅O 染色15 min，75%乙醇分化2 s，蘇木素復(fù)染2 min，流水沖洗后1%鹽酸乙醇分色，氨水返藍(lán)，甘油明膠封片，倒置熒光顯微鏡下觀察，采用Image-pro Plus 6.0 軟件計算油紅O 陽性面積的百分比，評估肝細(xì)胞的脂質(zhì)積累情況；肝組織細(xì)胞中脂滴呈橘紅色，核呈藍(lán)色。

2.6 普魯士藍(lán)染色檢測肝臟中鐵沉積 取2.4 項下石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，蒸餾水沖洗后，Perls 染色液（試劑A1 與試劑A2 等量混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用）染色30 min，再次沖洗后，用核固紅試劑B 染核10 min，蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織胞質(zhì)內(nèi)藍(lán)色顆粒。每張切片隨機選取5 個視野，通過圖像分析測量普魯士藍(lán)染色陽性面積占整個面積的百分比。

2.7 Western blot 檢測肝組織Nrf2、HO-1、Gpx4 和xCT 蛋白的表達(dá) 稱取適量肝組織，加入RIPA 裂解液提取蛋白質(zhì)。經(jīng)BCA 定量后，取每孔30 μg 蛋白質(zhì)樣品上樣，經(jīng)10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后用含有0.1% Tween-20 的Tris 緩沖液（TBST）洗滌3 次，每次10 min。然后將膜與Ⅰ抗（Nrf2、HO-1、Gpx4、xCT和β-actin；1∶500稀釋）在4 ℃下孵育過夜。用TBST洗滌3次，每次10 min，后將膜與Ⅱ抗（1∶2 000 稀釋）在37 ℃孵育2 h。然后用TBST 洗滌膜3次，每次10 min。最后ECL 顯色，以βactin為內(nèi)參照，分析膜上蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

2.8 RT-qPCR 檢測肝組織Nrf2、HO-1、Gpx4 和xCT的mRNA 表達(dá) 取-80 ℃保存的部分肝組織，使用Trizol提取組織中的總RNA，NanaDrop分光光度計檢測總RNA 的濃度和純度；然后按照試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行PCR 擴增。反應(yīng)體系（25 μL）：SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA（200 mg/L）1 μL，ddH2O 11 μL。反應(yīng)條件：94℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃20 s，75 ℃20 s，40 個循環(huán)結(jié)束后，采用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達(dá)量。用β-actin 作為內(nèi)參照，引物序列見表2。

表2 RT-qPCR相關(guān)引物的序列Table 2. Sequences of RT-qPCR-related primers

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用GraphPad Prism 9.0 和Image-Pro Plus 6.0 軟件進行分析，多組間比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），組間有差異進一步采用SNK-q檢驗進行兩兩比較；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 各組大鼠肝功能和炎癥因子水平的比較

與control 組相比，NAFLD 組血清ALT、AST、TNF-α 和IL-6 水平顯著升高（P＜0.05）；與NAFLD 組相比，Met-L、Met-H 組血清ALT、AST、TNF-α 和IL-6水平顯著降低（P＜0.05）；與Met-H 組相比，Met+brusatol 組血清中上述指標(biāo)水平均顯著升高（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠血清ALT、AST、TNF-α和IL-6水平Table 3. Serum ALT，AST，TNF-α and IL-6 levels of rats in each group（Mean±SD.n=8）

2 各組大鼠血脂水平的比較

與control 組相比，NAFLD 組血清TC、TG 和LDLC 水平顯著升高，HDL-C 水平顯著降低（P＜0.05）；與NAFLD 組相比，Met-L 和Met-H 組血清TC、TG 和LDL-C 水平顯著降低，HDL-C 水平顯著升高（P＜0.05）；與Met-H 組相比，Met+brusatol 組血清TC、TG和LDL-C 水平顯著升高，HDL-C 水平顯著降低（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠血脂水平Table 4. Blood lipid levels of rats in each group（Mean±SD.n=8）

3 各組大鼠肝組織鐵離子含量和氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

與control 組相比，NAFLD 組肝組織鐵離子含量及MDA 和ROS 水平顯著升高，GSH 含量顯著降低（P＜0.05）；與NAFLD 組相比，Met-L 和Met-H 組肝組織鐵離子含量及MDA 和ROS 水平顯著降低，GSH 含量顯著升高（P＜0.05）；與Met-H組相比，Met+brusatol組鐵離子含量及MDA 和ROS 水平顯著升高，GSH 含量顯著降低（P＜0.05），見表5。

表5 各組大鼠肝組織鐵離子和氧化應(yīng)激指標(biāo)水平Table 5. The levels of ferri ions and oxidative stress indexes in the liver tissues of rats in each group（Mean±SD.n=8）

4 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化

HE 染色結(jié)果顯示，control 組肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞無脂化，無炎癥細(xì)胞浸潤；NAFLD組肝細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)腫脹，細(xì)胞內(nèi)存在脂滴空泡，有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象；在給予Met 治療后，肝細(xì)胞脂肪變性明顯減輕，大部分肝細(xì)胞接近正常形態(tài)，脂滴空泡現(xiàn)象和炎癥細(xì)胞浸潤減少，且Met-H 組肝細(xì)胞損傷改善最佳；Met+brusatol 組肝細(xì)胞脂滴空泡現(xiàn)象和炎癥細(xì)胞浸潤程度較Met-H 組有所加重，見圖1。與control 組相比，NAFLD 組肝組織NAS 評分顯著升高（P＜0.05）；與NAFLD 組相比，Met-L 和Met-H 組肝組織NAS 評分顯著降低（P＜0.05）；與Met-H 組相比，Met+brusatol 組肝組織NAS評分顯著升高（P＜0.05），見表6。

Figure 1. Representative image of HE staining of rat liver tissues. The transparent vesicles shown by the black arrows are lipid droplets，the red is the cytoplasm，and the blue is the nucleus. A：control group；B：NAFLD group；C：Met-L group；D：Met-H group；E：Met+brusatol group. The scale bar=20 μm.圖1 大鼠肝組織HE染色圖

5 各組大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)積累和鐵沉積比較

油紅O 染色和普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示，control組大鼠肝組織無明顯脂滴沉積，肝細(xì)胞內(nèi)未見明顯藍(lán)色染色顆粒，普魯士藍(lán)染色呈陰性，表明沒有脂質(zhì)積累和鐵沉積；NAFLD 組大鼠肝臟中有大量脂滴沉積，肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)不同數(shù)量的深藍(lán)色顆粒，油紅O 染色和普魯士藍(lán)染色陽性面積百分比較control 組顯著增加（P＜0.05），表明有顯著的脂質(zhì)積累和鐵沉積；給予Met 治療后，肝組織脂滴沉積和胞質(zhì)內(nèi)藍(lán)色顆粒明顯減少，油紅O 和普魯士藍(lán)染色陽性面積百分比較NAFLD 組顯著降低（P＜0.05）；與Met-H 組相比，Met+brusatol 組肝組織油紅O 和普魯士藍(lán)染色陽性面積百分比顯著升高（P＜0.05），見圖2、3及表6。

表6 各組大鼠肝組織NAS及油紅O和普魯士藍(lán)染色陽性面積Table 6. NAS，and oil red O and Prussian blue staining positive areas of rat liver tissues in each group（Mean±SD.n=8）

Figure 2. Representative image of oil red O staining of rat liver tissues. Red represented lipid droplets，and blue representd cell nuclei. A：control group；B：NAFLD group；C：Met-L group；D：Met-H group；E：Met+brusatol group. The scale bar=20 μm.圖2 大鼠肝組織油紅O染色圖

Figure 3. Representative image of rat liver tissues stained with Prussian blue. The blue particles in the cytoplasm were iron deposits.A：control group；B：NAFLD group；C：Met-L group；D：Met-H group；E：Met+brusatol group. The scale bar=20 μm.圖3 大鼠肝組織普魯士藍(lán)染色圖

6 各組大鼠肝組織Nrf2、HO-1、Gpx4 和xCT 蛋白表達(dá)的比較

與control 組相比，NAFLD 組肝組織Nrf2、HO-1、Gpx4 和xCT 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與NAFLD組相比，Met-L和Met-H組肝組織Nrf2、HO-1、Gpx4和xCT 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與Met-H 組相比，Met+brusatol 組肝組織上述蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. The protein expression of Nrf2，HO-1，GPx4 and XCT in rat liver tissues. Mean±SD.n=8.*P＜0.05vs control group；#P＜0.05vs NAFLD group；△P＜0.05vs Met-H group.圖4 大鼠肝組織Nrf2、HO-1、Gpx4和xCT蛋白表達(dá)

7 各組大鼠肝組織Nrf2、HO-1、Gpx4 和xCT mRNA表達(dá)的比較

與control 組相比，NAFLD 組肝組織Nrf2、HO-1、Gpx4 和xCT 的mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與NAFLD 組相比，Met-L和Met-H組肝組織Nrf2、HO-1、Gpx4 和xCT 的mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與Met-H 組相比，Met+brusatol 組肝組織上述mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見表7。

表7 各組大鼠肝組織Nrf2、HO-1、Gpx4和xCT的mRNA表達(dá)Table 7. The mRNA expression of Nrf2，HO-1，Gpx4 and xCT in liver tissues of the rats in each group（Mean±SD.n=8）

討論

肥胖、胰島素抵抗、特別是2 型糖尿病是NAFLD和NASH 發(fā)展的主要因素。因此，NASH 可以稱為“糖尿病肝病”。由于肥胖和糖尿病的流行，NAFLD和NASH 的患病率正在增加。目前沒有針對NAFLD/NASH 的既定療法。唯一被證明有效的干預(yù)措施是減肥和體育鍛煉［20］。Met在抑制肝臟糖異生、改變肝臟脂肪酸代謝、提高脂肪酸氧化及抑制脂肪生成和增強胰島素敏感性方面的益處已得到公認(rèn)。近年來研究顯示Met 可改善NAFLD，減輕高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD 小鼠肝臟中的炎癥和脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物水平［21-22］；還可改善NASH 患者的肝功能生化指標(biāo)（ALT、AST 和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶等）［23］，并降低患有肝硬化的糖尿病患者發(fā)生肝細(xì)胞癌的風(fēng)險［24］。本研究結(jié)果顯示，NAFLD 大鼠經(jīng)Met治療后，大鼠的肝功能和血脂異常得到明顯改善，與以往的研究結(jié)果一致，再次驗證了Met對NAFLD的保護作用。

氧化應(yīng)激是指ROS 的過度產(chǎn)生，削弱了內(nèi)源性抗氧化防御功能，導(dǎo)致細(xì)胞損傷［25］。鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物的積累是NAFLD 的重要原因之一［9］。鐵在人體中通常以三價鐵（Fe3+）形式存在，在一些酶和轉(zhuǎn)運蛋白的作用下其從循環(huán)系統(tǒng)進入到細(xì)胞質(zhì)和線粒體內(nèi)變成具有氧化還原活性的二價鐵（Fe2+），這些活性鐵會通過芬頓反應(yīng)催化產(chǎn)生ROS，鐵依賴產(chǎn)生的ROS 與脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡。此外，GSH 消耗誘導(dǎo)的Gpx4 失活所導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化也參與鐵死亡［26-27］。有研究顯示，在大約三分之一的成年NAFLD 患者中可觀察到肝臟鐵儲備的增加，其可通過增加氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝來促進疾病的發(fā)生和進展［28］。在本研究中，給予高脂飼料喂養(yǎng)后，NAFLD 大鼠肝組織鐵離子含量、MDA、ROS 水平顯著升高，而GSH 含量顯著降低，同時油紅O 染色和普魯士藍(lán)染色結(jié)果表明大鼠肝臟中有大量的脂質(zhì)積累和鐵沉積；說明NAFLD 大鼠肝組織出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化和鐵過載，這與已有的報道一致。通過查閱文獻(xiàn)，高脂飼料喂與主要鐵攝取蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor-1, TfR-1）的表達(dá)增加有關(guān)，可誘導(dǎo)肝臟鐵過載，促進脂肪變性的發(fā)展［29］。給予鐵死亡抑制劑可抑制肝臟脂質(zhì)過氧化及其相關(guān)的細(xì)胞死亡，從而降低NASH 的嚴(yán)重程度［30］。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)Met治療后，NAFLD 大鼠的抗氧化防御能力增強，脂質(zhì)積累和鐵沉積顯著減少；提示Met 可減少鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物的積累，具有抑制鐵死亡的作用。然而，其抑制鐵死亡的分子機制尚不清楚。

鐵死亡是一種由脂質(zhì)過氧化驅(qū)動的鐵依賴性氧化細(xì)胞死亡。各種抗氧化系統(tǒng)在防止脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)的鐵死亡中起重要作用，尤其是系統(tǒng)胱胺酸/谷胺酸逆向轉(zhuǎn)運體/GSH/Gpx4 軸［26］。系統(tǒng)胱胺酸/谷胺酸逆向轉(zhuǎn)運體是一種反向轉(zhuǎn)運蛋白，它輸出谷氨酸鹽，同時輸入胱氨酸以轉(zhuǎn)化為半胱氨酸用于GSH 合成；Gpx4是一種脂質(zhì)修復(fù)酶，是鐵死亡的主要調(diào)節(jié)者，可利用GSH 干擾脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。而Gpx4 的表達(dá)受Nrf2 的調(diào)節(jié)，當(dāng)受到外界氧化應(yīng)激因子刺激后，Nrf2與其抑制蛋白Keap1 解離活化，進入細(xì)胞核，啟動其下游靶基因如SOD、Gpx4、xCT和HO-1等的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用［31-32］。Nrf2/HO-1 信號通路在NAFLD的進展中發(fā)揮著重要作用；激活Nrf2/HO-1 通路可改善脂質(zhì)功能障礙，保護肝臟免受NAFLD 的侵害［33］。鐘桂玲等［34］的研究顯示通過激活Nrf2，上調(diào)Gpx4 的表達(dá)，可降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，抑制RSL3（一種鐵死亡誘導(dǎo)劑）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡；這就提示我們Nrf2/Gpx4 通路的激活可抑制鐵死亡。本研究結(jié)果顯示，Met 可上調(diào)NAFLD 大鼠肝組織中Nrf2、HO-1、Gpx4、xCT 的表達(dá)；而且Nrf2 抑制劑brusatol 能明顯逆轉(zhuǎn)Met 對Nrf2/Gpx4 通路的激活作用以及對NAFLD 大鼠肝臟的保護作用，提示Met 可能通過激活Nrf2/Gpx4通路，抑制鐵死亡，保護肝臟免受損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果表明Met 對NAFLD 大鼠肝臟的保護作用可能與其抑制細(xì)胞鐵死亡有關(guān)，機制可能與激活Nrf2/Gpx4 通路有關(guān)。然而本研究尚存在一定不足，未對Nrf2上游通路進行研究，亦有研究顯示激活A(yù)MPK通路可抑制鐵死亡［35］，而Met是一種公認(rèn)的AMPK 激動劑［36］，AMPK 是否為其上游機制，有待進一步研究。