陳 爽， 王 宸， 馬曉嬌， 邱紅梅

（重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，藥物代謝研究重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016）

膠質(zhì)瘤（glioma）是一種起源于神經(jīng)外胚層部位的腦腫瘤，屬于人類惡性程度最高的腫瘤之一，具有生長(zhǎng)迅速、與正常腦組織無(wú)明顯界限、并向周圍組織浸潤(rùn)的特點(diǎn)，復(fù)發(fā)率和死亡率極高［1］。目前膠質(zhì)瘤的治療方法主要有手術(shù)切除，術(shù)后輔以放療和化療，但因其浸潤(rùn)性生長(zhǎng)手術(shù)難以根除，且常規(guī)化療藥物通常伴隨嚴(yán)重毒副作用，導(dǎo)致患者預(yù)后極差，中位生存期僅有一年左右，臨床上尚無(wú)確切有效的治療手段［2］。傳統(tǒng)中醫(yī)藥是我國(guó)的醫(yī)藥文化瑰寶，尤其近年來(lái)隨著紫杉醇［3］和人參皂苷［4］等天然抗腫瘤單體藥物的發(fā)現(xiàn)，使中藥單體的抗癌作用逐漸被廣泛重視并成為研究熱點(diǎn)。

冬凌草甲素（oridonin，ORI）是從冬凌草中分離出來(lái)的一種貝殼杉烷型四環(huán)二萜類化合物，具有很好的抗炎、抗菌、抗感染和清除活性氧自由基等功效。此外，ORI 對(duì)多種腫瘤細(xì)胞株也具有較好的抗癌活性，可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡并抑制其增殖遷移［5］，增強(qiáng)人結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)氟尿嘧啶的敏感性并促進(jìn)其凋亡［6］，誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生周期阻滯和凋亡［7］，然而有關(guān)ORI對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤作用研究較少且其機(jī)制尚不十分明確。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription-3，STAT-3）作為Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/STAT-3信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子之一，研究證實(shí)它的過(guò)度激活與膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)侵襲密切相關(guān)，下調(diào)STAT-3 可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移，并誘導(dǎo)凋亡［8］。突觸足蛋白2（synaptopodin-2，SYNPO-2）是一種已知的抑癌因子，可參與細(xì)胞骨架及肌動(dòng)蛋白束的形成，在體內(nèi)外均可抑制腫瘤的生長(zhǎng)。Abkhezr 等［9］報(bào)道，使用小分子抑制劑Stattic 或siRNA 抑制STAT-3 表達(dá)可直接導(dǎo)致synaptopodin 的mRNA 和蛋白表達(dá)改變。而ORI 的抗膠質(zhì)瘤作用是否與它對(duì)STAT-3/SYNPO-2信號(hào)通路的調(diào)控有關(guān)，目前未見(jiàn)報(bào)道。

本項(xiàng)工作以人源惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG 為研究對(duì)象，探討ORI 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用，并采用STAT-3磷酸化激動(dòng)劑白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和抑制劑Stattic 探究其可能機(jī)制是否涉及STAT-3/SYNPO-2通路。

材 料 和 方 法

1 材料

人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG 購(gòu)自American Type Culture Collection（ATCC）；ORI 購(gòu)自TargetMol，批號(hào)T3001-1，純度99.7%；BCA 蛋白定量試劑盒和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；胰酶、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和DMEM高糖培養(yǎng)液均購(gòu)自重慶塞米克生物有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購(gòu)自上海Bimake；超敏顯影液和細(xì)胞凋亡試劑盒均購(gòu)自碧云天生物有限公司；α-tublin、STAT-3、SYNPO-2和Bax 抗體均購(gòu)自Proteintech；p-STAT-3（Tyr705）抗體購(gòu)自Affinity；Bcl-2 抗體購(gòu)于GeneTex；STAT-3 磷酸化抑制劑Stattic 購(gòu)自MedChemExpress；IL-6 購(gòu)自武漢三鷹生物有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人源神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG 細(xì)胞株置于孵箱，用添加含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，孵育條件：恒溫37 ℃，5%CO2。全部實(shí)驗(yàn)均取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行操作。

2.2 ORI干預(yù) 將ORI干粉（純度為99.7%）溶解于DMSO 配制成0.01 mol/L 終濃度，用0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌，避光存于-20 ℃，使用時(shí)用完全培養(yǎng)液梯度稀釋成所需濃度。根據(jù)文獻(xiàn)［10］及前期的濃度篩選，實(shí)驗(yàn)組分別加入2.5、5、7.5、10和12.5 μmol/L的ORI，對(duì)照組加入與最高濃度組相同體積的DMSO，空白組加入等體積完全培養(yǎng)液。

2.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U87MG 細(xì)胞接種于96 孔板中（每孔5×103個(gè)），每孔100 μL細(xì)胞懸液，移入孵箱過(guò)夜培養(yǎng)。吸棄舊液，換用不同濃度（2.5、5、7.5、10 和12.5 μmol/L）的ORI繼續(xù)處理，每組6 個(gè)復(fù)孔，作用24 h 和48 h 后，棄舊培養(yǎng)液，每孔加入含10%CCK-8的培養(yǎng)液100 μL（避光操作），繼續(xù)孵育2～3 h 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各孔的吸光度（A）。藥物對(duì)U87MG 細(xì)胞活力的抑制率（%）=［1-（實(shí)驗(yàn)給藥組A值-空白組A值）/（陰性對(duì)照組A值-空白組A值）］×100%。

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87MG 細(xì)胞接種于6 孔板，觀察融合至80%～90%時(shí)，將移液槍頭垂直于孔板進(jìn)行平穩(wěn)豎直劃線，棄舊培養(yǎng)液，用PBS 輕洗2 次?？瞻捉M加入無(wú)血清培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入無(wú)血清培養(yǎng)液配制的不同濃度（0、5、7.5 和10 μmol/L）ORI，置于孵箱培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察大約同一位置，不同時(shí)點(diǎn)（0 h、12 h、24 h、36 h和48 h）的劃痕愈合狀態(tài)，并拍攝圖像，使用ImageJ 軟件計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率（%）=（剛劃痕時(shí)劃痕面積-培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)劃痕面積）/剛劃痕時(shí)劃痕面積×100%。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87MG 細(xì)胞接種于6 孔板（每孔5×105個(gè)），置于孵箱過(guò)夜培養(yǎng)，棄舊培養(yǎng)液，用不同濃度（0、5、7.5 和10 μmol/L）的ORI 處理U87MG 細(xì)胞48 h 后收集各組細(xì)胞，PBS 洗滌2 次后，12 000×g離心5 min，離心2 次，棄上清，先后加入annexin V-FITC和碘化丙啶染色液進(jìn)行室溫避光染色（染色步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作），20 min 后冰浴終止染色，于40 min 內(nèi)進(jìn)行流式上機(jī)測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

2.6 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87MG 細(xì)胞接種于10 cm 培養(yǎng)皿中，觀察長(zhǎng)至60%左右時(shí)，分別用不同濃度ORI處理48 h后收集各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，并用BCA蛋白定量檢測(cè)樣品濃度（按說(shuō)明書(shū)步驟操作），加上樣緩沖液煮沸變性存于-80 ℃。SDS-PAGE分離，冰浴轉(zhuǎn)膜，再按照常規(guī)方法，5%BSA 室溫封閉2 h 后，依次加入Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜、Ⅱ抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后，加入ECL 發(fā)光液在凝膠成像儀上顯影成像，用Image Lab 4.1軟件分析條帶灰度值。以目的蛋白與α-tublin條帶灰度值之比表示相應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。使用GraphPad Prism 8.0 軟件作圖。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 ORI對(duì)U87MG細(xì)胞活力的影響

用不同濃度的ORI（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1A）干預(yù)U87MG細(xì)胞24 和48 h，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，各組細(xì)胞的活力均受到顯著抑制，且抑制率呈濃度和時(shí)間依賴性增高（P＜0.01），相應(yīng)的細(xì)胞形態(tài)亦發(fā)生變化，見(jiàn)圖1B、C。采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析得出ORI 作用24 和48 h 的IC50均介于5～10 μmol/L，且作用48 h的效果更加顯著，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用5、7.5 和10 μmol/L 作用48 h 作為給藥組，以加入最高濃度相同體積DMSO處理的U87MG細(xì)胞作為對(duì)照組。

Figure 1. The effect of oridonin（ORI）on the viability of U87MG cells. A：the chemical structure of ORI；B：the effect of ORI at different concentrations for 24 and 48 h on the viability of U87MG cells was detected by CCK-8 assay；C：as the concentration of ORI increased，the number of U87MG cells gradually decreased，and the cells become round and shiny，dying and floating in the culture medium（scale bar=100 μm）. Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01vs control group.圖1 冬凌草甲素對(duì)U87MG細(xì)胞活力的影響

2 ORI對(duì)U87MG細(xì)胞遷移能力的影響

遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，5、7.5 和10 μmol/L 的ORI 可顯著抑制U87MG 細(xì)胞的遷移，且藥物濃度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞遷移速率降低越顯著（P＜0.01），見(jiàn)圖2。其中7.5 和10 μmol/L 的ORI對(duì)應(yīng)的抑制效果更為顯著。

Figure 2. The effect of oridonin（ORI）on the migration of U87MG cells. The migration of U87MG cells treated with different concentrations of ORI for different time was measured by scratch test（scale bar=100 μm）. Mean±SD.n=5.**P＜0.01vs 0 μmol/L group.圖2 冬凌草甲素對(duì)U87MG細(xì)胞遷移的影響

3 ORI對(duì)U87MG細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，5、7.5 和10 μmol/L 的ORI 組細(xì)胞凋亡率均顯著增高（P＜0.01），見(jiàn)圖3。因此選用中間濃度7.5 μmol/L 作為后續(xù)ORI組。

Figure 3. The effect of oridonin（ORI）on the apoptosis of U87MG cells. Mean±SD.n=3.**P＜0.01vs 0 μmol/L group.圖3 冬凌草甲素對(duì)U87MG細(xì)胞凋亡的影響

4 ORI對(duì)U87MG細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，ORI（7.5 μmol/L）組Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，Bax蛋白表達(dá)增高（P＜0.01），而STAT-3磷酸化激動(dòng)劑IL-6（20 μg/L）組Bcl-2 蛋白表達(dá)增高，Bax 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與ORI組比較，合用IL-6 后，Bcl-2 蛋白表達(dá)顯著增高，Bax 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01），提示ORI 對(duì)U87MG 細(xì)胞的促凋亡作用被IL-6 逆轉(zhuǎn)；而加入STAT3 磷酸化拮抗劑Stattic（3 μmol/L）的作用與前面相反，它可以協(xié)同增強(qiáng)ORI 的促凋亡效應(yīng)（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

Figure 4. The effect of oridonin（ORI）on the protein expression of Bcl-2 and Bax in U87MG cells. A：the protein expression of Bcl-2 and Bax in U87MG cells treated with IL-6（20 μg/L）or/and ORI（7.5 μmol/L）for 48 h；B：the protein expression of Bcl-2 and Bax in U87MG cells treated with Stattic（3 μmol/L）or/and ORI（7.5 μmol/L）for 48 h. Mean±SD.n=3.**P＜0.01vs control group；##P＜0.01vs ORI group.圖4 冬凌草甲素對(duì)U87MG細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

5 ORI 對(duì)U87MG 細(xì)胞STAT-3/SYNPO-2 通路的影響

與對(duì)照組比較，ORI（7.5 μmol/L）組p-STAT-3 蛋白水平顯著降低，SYNPO-2 蛋白表達(dá)顯著增高，STAT-3 蛋白含量無(wú)顯著變化，即STAT-3/SYNPO-2通路被抑制（P＜0.01），而IL-6（20 μg/L）組STAT-3/SYNPO-2 通路被激活（P＜0.01）；合用IL-6 后，與ORI組比較，STAT-3 磷酸化水平顯著升高，SYNPO-2 蛋白表達(dá)顯著降低，STAT-3蛋白含量基本不變，ORI對(duì)STAT-3/SYNPO-2 通路的抑制作用被IL-6 逆轉(zhuǎn)（P＜0.01）；另一方面，給予STAT-3 磷酸化抑制劑Stattic（3 μmol/L）則可協(xié)同ORI 的作用，二者共同抑制STAT-3/SYNPO-2通路（P＜0.01），見(jiàn)圖5。

Figure 5. The effect of oridonin（ORI）on STAT-3/SYNPO-2 signaling pathway in U87MG cells. A：the protein expression of STAT-3 and SYNPO-2 in U87MG cells treated with IL-6（20 μg/L）or/and ORI（7.5 μmol/L）for 48 h；B：the protein expression of STAT-3 and SYNPO-2 in U87MG cells treated with Stattic（3 μmol/L）or/and ORI（7.5 μmol/L）for 48 h. Mean±SD.n=3.**P＜0.01vs control group；##P＜0.01vs ORI group.圖5 冬凌草甲素對(duì)U87MG細(xì)胞STAT-3/SYNPO-2信號(hào)通路的影響

討論

膠質(zhì)瘤是所有顱內(nèi)腫瘤中最具侵襲性的實(shí)體瘤之一，由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、常規(guī)化療藥物毒性作用大且腫瘤細(xì)胞極易產(chǎn)生耐藥性，均對(duì)其治療和預(yù)后帶來(lái)困難。天然來(lái)源的中藥單體及其復(fù)合物因具有取材方便、價(jià)格低廉、高效低毒等特點(diǎn)，目前已成為抗惡性腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。冬凌草，也稱“延命草”，是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥之一。ORI 是冬凌草的主要活性成分，具有作用靶點(diǎn)眾多、抗癌作用廣泛的特點(diǎn)，對(duì)肝癌、肺癌、胃癌、宮頸癌和乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞均能產(chǎn)生明顯的抑制或殺傷作用［11］。近期研究顯示，ORI 可增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放療敏感性并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［12］，提示其可能在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預(yù)防和治療方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。因此，本研究采用ORI 作用于人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG，探討ORI對(duì)U87MG 細(xì)胞活力、遷移和凋亡的影響，以及其抗惡性膠質(zhì)瘤的作用及機(jī)制，為ORI 臨床抗惡性膠質(zhì)瘤應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

細(xì)胞凋亡是機(jī)體細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的一種由基因嚴(yán)格控制的自主的、有序的死亡過(guò)程，涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控，許多天然抗腫瘤藥物皆可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮其抗癌活性［13-14］。本研究結(jié)果顯示，5、7.5 和10 μmol/L 的ORI作用于惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG 后，可濃度和時(shí)間依賴性地顯著抑制其活力和遷移能力，提示ORI 對(duì)U87MG細(xì)胞具有一定的殺傷作用。流式細(xì)胞術(shù)及蛋白分析顯示，ORI在提高U87MG細(xì)胞凋亡率的同時(shí)，細(xì)胞中的抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)顯著降低，促凋亡蛋白Bax表達(dá)顯著增高；采用STAT-3磷酸化激動(dòng)劑IL-6干預(yù)后結(jié)果顯示，與ORI組相比，IL-6+ORI組U87MG細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增高，Bax蛋白表達(dá)顯著降低，提示IL-6 可顯著抑制ORI 對(duì)U87MG 細(xì)胞的促凋亡作用；而STAT-3磷酸化抑制劑Stattic卻發(fā)揮與ORI一致的效應(yīng)，并協(xié)同促進(jìn)U87MG 細(xì)胞的凋亡。上述結(jié)果提示ORI 可顯著促進(jìn)U87MG 細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制與STAT-3相關(guān)通路抑制有密切聯(lián)系。

JAK/STAT-3信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和免疫等方面的關(guān)鍵通路。近年研究表明，STAT-3同時(shí)也是人表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、IL-6和Src等多個(gè)致癌性酪氨酸激酶信號(hào)通道匯集的焦點(diǎn)，活化的STAT-3 可通過(guò)調(diào)控下游增殖（Myc和cyclin D1/D2）、凋亡（Bcl-2、Bax和p53）、侵襲遷移（MMP-3、9）及血管生成（VEGF 和HIFE）等關(guān)鍵靶蛋白的表達(dá)從而表現(xiàn)出致癌作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移以及藥物耐受起著尤為重要的作用［15-16］。SYNPO-2 是一種已知的腫瘤抑制因子，作為STAT-3的下游信號(hào)分子，其表達(dá)缺失和遺傳改變參與了多種侵襲性癌癥的高復(fù)發(fā)率和預(yù)后不良［17］。有研究表明，STAT-3 信號(hào)通路與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)及化療耐藥都有密切關(guān)系［18］，但STAT3/SYNPO-2 通路活化異常否參與了惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展，以及ORI 的抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤作用是否與此通路有關(guān)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，ORI 可以顯著降低U87MG 細(xì)胞中STAT-3 蛋白Tyr705 位點(diǎn)的磷酸化水平，并升高其下游SYNPO-2 蛋白表達(dá)；采用STAT-3 磷酸化激動(dòng)劑IL-6 干預(yù)后結(jié)果顯示，與ORI組相比，IL-6+ORI 組U87MG 細(xì)胞中STAT-3 蛋白Tyr705位點(diǎn)磷酸化水平顯著增高，SYNPO-2蛋白表達(dá)顯著降低；而STAT-3 磷酸化抑制劑Stattic 卻發(fā)揮與ORI 一致的效應(yīng)，并協(xié)同降低STAT-3 蛋白Tyr705 磷酸化水平，且進(jìn)一步促進(jìn)SYNPO-2 蛋白表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ORI 誘導(dǎo)U87MG 細(xì)胞凋亡與抑制STAT-3/SYNPO-2通路活化有密切聯(lián)系。

綜上所述，我們的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ORI可濃度和時(shí)間依賴性地顯著抑制惡性膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞的增殖、遷移并促進(jìn)其凋亡，其促凋亡機(jī)制可能與抑制STAT-3/SYNPO-2 信號(hào)通路，即抑制STAT-3蛋白Tyr705 位點(diǎn)磷酸化，繼而增高SYNPO-2 蛋白表達(dá)相關(guān)。本研究為探討惡性膠質(zhì)瘤病理生理機(jī)制、ORI 的臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化及惡性膠質(zhì)瘤的治療靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)提供了一定的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

【致謝：本實(shí)驗(yàn)在重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和藥物代謝研究重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，特此致謝！】