韋 杏， 鄒 敏， 李崇進(jìn)， 農(nóng)志飛， 藍(lán)毓?fàn)I△

（1廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯醫(yī)藥學(xué)院，廣西南寧 530001；2廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院兒科，廣西南寧 530200；3茂名市中醫(yī)院兒科，廣東茂名 525000；4廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，廣西南寧 530023）

急性支氣管炎是一種由病毒、細(xì)菌或理化因素（如冷空氣和粉塵等）引起的以急性咳嗽為表現(xiàn)的下呼吸道炎癥。據(jù)報(bào)道，大多數(shù)患者治療方法不恰當(dāng)或無效［1］，多達(dá)60%的急性支氣管炎抗生素處方不合理［2］，增加了抗生素抗藥性的患病率和醫(yī)療成本［3-4］。因此，醫(yī)師面臨著提供循證有效的癥狀控制療法的挑戰(zhàn)。中醫(yī)在本病治療上具有獨(dú)特優(yōu)勢，可調(diào)理體質(zhì)，從根本上減少疾病發(fā)生和反復(fù)發(fā)作。壯藥作為中醫(yī)藥學(xué)的一個(gè)組成部分，在治療上也獲得明顯的療效。壯藥龍盤止咳方（Longpan-Zhike decoction，LPZKD）由龍脷葉、魚腥草、不出林、柿葉、盤龍參及甘草組成，治療小兒急性支氣管炎（風(fēng)熱犯肺證）療效顯著，且安全性好［5］，但其作用機(jī)制尚不明確。

炎癥因子是本病發(fā)病過程中的重要組成部分，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）與許多炎性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是最重要的炎癥小體類型之一［6］。NLRP3 炎癥小體的過度激活，在呼吸道的大多數(shù)病毒感染過程中能夠?qū)е卵装Y反應(yīng)和組織損傷［7］。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是NLRP3炎癥小體激活的重要因素，兩者之間存在正相關(guān)關(guān)系［8］。p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）可通過NF-κB 調(diào)節(jié)細(xì)胞腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18 的表達(dá)，介導(dǎo)肺損傷［9-10］。在急性支氣管炎模型中，p38 MAPK 通路被激活，參與了呼吸道炎癥反應(yīng)［11］。故本研究旨在探究壯藥龍盤止咳方對急性支氣管炎發(fā)揮保護(hù)作用的潛在機(jī)制，以期為更廣泛的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SPF 級KM 小鼠80 只，4 周齡，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，購自濟(jì)南朋悅動(dòng)物繁育有限公司，合格證號為SCXK（魯）2019-0003。在溫度（20±2）℃、濕度45%～55%、12 h光照/12 h黑暗周期的條件下飼養(yǎng)，可自由飲食和攝水。實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》的指導(dǎo)原則。所有小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，然后開始實(shí)驗(yàn)。

2 主要藥品、試劑及儀器

壯藥龍盤止咳方含龍脷葉10 g、魚腥草10 g、不出林5 g、柿葉5 g、盤龍參5 g 和甘草5 g，這些藥材均購自北京同仁堂；上述藥材加入8 倍量的水分充分浸泡30 min，煎煮40 min，過濾藥液，藥渣再加入6 倍量的水繼續(xù)煎煮40 min 后過濾藥液，合并兩次藥液，煎煮濃縮至100 mL，1 mL相當(dāng)于生藥0.4 g。

p38 MAPK 特異性抑制劑SB203580 和CelLytic?NuCLEAR?提取試劑盒（NXTRACT）購自Sigma-Aldrich；HE 染色試劑、RIPA 裂解液和BCA 試劑盒購自碧云天生物科技公司；小鼠TNF-α、IL-1β 和IL-18 ELISA 檢測試劑盒購自武漢貝茵萊生物科技有限公司；Trizol、PrimeScript?RT 試劑盒和SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ試劑盒購自TaKaRa；RT-qPCR 引物購自上海吉瑪基因（GenePharma）；兔源Ⅰ抗（p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、NLRP3、cleaved caspase-1、β-actin 和histone H3）和山羊抗兔IgG（H+L）購自Cell Signaling Technology。

iMark680 多功能酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置和Quantity One 4.6.2 軟件（Bio-Rad）；Prism?7300 型熒光定量PCR系統(tǒng)（ABI）；BX61電動(dòng)顯微鏡（Olympus）。

3 主要方法

3.1 模型的建立與分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)選取16 只小鼠作為對照，其余小鼠采用煙熏法建立急性支氣管炎模型［12-13］。具體操作為：將小鼠置于自制煙熏箱（用有機(jī)玻璃制作，80 cm×80 cm×80 cm）中，取刨花和煙葉各50 g，于每天8：00 和15：00 各煙熏1 次，每次30 min，連續(xù)7 d。當(dāng)小鼠出現(xiàn)咳嗽、流涕、呼吸急促、精神萎靡、形體消瘦、聚集、瞇眼等表現(xiàn)后，停止煙熏，從對照組和造模小鼠中各隨機(jī)選取4 只小鼠（雌雄各2 只），處死后取氣管和肺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行HE染色，觀察小鼠氣管和肺組織病理變化。對照小鼠光鏡下顯示：肺內(nèi)各級支氣管結(jié)構(gòu)正常，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔內(nèi)無滲出，未見炎癥細(xì)胞浸潤；造模小鼠可見支氣管壁增厚，黏膜充血、水腫，管壁和管腔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤，且肺組織有滲出液，明顯水腫、充血，肺泡間隔增寬、肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)和肺泡之間有炎癥細(xì)胞浸潤，提示造模成功。

將造模成功的60 只小鼠隨機(jī)分為模型（model）組、SB203580（5 mg/kg［14］）組、高劑量（10.4 g/kg）龍盤止咳方（LPZKD-H）組、低劑量（5.2 g/kg）龍盤止咳方（LPZKD-L）組、龍盤止咳方（10.4 g/kg）+SB203580（5 mg/kg）組（LPZKD+SB203580 組），每組12 只，雌雄各半。剩余12 只對照小鼠設(shè)為對照（control）組。給藥時(shí)，SB203580 組小鼠按照10 mL/kg 的劑量灌胃生理鹽水，然后腹腔注射5 mg/kg 的SB203580；龍盤止咳方各劑量組按照10 mL/kg 的劑量灌胃相應(yīng)的藥物；龍盤止咳方+SB203580 組小鼠先按照10 mL/kg 的劑量灌胃10.4 g/kg 的龍盤止咳方，然后腹腔注射5 mg/kg 的SB203580；對照組和模型組灌胃和腹腔注射等體積的生理鹽水。每天1次，連續(xù)給藥1周。

劑量換算：給藥劑量按平均體質(zhì)量70 kg 成人的體表面積換算，小鼠體質(zhì)量按20 g 計(jì)，對應(yīng)給藥劑量為成人的9.1 倍；壯藥龍盤止咳方成人每日給藥劑量相當(dāng)于生藥40 g，則小鼠每日給藥劑量為5.2 g/kg，因此設(shè)置龍盤止咳方的低、高劑量分別為5.2 和10.4 g/kg。

3.2 小鼠一般狀態(tài)觀察及體質(zhì)量測定 觀察給藥前后各組小鼠的一般狀態(tài)變化，包括咳嗽、流涕、呼吸急促、活動(dòng)度、毛色等，并測定體質(zhì)量。

3.3 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中炎癥相關(guān)因子的測定 處死小鼠，放入75%乙醇中浸泡2 min，然后暴露氣管，行氣管插管，結(jié)扎右肺，用注射器將0.3 mL 的生理鹽水溶液緩慢注入左肺后回抽，重復(fù)以上過程3 次，合并3 次灌洗液（共計(jì)0.70 mL，回收率約為77.78%），紗布過濾去除黏液后離心（4 ℃、447×g離心10 min），取上清保存于-20 ℃冰箱。按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測各組小鼠BALF 中TNF-α、IL-1β 和IL-18水平。

3.4 肺組織病理學(xué)觀察 取出小鼠的肺組織，生理鹽水沖洗后，濾紙吸干表面水分；取右側(cè)肺組織，4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，連續(xù)切3 μm 薄片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯1 min，蒸餾水沖洗。蘇木精染色8 min，自來水沖去浮色，1%鹽酸酒精分色，伊紅染色5 min，自來水流水洗至無色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，根據(jù)肺泡腔或肺泡間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡間隔增寬、肺泡腔出血和肺泡壁厚度進(jìn)行病理學(xué)評分，按程度“無、輕、中、重”分別計(jì)“0、1、2、3 分”，取評分之和為肺損傷評分，評分越高，損傷越嚴(yán)重。每只小鼠肺切片任取5 個(gè)獨(dú)立區(qū)域進(jìn)行評分。

3.5 免疫組化法檢測肺組織NF-κB p65的表達(dá) 取3.4 石蠟包埋肺組織，切片；將切片于3% H2O2中在37 ℃下放置30 min 以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后在微波爐中用0.01 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)8 min，滴加Ⅰ抗（NF-κB p65，1∶100），4 ℃箱孵育過夜，加入Ⅱ抗（1∶300，生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG 聚合物）并在37 ℃下孵育40 min。室溫DAB染色2 min 后，蘇木精復(fù)染，室溫3 min。光學(xué)顯微鏡觀察NF-κB p65蛋白陽性表達(dá)，用Image-Pro Plus 6.0計(jì)算平均吸光度。

3.6 RT-qPCR 檢測肺組織NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β 的mRNA 水平 左側(cè)肺組織分為兩部分，一部分液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存，用于Western blot實(shí)驗(yàn)；另一部分用于RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。使用Trizol從各組肺組織中提取總RNA，按照試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系（20 μL）：cDNA（200 ng/μL）2 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，上、下游引物（序列見表1）各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，75 ℃延伸20 s，40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

建議：男性肝臟的承受能力是每天40克酒精，女性減半。一般40克酒精相當(dāng)于含酒精6度的啤酒1000毫升，含酒精12度的紅酒500毫升，含酒精度50度的白酒100毫升。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. RT-qPCR primer sequences

3.7 Western blot 檢測肺組織p38 MAPK/NF-κB/NLRP3 通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 取-80 ℃冰箱保存的肺組織，加入RIPA 裂解液研磨后，置于冰上，靜置后離心，提取上清液為總蛋白溶液，并采用CelLytic?NuCLEAR?提取試劑盒提取細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)。用BCA 法測量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品（每孔30 μg），在10% SDS-PAGE 凝膠上進(jìn)行電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，加入相應(yīng)Ⅰ抗（抗p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、NLRP3 和cleaved caspase-1 抗體按照1∶1 000 比例進(jìn)行稀釋，抗β-actin 和histone H3 抗體按1∶2 000 比例進(jìn)行稀釋）于4 ℃下孵育過夜，HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，隨后洗滌膜并使用Super ECL Plus 超靈敏發(fā)光溶液進(jìn)行顯色。使用Quantity One 4.6.2 軟件測量每個(gè)條帶的灰度。以目的蛋白灰度值與β-actin 或histone H3 灰度值的比值作為各目的蛋白的相對表達(dá)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0、GraphPad Prism 9.0 和Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間有差異進(jìn)一步采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 壯藥龍盤止咳方對小鼠一般狀態(tài)及體質(zhì)量的影響

對照組小鼠精神狀態(tài)良好，毛色順滑有光澤，較活躍，未出現(xiàn)咳嗽和氣喘等癥狀；模型組小鼠精神萎靡，倦怠，毛色暗淡無光澤，活動(dòng)減少，好聚集扎堆，出現(xiàn)咳嗽、流涕、呼吸急促等癥狀，且飲食減少，體質(zhì)量較對照組顯著降低（P＜0.05）；給藥后，與模型組相比，SB203580組和高、低劑量龍盤止咳方組小鼠狀態(tài)有不同程度的改善，活動(dòng)和飲食量增加，咳嗽、呼吸急促等癥狀減輕，體質(zhì)量有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；龍盤止咳方+SB203580 組小鼠一般狀態(tài)改善程度優(yōu)于SB203580 組和高劑量龍盤止咳方組。各組小鼠體質(zhì)量的變化見表2。

表2 各組小鼠給藥前后體質(zhì)量的變化Table 2. Changes in body mass of mice before and after administration（g. Mean±SD.n=12）

2 壯藥龍盤止咳方對小鼠BALF 中TNF-α、IL-1β和IL-18水平的影響

與對照組相比，模型組小鼠BALF 中TNF-α、IL-1β 和IL-18 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，SB203580 組和高、低劑量龍盤止咳方組小鼠BALF中TNF-α、IL-1β 和IL-18 水平顯著降低（P＜0.05）；與SB203580 組和高劑量龍盤止咳方組相比，龍盤止咳方+SB203580 組小鼠BALF 中上述炎癥因子水平顯著降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-18水平Table 3. The levels of TNF-α，IL-1β and IL-18 in BALF of mice in each group（ng/L. Mean±SD.n=12）

3 壯藥龍盤止咳方對小鼠肺組織病理損傷的影響

對照組小鼠肺內(nèi)各級支氣管結(jié)構(gòu)正常，上皮細(xì)胞排列整齊，無變性壞死等損傷性改變，支氣管黏膜未見充血、水腫，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡上皮細(xì)胞及肺間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔內(nèi)無滲出液，未見炎癥細(xì)胞浸潤；模型組小鼠可見支氣管壁增厚，管徑明顯變小，氣管和支氣管黏膜可見明顯的充血、水腫，管壁和管腔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤，肺組織有滲出液，肺泡間隔增寬、肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)和肺泡之間有炎癥細(xì)胞浸潤。與對照組（0.64±0.08）相比，模型組小鼠肺組織損傷評分（7.38±0.11）顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，SB203580 組（5.65±0.06）、高劑量龍盤止咳方組（5.49±0.08）和低劑量龍盤止咳方組（6.15±0.09）小鼠肺組織上述病理損傷有不同程度的改善，肺組織損傷評分顯著降低（P＜0.05）；與SB203580 組和高劑量龍盤止咳方組相比，龍盤止咳方+SB203580 組小鼠肺組織損傷評分（4.25±0.09）顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

Figure 1. Pathological changes of mouse lung tissues（HE staining，scale bar=50 μm）. A：control group；B：model group；C：SB203580 group；E：LPZKD-H group；D：LPZKD-L group；F：LPZKD+SB203580 group. The structure of the bronchus at all levels in the lungs of the control group mice was normal，and there was no obvious inflammatory cell infiltration. The alveolar walls were thickened，and there was inflammatory cell infiltration in the alveolar cavity and between the alveoli in the model group. The above-mentioned pathological damage of mouse lung tissues in SB203580 group，LPZKD-L group，LPZKD-H group and LPZKD+SB203580 group were attenuated to varying degrees.圖1 小鼠肺組織病理學(xué)變化

4 壯藥龍盤止咳方對小鼠肺組織NF-κB p65 蛋白陽性表達(dá)的影響

對照組小鼠肺組織部分細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色；模型組小鼠肺組織可見NF-κB p65呈強(qiáng)陽性表達(dá)，分布于支氣管黏膜上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞，且其陽性表達(dá)不僅分布在陽性細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，胞核中也呈陽性反應(yīng)，平均吸光度顯著高于對照組（P＜0.05）；與模型組相比，SB203580 組、高劑量龍盤止咳方組、低劑量龍盤止咳方組和龍盤止咳方+SB203580 組小鼠肺組織細(xì)胞核內(nèi)呈NF-κB p65 陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)顯著減少，平均吸光度顯著降低（P＜0.05）；且龍盤止咳方+SB203580 組NF-κB p65 核陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)較SB203580 組和高劑量龍盤止咳方組顯著減少，平均吸光度顯著降低（P＜0.05），見圖2、表4。

表4 各組小鼠肺組織NF-κB p65陽性表達(dá)的平均吸光度Table 4. Average absorbance of NF-κB p65 positive expression in lung tissues of the mice in each group（Mean±SD.n=12）

Figure 2. Positive expression of NF-κB p65 in mouse lung tissues（IHC staining，scale bar=50 μm）. A：control group；B：model group；C：SB203580 group；E：LPZKD-H group；D：LPZKD-L group；F：LPZKD+SB203580 group. Brown-yellow was positive expression. Part of the cytoplasm of the lung tissue in the control group was brownish yellow，while the lung tissue in the model group showed strong positive expression of NF-κB p65. The positive expression of NF-κB p65 in the nucleus of mouse lung tissues in SB203580 group，LPZKD-L group，LPZKD-H group and LPZKD+SB203580 group decreased.圖2 小鼠肺組織NF-κB p65陽性表達(dá)

5 壯藥龍盤止咳方對小鼠肺組織NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β mRNA水平的影響

表5 各組小鼠肺組織中NLRP3、IL-1β、ASC和caspase-1的mRNA表達(dá)水平Table 5. The mRNA expression levels of NLRP3，IL-1β，ASC and caspase-1 in mouse lung tissues of each group（Mean±SD.n=12）

6 壯藥龍盤止咳方對小鼠肺組織p38 MAPK/NFκB/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，模型組小鼠肺組織中p-p38 MAPK/p38 MAPK、胞核NF- κB p65、NLRP3 和cleaved caspase-1 的蛋白水平顯著升高，胞質(zhì)NF-κB p65 蛋白水平達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，SB203580 組和高、低劑量龍盤止咳方組小鼠肺組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、胞核NF-κB p65、NLRP3 和cleaved caspase-1 蛋白水平顯著降低，胞質(zhì)NF-κB p65 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與SB203580 組和高劑量龍盤止咳方組相比，龍盤止咳方+SB203580組小鼠肺組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、胞核NF-κB p65、NLRP3 和cleaved caspase-1 蛋白水平顯著降低，胞質(zhì)NF-κB p65 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖3、表6。

表6 各組小鼠肺組織p38 MAPK/NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Table 6. The expression of p38 MAPK/NF-κB/NLRP3 pathway-related proteins in the lung tissue of the mice in each group（Mean±SD.n=12）

Figure 3. The expression of p38 MAPK/NF-κB/NLRP3 pathway-related proteins in mouse lung tissues. A：control group；B：model group；C：SB203580 group；E：LPZKD-H group；D：LPZKD-L group；F：LPZKD+SB203580 group.圖3 小鼠肺組織p38 MAPK/NF-κB/NLRP3通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

討論

目前大多數(shù)患者都意識到了抗生素的耐藥性，熱衷于嘗試替代療法，包括中草藥。中草藥被廣泛用于治療急性支氣管炎，在英國，許多患者認(rèn)為中草藥比抗生素“侵入性小”，并且愿意服用［15］，說明中草藥在急性支氣管炎的治療中被越來越多的人認(rèn)可和接受。

急性支氣管炎屬于壯醫(yī)“奔唉”范疇，病位在肺，常涉及脾、腎，發(fā)病機(jī)理為外毒侵襲，阻滯于氣道，使氣道不通或者臟腑功能失調(diào)，肺失宣降，肺氣上逆。應(yīng)以疏風(fēng)清熱、宣肺止咳為主要法則。壯藥龍盤止咳方選用道地壯藥組方，方中龍脷葉，善宣肺止咳；柿葉，肅肺止咳，兩藥合用具通氣道，調(diào)龍路之功；魚腥草，清熱解毒、消癰排膿，為“治痰熱壅肺，發(fā)為肺癰吐膿血之要藥”，與龍脷葉同為主藥；不出林，理氣化痰，主治咳嗽、咳血，與柿葉同為幫藥；四藥共為母藥，具有解毒的功效［5］。現(xiàn)代藥理研究表明，龍脷葉水提物可通過降低炎性因子水平，減輕哮喘模型大鼠肺組織與支氣管炎性病理改變［16-17］；柿葉具有抗炎、抗氧化和保護(hù)心腦血管的作用［18-19］，并可作為一種潛在的化學(xué)治療劑用于肺癌早期轉(zhuǎn)移［18］；魚腥草，可通過抗病反應(yīng)、免疫反應(yīng)和生物刺激反應(yīng)等發(fā)揮治療支氣管炎的作用，還對肺炎支原體感染小鼠起抗感染作用［20-21］；甘草可通過促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖、影響體內(nèi)細(xì)胞因子和抗體水平以及調(diào)控相關(guān)酶表達(dá)等增強(qiáng)免疫［22］。以上諸藥合用共奏清宣肺氣、化痰止咳、補(bǔ)虛扶正之功；并且所選壯藥大多具有較強(qiáng)的抗菌抗病毒作用。本研究結(jié)果顯示，急性支氣管炎小鼠經(jīng)壯藥龍盤止咳方治療后，小鼠咳嗽、流涕和呼吸急促等癥狀明顯改善，BALF 中炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-18 水平顯著降低，肺部病理損傷改善顯著，且高劑量組治療效果優(yōu)于低劑量組，提示壯藥龍盤止咳方可減輕急性支氣管炎小鼠的肺部炎癥，對急性支氣管炎具有一定的治療作用。

NLRP3 炎癥小體是由NLRP3、ASC 和pro-caspase-1 形成的多蛋白復(fù)合物，其中NLRP3 是NLRP3炎癥小體的活性核心，它在許多細(xì)胞中都有表達(dá)，包括先天免疫細(xì)胞［23］和肺支氣管上皮細(xì)胞［24］。已有研究證實(shí)NLRP3炎癥小體在呼吸道感染及肺部疾病中被激活，隨后pro-caspase-1 會裂解為具有活性的cleaved caspase-1 p10/p20，進(jìn)而將pro-IL-1β 和pro-IL-18 分別裂解為成熟的IL-1β 和IL-18［25］。因此，NLRP3 蛋白表達(dá)和IL-1β 水平常被用于監(jiān)測NLRP3炎癥小體的活化。在病毒感染和肺損傷過程中，NLRP3 炎癥小體通路非常關(guān)鍵；靶向阻斷NLRP3 炎癥小體的激活，是控制肺移植后閉塞性細(xì)支氣管炎的一個(gè)有前景的策略［7］。因此，我們進(jìn)行了一些研究，以探討壯藥龍盤止咳方對這些促炎因子及支氣管炎的影響是否與NLRP3 炎癥小體有關(guān)。結(jié)果顯示，在急性支氣管炎小鼠模型中肺組織NLRP3、IL-1β、ASC 和caspase-1的mRNA 表達(dá)水平顯著升高，而經(jīng)壯藥龍盤止咳方干預(yù)后上述指標(biāo)的表達(dá)水平降低，提示壯藥龍盤止咳方對急性支氣管炎的治療作用與抑制NLRP3炎癥小體活化有關(guān)。

本研究還觀察到，在急性支氣管炎小鼠模型中肺組織NF-κB p65 呈強(qiáng)陽性表達(dá)，且NF-κB p65 在胞核中的表達(dá)水平高于胞質(zhì)，而NF-κB p65從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)至胞核，可通過轉(zhuǎn)錄翻譯促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)；經(jīng)壯藥龍盤止咳方干預(yù)后NF-κB p65的入核作用被抑制，且NF-κB 與NLRP3 炎癥小體呈正相關(guān)，是NLRP3 炎癥小體激活的重要因素［8］，提示壯藥龍盤止咳方可能通過抑制NF-κB p65 的核移位，進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體活化。p38 是MAPK 家族控制炎癥反應(yīng)最重要的成員，NF-κB 是p38 MAPK 的下游信號分子，p38 MAPK 信號通路可以促進(jìn)IκBα 的磷酸化和降解，進(jìn)而激活NF-κB 通路［26］；抑制p38 MAPK 可抑制NF-κB 的活性進(jìn)而抑制LPS 誘導(dǎo)的促炎介質(zhì)如TNFα、IL-6和IL-1β 等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕肺部病理損傷［9，27］。本研究結(jié)果顯示，壯藥龍盤止咳方可降低肺組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、胞核NF-κB p65、NLRP3 和cleaved caspase-1 的蛋白水平，增加胞質(zhì)NF-κB p65 的蛋白水平，抑制p38 MAPK 信號通路的激活，且壯藥龍盤止咳方和p38 MAPK特異性抑制劑SB203580 聯(lián)合應(yīng)用對p38 MAPK/NF-κB/NLRP3 通路及急性支氣管炎小鼠肺部炎癥的抑制作用均優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用，說明壯藥龍盤止咳方對肺部炎癥的保護(hù)作用可能與抑制p38 MAPK 的活化有關(guān)。這表明壯藥龍盤止咳方可能通過抑制p38 MAPK/NF-κB/NLRP3通路的激活，減少肺部炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而減輕急性支氣管炎小鼠肺損傷。

綜上所述，壯藥龍盤止咳方可減少肺部炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，減輕急性支氣管炎小鼠肺損傷，其作用機(jī)制可能與抑制p38 MAPK/NF-κB/NLRP3 通路的激活有關(guān)。本研究僅從炎癥反應(yīng)的角度初步探討了壯藥龍盤止咳方對急性支氣管炎的保護(hù)機(jī)制，其發(fā)揮治療作用的具體機(jī)制是否與機(jī)體免疫有關(guān)，仍需進(jìn)一步研究。