郭 琴， 王 穎， 王歡歡， 張立石， 柏 冬△

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所， 北京 100700； 2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是指影響因素眾多且病因未明的慢性非特異性腸道炎癥，與克羅恩病(Crohn’s disease, CD)統(tǒng)稱為炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease, IBD)，臨床上常表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、里急后重、便血等癥狀。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)[1-3]，中藥復(fù)方烏梅丸對(duì)寒熱錯(cuò)雜的UC療效顯著，該方由烏梅、細(xì)辛、干姜、黃連、當(dāng)歸、附子、花椒、桂枝、人參和黃柏10味藥材配伍而成[4]，原方為丸劑，服用量較大，臨床中常用該湯劑進(jìn)行加減治療UC[5，6]。然而湯劑使用不便，不利于推廣，若依據(jù)該方直接開(kāi)發(fā)新藥用于UC，方中藥味較多，含有附子、細(xì)辛等有毒中藥，藥效、安全性、質(zhì)量研究、審批風(fēng)險(xiǎn)較大，因此在不影響對(duì)于UC療效的前提下，對(duì)該方的精簡(jiǎn)具有實(shí)際意義。

烏梅丸根據(jù)藥味可分為酸、苦、甘、辛4種，其組方原則主要針對(duì)UC寒熱錯(cuò)雜證病機(jī)，酸味藥澀腸止瀉、平肝柔木；苦味藥清熱燥濕止?。恍廖端帨刂猩⒑?，一辛一苦、一散一降、一熱一寒，辛開(kāi)苦降，為開(kāi)通之要藥，寒熱之邪均可開(kāi)瀉；甘味藥益氣補(bǔ)脾，與酸味藥同用則酸甘化陰。方中藥物寒熱并用，補(bǔ)瀉兼施，可實(shí)現(xiàn)原方健脾、理氣、祛濕、澀腸止瀉的目的，適宜治療寒熱錯(cuò)雜、正氣虛弱所引起的腹痛、腹瀉、里急后重之癥。課題組在前期對(duì)烏梅丸治療UC的相關(guān)文章進(jìn)行了整理，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)總結(jié)所有口服(湯劑)類文獻(xiàn)(包含口服湯劑、聯(lián)合用藥)，發(fā)現(xiàn)方中烏梅、黃連、人參、干姜使用頻率較高(>90%)，且這4味分別是酸、苦、甘、辛藥味的代表藥物，初步將烏梅丸精簡(jiǎn)為烏梅、人參、黃連和干姜，且由于烏梅丸原方中酸、苦、甘、辛4個(gè)藥味的用量依次是30 g、12 g、12 g、29 g，因此將精簡(jiǎn)方中4個(gè)藥物的用量擬定為原方中4個(gè)藥味的用量。

本研究以2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)致UC大鼠為UC模型，通過(guò)結(jié)腸損傷程度、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β和環(huán)氧化酶(cyclooxygenase, COX)-2水平評(píng)價(jià)烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方的藥效，從藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)探討烏梅丸精簡(jiǎn)方是否具有替代全方的可能性。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于藥物和疾病間相互作用的整體性和系統(tǒng)性，能夠在體外虛擬篩選潛在的藥效物質(zhì)、作用靶點(diǎn)和通路，并構(gòu)建“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”多層次網(wǎng)絡(luò)，初步預(yù)測(cè)出疾病與藥物的作用機(jī)制[7]。因此本研究在藥效學(xué)驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，探討烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方作用于UC的機(jī)制，以期望說(shuō)明烏梅丸精簡(jiǎn)方的可行性和合理性。本研究已通過(guò)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，批號(hào)JCS2018012。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠，鼠齡2個(gè)月(體質(zhì)量220～240 g)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)SCXK(京)2018-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度和濕度分別為24 ℃和28%，每籠大鼠5 只，用混合配方飼料，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，每日更換飲水，保持大鼠生活環(huán)境通風(fēng)及清潔衛(wèi)生。

1.2 藥品

烏梅(Prunusmume，171215)、細(xì)辛(AsarumsieboldiiMiq.，180506)、干姜(Zingiberoj-jicinaleRosc.，180119)、黃連(CoptischinensisFranch.，171123)、當(dāng)歸(Angelicasinensis，180603)、附子(AconitumcarmichaeliDebx.，180512)、花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.，180117)、桂枝(CinnamomumcassiaPresl，171229)、人參(PanaxginsengC.A.Mey.，180228)和黃柏(PhellodendronchinenseSchneid.，180507)均購(gòu)自北京同仁堂藥店，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉春生教授鑒定為正品。

1.3 試劑及儀器

柳氮磺吡啶腸溶片(Sulfasalazine，上海信誼嘉華藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H31020557)；TNBS(美國(guó)Sigma公司，P2297)；戊巴比妥鈉(美國(guó)Merck公司，P11011)；COX-2 Elisa試劑盒(美國(guó)USCN life science公司，SEA699Ra)；IL-1β Elisa試劑盒(美國(guó)R&D systems公司，RTA00)。分析天平(AR2130，美國(guó)OHAUS公司)；高速低溫離心機(jī)(3K15，美國(guó)Sigma公司)；電動(dòng)勻漿器(Pro200，美國(guó)PRO Scientific Inc公司)；酶標(biāo)儀(Elx800，美國(guó)BioTek公司)；洗板機(jī)(Elx50/8，美國(guó)BioTek公司)。

2 方法

2.1 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 藥物的制備 全方：烏梅30 g，細(xì)辛3 g，干姜9 g，黃連6 g，當(dāng)歸6 g，附子6 g，花椒5 g，桂枝6 g，人參6 g，黃柏6 g。精簡(jiǎn)方：烏梅30 g，人參12 g，黃連12 g，干姜29 g。分別按上述處方劑量稱取藥材，加8 倍水煎煮1 h，第2次6 倍量水煎煮1 h合并濾液，水浴濃縮至稠膏，70 ℃減壓真空干燥6 h得干浸膏粉，稱重并粉碎過(guò)篩，共煎煮30倍劑量，共獲得干膏624 g，合20.8 g浸膏/劑。

2.1.2 大鼠UC模型的制備[8]大鼠(實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水24 h)用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，按5 % TNBS 0.6 mL加0.25 mL的無(wú)水乙醇比例配制TNBS乙醇灌腸液，取仰臥位，將1根聚乙烯管(直徑約2 mm)經(jīng)肛門(mén)插入腸道，深度8 cm, 將0.3 mL的TNBS乙醇灌腸液注入腸道，保持肛門(mén)高30 s，30 min后有大量糞便排出，再按上述方法經(jīng)肛門(mén)注入TNBS乙醇灌腸液0.85 mL，保持肛門(mén)高位5 min，防止液體流出，另正常對(duì)照組大鼠以等量生理鹽水取代TNBS灌腸液灌腸, 其余過(guò)程相同。

2.1.3 分組、給藥和取材 將腹瀉程度類似的大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、全方組、精簡(jiǎn)方組、陽(yáng)性藥柳氮磺嘧啶組(SASP組)。造模后第2天進(jìn)行灌胃治療，正常對(duì)照組和模型組灌服純凈水，全方組、精簡(jiǎn)方組分別灌服烏梅丸全方浸膏和精簡(jiǎn)方浸膏3.6 g/kg(2 倍臨床劑量)，給藥量計(jì)算公式：0.018×20.8 g浸膏/劑÷0.2 kg×2=3.6 g/kg，SASP組灌服柳氮磺嘧啶0. 4 g/kg[8]。

治療2 周后，各組麻醉后剖開(kāi)腹腔，截取結(jié)腸約2 cm測(cè)定長(zhǎng)度、稱重，拍照評(píng)價(jià)結(jié)腸損傷程度。鋁箔紙包裹后液氮速凍，-70 ℃冰箱保存。

2.1.4 結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分 表1示，取材后根據(jù)所拍攝縱向剖開(kāi)腸組織潰瘍形成及炎癥的情況進(jìn)行評(píng)分，病變范圍每增加1 cm計(jì)分加1。評(píng)分由2 人同時(shí)評(píng)判取平均值。

表1 結(jié)腸組織損傷情況評(píng)分表[9,10]

2.1.5 細(xì)胞因子IL-1β和COX-2的測(cè)定 使用液氮研缽將凍存的腸組織研碎成粉末，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，稱重并加入10 倍體積的PBS溶液進(jìn)行勻漿，然后取上清液根據(jù)Elisa試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定腸組織中IL-1β和COX-2水平。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.3.1 有效成分的篩選 于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方中各個(gè)藥味的化學(xué)成分，以生物利用度(OB)≥30 %和類藥性(DL)≥0.18為條件篩選有效成分，并將《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版)[11]中各藥的指標(biāo)性成分作為有效成分。

2.3.2 疾病靶點(diǎn)的收集 借助TTD(Therapeutic Target Database, http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)、CTD(Comparative Toxicogenomics Database, http://ctdbase.org/)和Geen Card數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)檢索疾病“Ulcerative colitis”(潰瘍性結(jié)腸炎)的靶點(diǎn)，與2.2.1項(xiàng)下的藥物靶點(diǎn)作交集。

2.3.3 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過(guò)Cytoscape3.8.0軟件對(duì)2.2.1和2.2.2項(xiàng)下的藥物、有效成分、靶點(diǎn)和疾病進(jìn)行關(guān)聯(lián)，構(gòu)建烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方治療潰瘍性結(jié)腸炎的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。

2.3.4 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction, PPI)的構(gòu)建 將烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方與疾病的交集靶點(diǎn)分別輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/)，構(gòu)建烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方作用于UC的PPI網(wǎng)絡(luò)，并將其導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

2.3.5 基因本體論 (gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析 基于DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方與UC相關(guān)的靶點(diǎn)分別進(jìn)行GO和KEGG分析，并對(duì)富集交結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2.3.6 分子對(duì)接驗(yàn)證 根據(jù)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果，以核心成分為配體、核心靶點(diǎn)為受體進(jìn)行分子對(duì)接。在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)檢索核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)，去除水分子和其原配體并加極性氫。從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載配體的3D文件，優(yōu)化構(gòu)象。使用Auto Dock Vina軟件(美國(guó)Scripps研究所Olson實(shí)驗(yàn)室)對(duì)受體和配體進(jìn)行分子對(duì)接，設(shè)置能量范圍(energy range)為10、精度(exhaustiveness )為20，迭代次數(shù)(num modes)為100，通過(guò)比較結(jié)合自由能的高低評(píng)價(jià)受體和配體的結(jié)合情況，使用Pymol軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。

3 結(jié)果

3.1 藥效學(xué)結(jié)果

3.1.1 結(jié)腸組織損傷情況 表2示，模型組大鼠的結(jié)腸組織明顯變粗，結(jié)腸質(zhì)量長(zhǎng)度比顯著升高(P<0.01)，各組動(dòng)物經(jīng)藥物治療后腸管增厚程度均有所減輕，結(jié)腸損傷指數(shù)、質(zhì)量長(zhǎng)度比均有所下降(P<0.05)，且各治療組之間無(wú)顯著性差異。

表2 各組大鼠結(jié)腸損傷情況比較

3.1.2 細(xì)胞因子IL-1β和COX-2水平 表3示，模型大鼠結(jié)腸組織中IL-1β、COX-2均顯著增高(P<0.01)，各組動(dòng)物經(jīng)藥物治療后IL-1β、COX-2水平均有所下降(P<0.05)，但三者之間無(wú)顯著性差異。

表3 各組大鼠結(jié)腸中IL-1β和COX-2水平比較

3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.2.1 烏梅丸精簡(jiǎn)方和全方有效成分及其靶點(diǎn)、疾病靶點(diǎn)的收集結(jié)果 圖1示，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)得到烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方的有效成分為73和41個(gè)，有效成分的靶點(diǎn)有120和113 個(gè)?；赥TD數(shù)據(jù)庫(kù)、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)和Geen Card數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索到17 018 個(gè)疾病靶點(diǎn)。將疾病靶點(diǎn)與烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方有效成分的靶點(diǎn)取交集得到的韋恩圖，全方、精簡(jiǎn)方與UC共同調(diào)控的靶點(diǎn)分別有117和105 個(gè)，與精簡(jiǎn)方比較全方多調(diào)控了12 個(gè)靶點(diǎn)。

圖1 UC與烏梅丸全方、精簡(jiǎn)方韋恩圖

3.2.2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果 圖2示，將烏梅丸全方、精簡(jiǎn)方的有效成分及其靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件后，構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，其中綠色部分代表有效成分，綠色三角形代表重復(fù)性成分，紫色箭形代表全方、精簡(jiǎn)方與UC共同調(diào)控的靶點(diǎn)，淺粉色箭形代表全方與UC共同調(diào)控的靶點(diǎn)，淺黃色箭形為非交集靶點(diǎn)。從圖中可以看出，烏梅丸全方、精簡(jiǎn)方有效成分和UC共同調(diào)控的靶點(diǎn)共有105 個(gè)，對(duì)于UC靶點(diǎn)的調(diào)控，烏梅丸全方比精簡(jiǎn)方僅多了12 個(gè)靶點(diǎn)，說(shuō)明從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分子角度來(lái)看，烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方對(duì)于UC疾病具有較強(qiáng)的調(diào)控作用，且全方和精簡(jiǎn)方對(duì)于UC調(diào)控的靶點(diǎn)重復(fù)性很高。

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

3.2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和拓?fù)浞治鼋Y(jié)果 圖3示，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建了蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，全方的PPI網(wǎng)絡(luò)由115 個(gè)節(jié)點(diǎn)和1056 條邊構(gòu)成，精簡(jiǎn)方的PPI網(wǎng)絡(luò)由103 個(gè)節(jié)點(diǎn)和888 條邊構(gòu)成，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件?；贑ytoHubba插件以度(Degree)值為條件進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選出全方和精簡(jiǎn)方排名前10的核心靶點(diǎn)，與有效成分進(jìn)行關(guān)聯(lián)，得到的核心靶點(diǎn)-核心成分網(wǎng)絡(luò)圖，全方和精簡(jiǎn)方有9 個(gè)相同的核心靶點(diǎn)。

圖3 核心靶點(diǎn)-核心成分網(wǎng)絡(luò)圖

3.2.4 GO和KEGG富集結(jié)果 GO分析：圖4示，其中橙色柱代表分子功能(molecular function)，綠色柱代表生物過(guò)程(biological process)，藍(lán)色柱代表細(xì)胞組成(cellular component)。在分子功能方面，全方和精簡(jiǎn)方主要對(duì)酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性和序列特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體等分子功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，且全方還對(duì)藥物結(jié)合結(jié)合和RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性、配體激活的序列特異性DNA結(jié)合等分子功能顯著調(diào)節(jié)；在生物過(guò)程方面，全方和精簡(jiǎn)方主要調(diào)節(jié)RNA聚合酶II啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控和等生物過(guò)程，且精簡(jiǎn)方還對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)和凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控的生物過(guò)程具有重要調(diào)節(jié)作用；在細(xì)胞組成方面，全方和精簡(jiǎn)方都對(duì)胞質(zhì)溶膠和核質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用，從以上可以看出，烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方主要通過(guò)調(diào)控酶結(jié)合、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄等生物功能來(lái)治療UC。

圖4 GO富集分析圖

KEGG分析：圖5示，該氣泡圖中靶點(diǎn)富集到通路中的數(shù)目越多則氣泡越大，從綠色至黃色，再至紅色的顏色過(guò)渡中，表示P值越來(lái)越大。全方和精簡(jiǎn)方顯著調(diào)節(jié)的前20 條通路相同，其中與UC有關(guān)的通路主要有腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1信號(hào)通路和腫瘤抑制基因(tumor suppressor gene，p53)信號(hào)通路等，圖6示，對(duì)富集得到的一些主要通路進(jìn)行整合，其中胱天蛋白酶(caspase，CASP)3、原癌基因(proto-oncogene c-fos，F(xiàn)OS)、IL-6和表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)4個(gè)核心靶點(diǎn)出現(xiàn)在這幾條主要通路中，說(shuō)明烏梅丸主要通過(guò)CASP3、FOS、IL6和EGFR等核心靶點(diǎn)作用于TNF信號(hào)通路、結(jié)直腸癌信號(hào)通路和p53信號(hào)通路等通路來(lái)治療UC。

圖5 KEGG富集分析圖

圖6 烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方作用于UC的主要通路圖

3.2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果 圖4、5示，綜合拓?fù)浞治龊屯犯患Y(jié)果，由于FOS的晶體結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯適合對(duì)接的口袋位置，因此最終選擇IL6、CASP3和EGFR作為受體，25 個(gè)核心成分作為配體進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接盒子的參數(shù)設(shè)置，受體和配體對(duì)接的最低結(jié)合自由能的絕對(duì)值越大，說(shuō)明二者結(jié)合的親和力越高。一般認(rèn)為，絕對(duì)值在6～7.5之間表示受體和配體有一定的結(jié)合活性，7.5～9之間表示有較好的結(jié)合活性，大于9表示有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。圖7示，根據(jù)對(duì)接結(jié)果，22 個(gè)核心成分與3 個(gè)靶點(diǎn)都有較強(qiáng)的親和力，對(duì)受體和配體最低結(jié)合自由能絕對(duì)值大于9的進(jìn)行可視化。

表4 3個(gè)靶點(diǎn)對(duì)接盒子參數(shù)比較

4 討論

UC主要以直腸和結(jié)腸黏膜及黏膜下層的炎癥改變?yōu)橹饕±硖卣?，結(jié)腸黏膜損傷現(xiàn)象包括水腫、充血、潰瘍以及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等[12]。因此，在藥效實(shí)驗(yàn)時(shí)需要對(duì)大鼠的結(jié)腸損傷情況進(jìn)行評(píng)價(jià)；IL-1β作為一種能夠激活多種免疫和炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，主要由單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等分泌產(chǎn)生[13]，UC患者血清、糞便和結(jié)腸組織中IL-1β水平明顯高于正常機(jī)體[14，15]；COX-2是一種與炎癥密切相關(guān)、可將花生四烯酸代謝成前列腺素的誘導(dǎo)型環(huán)氧化酶，在正常腸黏膜的表達(dá)較低，而在UC患者的腸黏膜表達(dá)明顯升高[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組大鼠比較，模型組大鼠的結(jié)腸組織明顯變粗，結(jié)腸質(zhì)量長(zhǎng)度比顯著升高，結(jié)腸組織中IL-1β和COX-2水平顯著升高，烏梅丸丸全方組、精簡(jiǎn)方組和陽(yáng)性藥物組大鼠的腸組織損傷情況均有所改善，結(jié)腸質(zhì)量長(zhǎng)度比下降，IL-1β和COX-2水平降低，且給藥的3個(gè)組并無(wú)顯著差異，說(shuō)明烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方都對(duì)TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠有治療作用，雖然全方組大鼠結(jié)腸損傷的改善情況較好，但二者差別細(xì)微。因此從藥效實(shí)驗(yàn)可認(rèn)為，烏梅丸精簡(jiǎn)方能夠替代全方治療UC，對(duì)于精簡(jiǎn)方是否具有可行性及其內(nèi)在機(jī)制，則可借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接進(jìn)行更深層次的探討分析。

表5 核心成分與3個(gè)靶點(diǎn)對(duì)接的最低結(jié)合自由能(kcal/mol)

中藥復(fù)方治療疾病有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，內(nèi)在機(jī)制和作用過(guò)程極其復(fù)雜，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)使研究人員從“一藥一靶點(diǎn)”的傳統(tǒng)觀念轉(zhuǎn)向“藥物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”模式[17]。該模式符合中醫(yī)的整體觀念，因此本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)烏梅丸精簡(jiǎn)方的可行性進(jìn)行分析。本研究發(fā)現(xiàn)，烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方的核心靶點(diǎn)基本類似，主要有IL-6、CASP3和EGFR等。GO富集發(fā)現(xiàn)，全方和精簡(jiǎn)方主要調(diào)節(jié)酶結(jié)合、信號(hào)傳導(dǎo)、凋亡過(guò)程和轉(zhuǎn)錄等生物功能。KEGG富集發(fā)現(xiàn)，全方和精簡(jiǎn)方作用的UC有關(guān)的通路主要有細(xì)胞凋亡、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、大腸癌和p53信號(hào)通路等，在通路中，IL-6、CASP3、FOS和EGFR等靶點(diǎn)也起到了核心作用。

IL-6是一種多功能細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥等過(guò)程中具有調(diào)節(jié)作用，在UC的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，其表達(dá)水平與UC嚴(yán)重程度密切相關(guān)且呈正相關(guān)[18，19]。CASP3是一種蛋白酶，其家族在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，UC發(fā)生時(shí)，腸道黏膜屏障的完整性破壞，存在上皮細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象[20]，CASP3表達(dá)明顯增加[21]。GO和KEGG結(jié)果顯示，烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方作用于細(xì)胞凋亡這條通路，因此調(diào)控CASP3的表達(dá)對(duì)控制UC和細(xì)胞凋亡具有重要意義。EGFR是一種受體酪氨酸激酶，與配體結(jié)合參與細(xì)胞發(fā)育中的許多重要活動(dòng)，如細(xì)胞增殖、分裂和凋亡等[22]。EGFR的過(guò)量表達(dá)在UC及其相關(guān)癌變中起重要作用，對(duì)EGFR的研究有助于預(yù)防、診斷和治療UC[23]。因此文獻(xiàn)表明，IL6、CASP3、FOS和EGFR等核心靶點(diǎn)在UC的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有重要意義，烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方主要通過(guò)作用于這些靶點(diǎn)來(lái)治愈UC。

圖7示，烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方主要通過(guò)細(xì)胞凋亡、TNF信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、結(jié)直腸癌信號(hào)通路和p53信號(hào)通路等來(lái)改善UC。烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方主要通過(guò)激活核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)和IκB激酶(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase, IKKB)靶點(diǎn)調(diào)控TNF信號(hào)通路，在調(diào)控該信號(hào)通路的同時(shí)也作用于磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)信號(hào)通路，進(jìn)一步調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)等生物過(guò)程，改善黏膜損傷。TNF-α作為促炎和調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)促炎因子的釋放，可與干擾素一起改變腸上皮細(xì)胞的屏障功能，增強(qiáng)腸黏膜和血管壁的通透性，破壞腸黏膜的完整性并形成潰瘍[24]。HIF是體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子, 嚴(yán)格監(jiān)管人體內(nèi)氧氣水平[25]，在HIF-1信號(hào)通路中起關(guān)鍵性作用。UC最嚴(yán)重并發(fā)癥之一就是UC-CRC，KEGG富集結(jié)果顯示，烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方還作用于結(jié)直腸信號(hào)通路，說(shuō)明烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方可能具有預(yù)防UC發(fā)生癌變的潛在作用。p53是一種重要的腫瘤抑制因子，其介導(dǎo)的信號(hào)通路參與信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和增殖等過(guò)程。Kobayashi等[26]認(rèn)為，p53的表達(dá)與UC的病理機(jī)制密切相關(guān)，其表達(dá)可能是UC與相關(guān)結(jié)腸癌發(fā)生早期的良好生物標(biāo)志物和診斷工具。

對(duì)靶點(diǎn)和成分拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方的核心成分相似性極高，主要有黃酮類(槲皮素、山奈酚)、生物堿類(小檗堿、吳茱萸次堿、黃連堿、甲基黃連堿)、木脂素類(芝麻素)和三萜類(人參皂苷rh2)等成分，陳大朋等[27]篩選具有靶向抑制JAK受體的天然單體化合物，發(fā)現(xiàn)以上這些成分對(duì)炎性腸病有治療作用，而分子對(duì)接結(jié)果也顯示，以黃酮類為代表的核心成分與UC關(guān)鍵靶點(diǎn)(IL-6、CASP3和EGFR等)具有較高的結(jié)合活性。

綜上所述，從藥效學(xué)角度來(lái)看，烏梅丸全方對(duì)TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠治療作用雖比精簡(jiǎn)方略好，但無(wú)顯著性差異；從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度來(lái)看，烏梅丸全方和精簡(jiǎn)方作用于UC的核心靶點(diǎn)、核心成分和通路呈高度相似性。雖然烏梅丸全方比精簡(jiǎn)方對(duì)于UC的效果更好，但差異不大，在一定條件下對(duì)于UC的治療，烏梅丸精簡(jiǎn)方更具有可行性。