鄭夢琪，曹津橋，劉瑞琪，曾 晴，莫億偉，吳齊仟

(1 紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江紹興，312000；2 廣西壯族自治區(qū)融安縣金桔研究所，廣西融安，545400)

融安金桔(金柑)是廣西融安名優(yōu)水果，近年在春夏交接溫暖多雨季節(jié)，發(fā)現(xiàn)新梢感染一種真菌病害，導(dǎo)致葉片霉變受損、形成黑色病斑，嚴重時新梢枯萎脫落，病因未見報道。引起柑桔枝條或葉片出現(xiàn)黑色斑點的主要有青霉病、綠霉病等[1-2]，但融安金桔新梢感病癥狀與青霉病、綠霉病等有明顯不同，因此其致病菌種類還有待于深入探究。咪唑類殺菌劑咪鮮胺乳油(施?？?對青霉病、蒂腐病和炭疽病等均有較好的防治效果[3]，推測咪鮮胺也可能對防治融安金桔新梢上新發(fā)生的真菌病害有潛在價值。在多種致病真菌中，毛霉廣泛腐生在土壤、動物糞便和動植物殘體上[4]，致腐毛霉會使采摘后果蔬發(fā)病，導(dǎo)致貯藏期縮短，造成腐爛[5-7]，比如：草莓感染致腐毛霉后會加速果實腐爛并成為優(yōu)勢菌群[8]。從融安金桔新梢葉片霉變病癥狀來看，其致病菌有可能與毛霉有關(guān)，為探明病原及其生物學(xué)特性等，筆者開展了本研究。

1 材料與方法

1.1 病原菌純化及其致病性鑒定于2019年3月25日從廣西融安縣金桔基地采集發(fā)病新梢，參考陳瑤等[9]的方法，切取新梢葉片病變和健康交接處組織，先用75%乙醇表面消毒1 min，再用1.0%NaClO溶液消毒5 min，最后用無菌水沖洗3次，晾干置于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃條件下黑暗培養(yǎng)，對具有典型特征的菌落多次純化。將純化后的菌種培養(yǎng)4 d后，用無菌水將孢子洗脫，將孢子濃度調(diào)整為105個/mL，用鋼針刺傷發(fā)芽后10 d的健康新梢幼嫩葉片，將孢子懸液涂抹于刺傷部位，再用無菌塑料袋包裹，觀察葉片發(fā)病情況，從發(fā)病葉片分離純化菌種，判斷其是否與原來接種的菌種一致。

1.2 病原菌和可能宿主鑒定病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)，記錄生長菌絲的顏色和形態(tài)特征[10]，再顯微觀察菌絲體和孢子形態(tài)。挑取培養(yǎng)3 d后菌落邊緣的菌絲0.5 g，利用北京天根公司生產(chǎn)的真菌DNA基因組試劑盒提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，采用引物ITS5：F5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’和ITS4：R 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，參考周雪芳等[11]和莫億偉等[12]的方法擴增真菌28S rDNA的ITS區(qū)域(ITS1、5.8S、ITS2)。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后拍照。將PCR產(chǎn)物送到上海生工公司測序，所得序列輸入GenBank，以Blast程序與已有序列比對，相似性達98%以上時，可確定為某一類微生物。用MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用于分析致病菌的親緣關(guān)系。

1.3 病原菌生物學(xué)特性分析參考張潤光等[13]方法進行，將病原菌100 μL孢子懸浮液(濃度為105個/mL)接種到PDA培養(yǎng)基上，分別放在20、25、30、35和40 ℃的條件下黑暗培養(yǎng)，以確定最適生長溫度。將病原菌接種到pH值為4、5、7、9、11的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以確定最適pH值。將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基后，進行連續(xù)光照和黑暗兩種處理，以確定光照對菌絲生長的影響。以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別用等質(zhì)量麥芽糖、D-果糖、半乳糖、木聚糖、葡萄糖、可溶性淀粉和山梨醇代替蔗糖為碳源進行培養(yǎng)，以確定最適碳源。以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別用等質(zhì)量牛肉浸出膏、蛋白胨、甘氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、尿素、NaNO3和NH4NO3為氮源進行培養(yǎng)，以確定最適氮源。以上幾種處理均在28 ℃黑暗培養(yǎng)。在培養(yǎng)第4天時，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4 咪鮮胺錳鹽和硼酸抑菌試驗在PDA培養(yǎng)基上分別加入0.10%和0.20%咪鮮胺錳鹽(由江蘇省蘇州富美實植物保護劑有限公司生產(chǎn)50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑配制，以有效成分計)，0.05%、0.10%和0.20%硼酸，以空白為對照，然后接種菌株，28 ℃黑暗培養(yǎng)4 d，每天用十字交叉法測量菌落直徑。參考莫億偉等[12]的方法，用菌落直徑來表示藥劑處理的抑菌能力，菌落直徑越小抑菌效果越強。

1.5 硼酸對細胞膜損傷試驗碘化丙啶(Propidium iodide，PI)能透過受損的細胞膜與細胞內(nèi)DNA結(jié)合，DNA含量越高，PI熒光強度越強，而PI無法進入細胞膜完整的細胞，所以活細胞基本不能染色[14]?；谝志囼灲Y(jié)果，在PDA內(nèi)分別添加0%和0.1%硼酸后，接種菌株，28 ℃黑暗培養(yǎng)4 d，然后用鑷子挑取菌落邊緣的部分菌絲及孢子，參考Lai等[15]的方法用10.0 μg/mL PI進行染色，用熒光顯微鏡觀察菌絲和孢子的染色情況，染色越深則表明細胞膜完整性越差。

1.6 數(shù)據(jù)分析所有試驗至少重復(fù)3次，用平均值±標準差表示結(jié)果。用SPSS 14.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，用鄧肯氏新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離純化及形態(tài)學(xué)鑒定在溫暖多雨的初春季節(jié)，田間金桔發(fā)病新梢及幼嫩葉片發(fā)霉、變黑，最終枯萎脫落(圖1a)，健康新梢葉片通過刺傷法接種分離純化菌株8 d后得到相似的發(fā)病癥狀(圖1b)。純化后的病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落呈圓形，氣生菌絲絨狀，菌落邊緣呈灰色、中間部分由于產(chǎn)生分生孢子而呈黑色，無貼壁生長特性(圖1c)。菌絲有橫隔，呈分枝狀(圖1d)。分生孢子呈短棒狀或桿狀，兩頭圓或一端稍尖(圖1e)。經(jīng)PCR擴增得到的rDNA-ITS序列目的片段大小為558 bp(圖1f，g)，在NCBI數(shù)據(jù)庫利用BLAST進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Mucorcircinelloides(登錄號MH854658)的同源性為99%。根據(jù)BLAST比對結(jié)果，利用MEGA X軟件構(gòu)建N-J法系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1h)可知，與純化菌株JinJu-01親緣關(guān)系較近的均為毛霉，其中親緣關(guān)系較近的有6株菌株，分別為MucorcircinelloidesLZ38(登錄號MN533750.1)、MucorlusitanicusCBS 108.17(MH854658.1)、MucorcircinelloidesLZ44(MN533755.1)、Mucorsp. 21IN02(JX270569.1 )、Mucorsp. JJP-2009(FJ210526.1)、MucorlusitanicusCBS 852.71(MF495058.1)。菌株JinJu-01與上述6株菌株的親緣關(guān)系置信率高達96%，再結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，鑒定該病原菌(JinJu-01)為毛霉屬Mucorsp.。

注：a. 新梢感病癥狀；b. 重新接種后新梢的感病癥狀；c.菌落形態(tài)；d.菌絲形態(tài)(標尺為200 μm)；e.分生孢子形態(tài)(標尺為50 μm)；f. ITS區(qū)PCR 擴增電泳(M：DL2000 Marker；1～4為菌株); g. PCR產(chǎn)物測序結(jié)果; h.系統(tǒng)發(fā)育樹。圖1 融安金桔新梢霉變癥狀及其致病菌的分離純化和鑒定

2.2 病原菌生物學(xué)特性培養(yǎng)4 d發(fā)現(xiàn)，菌落在15～35 ℃的溫度下均可生長，但在10和40 ℃的條件下菌落均無法生長。菌落可生長不同溫度下的菌落直徑排序為25 ℃(35.75 mm)>20 ℃(28.67 mm)>30 ℃(21.32 mm)>15 ℃(15.56 mm)>35 ℃(9.25 mm)，相互間差異有顯著性(p<0.05)。說明，25 ℃左右是菌絲生長最適溫度，與田間金桔新梢發(fā)病的溫度吻合，而過低或過高的溫度均不利于菌絲生長。

培養(yǎng)4 d發(fā)現(xiàn)，該菌對pH值的適應(yīng)范圍比較廣，在pH值4～11的條件下菌落均能生長，生長最適宜pH值為8～9(見圖2)。

注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。圖3、圖4和圖5同。圖2 pH值對融安金桔新梢霉變致病菌Mucor sp.菌絲生長的影響

培養(yǎng)4 d，菌落在黑暗和連續(xù)光照下均可生長。黑暗下的菌落直徑為34.69 mm，連續(xù)光照的菌落直徑(15.66 mm)僅為黑暗下的45.14%，兩者差異顯著(p<0.05)。說明，連續(xù)光照對菌落生長有顯著抑制作用。

培養(yǎng)4 d發(fā)現(xiàn)，菌落在8種碳源培養(yǎng)基上都能生長。以麥芽糖為碳源的菌落直徑最大，其次是D-果糖和淀粉，直徑分別為麥芽糖的87.78%和71.93%，相互間差異顯著(p<0.05)。以山梨醇為碳源的生長速度較慢，菌落直徑僅為麥芽糖培養(yǎng)基的43.41%。在無碳源培養(yǎng)基上，也能緩慢生長，菌落直徑最小，僅為麥芽糖培養(yǎng)基的26.86%，說明菌株可利用其他物質(zhì)來代替碳源(見圖3)。

圖3 碳源對融安金桔新梢霉變致病菌Mucor sp.菌絲生長的影響

培養(yǎng)4 d發(fā)現(xiàn)，在供試9種氮源培養(yǎng)基上，牛肉浸出膏培養(yǎng)基上的菌落直徑最大，甘氨酸、尿素和精氨酸的菌落直徑其次(分別為牛肉浸出膏培養(yǎng)基的83.72%、81.27%、78.95%)，苯丙氨酸的菌落直徑再次(為牛肉浸出膏培養(yǎng)基的67.10%)。該菌株不能利用蛋白胨、硝酸鈉和硝酸銨這3種氮源，說明菌株對不同氮源具有選擇性。菌株在無氮培養(yǎng)基上也能生長，但菌落直徑僅為牛肉浸出膏的24.40%，說明菌株也可利用其他物質(zhì)來代替氮源(見圖4)。

圖4 氮源對融安金桔新梢霉變致病菌Mucor sp.菌絲生長的影響

2.3 咪鮮胺錳鹽和硼酸室內(nèi)抑菌效果培養(yǎng)4 d發(fā)現(xiàn)，與空白對照(0%)相比，0.10%和0.20%咪鮮胺錳鹽均能顯著抑制菌落的生長，且隨著濃度增加抑制效果更加顯著。與空白對照(0%)相比，0.05%硼酸顯著促進了菌絲生長，說明低濃度硼酸對菌絲生長有著積極作用；當硼酸濃度增加到0.1%時，菌絲生長抑制率高達80.0%以上；當硼酸濃度達0.2%時，菌落無法生長(見圖5)?？梢姡漉r胺錳鹽和較高濃度硼酸能顯著抑制菌絲生長，且抑菌效果隨著濃度增加而增強；與咪鮮胺錳鹽相比，硼酸的抑菌效果更好。

圖5 不同濃度咪鮮胺錳鹽和硼酸對融安金桔新梢霉變致病菌Mucor sp.菌絲生長的影響

2.4 硼酸處理對細胞膜透性的影響PI為膜非滲透性染料，在細胞膜受損時方可滲入細胞內(nèi)，并嵌入DNA堿基對中與之結(jié)合發(fā)出熒光[16]。菌株分別接種在含0%(空白對照)和0.1%硼酸的PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4 d后，分別挑取菌落邊緣的菌絲及孢子，經(jīng)PI染色后進行觀察。空白對照的菌絲著色較淺(圖6)。0.1%硼酸處理的大多菌絲都被染成較深的紅色(圖6)，但孢子只有少量被染成紅色。推測孢子的細胞膜結(jié)構(gòu)更有利于抵抗硼酸的傷害作用，因此硼酸處理對菌絲細胞膜的完整性影響更大。

圖6 硼酸處理對融安金桔新梢霉變致病菌Mucor sp.菌絲和孢子細胞膜透性的影響

3 討論

本研究結(jié)果表明，經(jīng)BLAST同源性比對，融安金桔新梢霉變致病菌與已報道的Mucorcircinelloides(登錄號MH854658)的同源性為99%，再經(jīng)形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育樹比較，判定融安金桔新梢霉變致病菌為毛霉屬(Mucor)真菌。此菌引起的田間病害發(fā)生在春夏交接的溫暖多雨季節(jié)，金桔新梢葉片容易出現(xiàn)霉變發(fā)黑癥狀，老葉和果實不感病，這與柑桔黑點病在老葉和果實上均能發(fā)生有明顯不同[2]。在食品工業(yè)中利用毛霉含有高活性的蛋白酶、纖維素酶和β-葡萄糖苷酶等的特性，進行豆制品發(fā)酵和分解[17-18]。融安金桔新梢霉變致病菌毛霉菌株則可能利用其相關(guān)酶對新梢分解獲得養(yǎng)分，從而達到侵染的目的，這與前人在果實腐爛和枯枝落葉中發(fā)現(xiàn)的毛霉具有相似的功能[19]。本試驗表明，融安金桔新梢霉變致病菌毛霉菌株的最適生長溫度是25 ℃，與融安春夏交接溫暖多雨季節(jié)的溫度條件相近，也與革莽枯萎病[20]、柑桔炭疽病、柑桔潰瘍病等需要潮濕和溫暖的環(huán)境才能快速地侵染幼葉、新梢和果實的結(jié)果相似[21]，還與前人研究發(fā)現(xiàn)的M.circinelloidesURM 4182的最大生物量和產(chǎn)油量的最適溫度是26 ℃的結(jié)果相吻合[22]。融安金桔新梢霉變致病菌毛霉菌株在不同的pH值條件下均能生長，對pH值適應(yīng)范圍比較廣，但以pH值8～9范圍內(nèi)生長最好，說明其較適宜生活于弱堿性環(huán)境。連續(xù)光照能抑制菌絲生長，因此在夏季，當?shù)販囟仍龈?，光照變強時，新梢所發(fā)生的霉變也消失。該菌株能利用不同碳源和氮源，其中最適碳源為麥芽糖和D-果糖，最適宜氮源為牛肉浸出膏。該菌株對碳源的選擇性不高，對氮源有明顯的選擇性，不能利用蛋白胨、硝酸鈉和硝酸銨這3種氮源，其原因還有待于深入研究。

真菌細胞膜對維持細胞的微環(huán)境和正常代謝起著重要作用。細胞膜脂質(zhì)過氧化，膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，將引起細胞代謝紊亂，影響孢子萌發(fā)管的生長[23]。本試驗表明，咪鮮胺錳鹽和硼酸均能顯著抑制菌絲生長，但以硼酸抑制效果最好。PI染色結(jié)果表明，細胞膜是硼酸的作用靶點，硼酸處理導(dǎo)致其細胞膜結(jié)構(gòu)完整性破壞，引發(fā)細胞膜功能紊亂而導(dǎo)致細胞死亡，當菌株的細胞膜完整性降低，功能受損時，菌絲生長也受到抑制[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，納他霉素對柿餅中毛霉屬抑菌效果好[25]，而戊唑醇對于浙江地區(qū)紅花芍藥中總狀毛霉(Mucorracemosus)引起的病害殺菌效果佳[26]。說明，不同的毛霉種類對不同藥劑的敏感性不同。室內(nèi)抑菌試驗表明，融安金桔新梢霉變致病菌毛霉菌株對咪鮮胺錳鹽和硼酸均敏感，但田間藥效還需驗證。相比于咪鮮胺錳鹽，硼酸還可作為葉面肥來促進花芽分化和花粉萌發(fā)，因此，尤其需對不同濃度硼酸的田間防治效果進行評價。