彭君偉，周 帆，陳 江

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院閔行院區(qū)中西醫(yī)結(jié)合科，上海 220240；2.湖州市第三人民醫(yī)院內(nèi)科，浙江 湖州 313002；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)蘇州附屬醫(yī)院脾胃病科， 江蘇 蘇州 215009）

薏苡附子敗醬散近年來(lái)被應(yīng)用到潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）及炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌（colitis-associated colorectal cancer，CAC）的治療當(dāng)中，取得較好的臨床療效[5-6]。研究證實(shí)，薏苡附子敗醬散具有調(diào)節(jié)免疫、減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)腸黏膜修復(fù)等作用[7]，但其對(duì)于腸黏膜屏障的保護(hù)機(jī)制尚未闡明。薏苡附子敗醬散寒溫并用、虛實(shí)兼顧，契合UC及CRC 脾腎衰憊為本，濕熱毒邪為標(biāo)的病機(jī)。本研究基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[7]，建立脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的 IEC-6 細(xì)胞損傷模型，觀察薏苡附子敗醬散納入附子及單用附子的不同配伍對(duì)炎癥損傷下腸上皮細(xì)胞屏障的影響，以期為薏苡附子敗醬散治療UC和CAC 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞株（IEC-6），購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司，貨號(hào)：ZQ0783。

1.2 藥物 全方組：薏苡仁30 g，附子6 g，敗醬草15 g；去附子組：薏苡仁30 g，敗醬草15 g；單用附子組：附子6 g，均購(gòu)自蘇州市春暉堂藥業(yè)有限公司。各組藥液濃縮至1 g 生藥/mL，4℃保存。加入細(xì)胞前用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，并過(guò)濾除菌。

1.3 主要試劑與儀器 DMEM 培養(yǎng)液（美國(guó)GIBCO公司，批號(hào)：1993895）；四氮唑鹽（MTT，批號(hào)：EZ2811A179）；二甲基亞砜（AMERSCO 公司，批號(hào)：2015906）；ELISA 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：A382H80425、A306H80152）；RIPA裂解液（上?；鶢栴D生物，批號(hào)：BYL40825）；BCA蛋白定量試劑盒（Thermo 公司，批號(hào)：PICPI23223）；ZO-1（批號(hào)：AF5145）、Occludin 一抗（美國(guó)Affinity公司，批號(hào)：DF7504）；GAPDH（美國(guó)CST 公司，批號(hào)：#5174）。SpectraMax M2e 型酶標(biāo)儀（Molecular Devices 公司）；Millicell ERS-2 型伏特歐姆計(jì)（美國(guó)Millipore 公司）。

1.4 確定全方組的實(shí)驗(yàn)藥物濃度

1.4.1 薏苡附子敗醬散對(duì)LPS 誘導(dǎo)的IEC-6 細(xì)胞活力的影響 將IEC-6 細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 uL（細(xì)胞數(shù)約1.0×105個(gè)）。設(shè)對(duì)照組、模型組和薏苡附子敗醬散不同濃度組，共7 組，每組5個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，對(duì)照組換液，其余各組吸棄上清，加入10 μg/mL 以完全培養(yǎng)基稀釋的LPS 溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后對(duì)照組和模型組均加入100 μL 完全培養(yǎng)基，其余各組加入終濃度分別為0.5、1、5、10、20 mg/mL的以完全培養(yǎng)基稀釋的全方藥液。24 h 后，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，水平搖床震蕩，以酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度（OD）值，比色選擇490 nm 波長(zhǎng)。各組細(xì)胞活率=實(shí)驗(yàn)組OD 值/對(duì)照組OD 值×100%。

1.4.2 薏苡附子敗醬散對(duì)LPS 誘導(dǎo)IEC-6 細(xì)胞TNF-α、IL-6 分泌量的影響 IEC-6 細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔約1.0×106個(gè)細(xì)胞，每組5 個(gè)復(fù)孔，分組、干預(yù)方法同“1.4.1”。培養(yǎng)24 h 后，分別吸取上清液至EP 管中，3 000 r/min 離心10 min，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組上清液中TNF-α 和IL-6 的含量。

1.5 全方、去附子和單用附子對(duì)LPS 誘導(dǎo)IEC-6 細(xì)胞活性的影響 IEC-6 細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔約1.0×105個(gè)細(xì)胞，設(shè)對(duì)照組、模型組、全方組、去附子組和單用附子組，共5 組，每組5 個(gè)復(fù)孔。24 h后，對(duì)照組換液，其余各組加入10 μg/mL LPS 溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后對(duì)照組和模型組加入完全培養(yǎng)基，全方組加入終濃度為10 mg/mL 的全方稀釋液，8.82 mg/mL 去附子和1.18 mg/mL 單用附子稀釋液。24 h 后，以MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞活率。

1.6 全方、去附子和單用附子對(duì)LPS 誘導(dǎo)的IEC-6 細(xì)胞分泌TNF-α和IL-6的影響 分組、干預(yù)方法同“1.5”，按試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中TNF-α 和IL-6的含量。

除此之外，筆者認(rèn)為還有兩篇值得關(guān)注的文章，一篇是楊振之先生從哲學(xué)角度提出的“詩(shī)意棲居說(shuō)”[27]，另一篇是胡傳東先生從進(jìn)化心理學(xué)角度提出的“心理適應(yīng)說(shuō)”[28](筆者姑且這樣稱之)。本文認(rèn)為，楊振之先生的“詩(shī)意地棲居”一定程度上切近了旅游的本質(zhì)。但由于其切入的路徑是哲學(xué)的思辨，邏輯上雖有說(shuō)服力，但比較缺少科學(xué)和事實(shí)的說(shuō)服力。本文認(rèn)為與其說(shuō)是“詩(shī)意地棲居”，不如說(shuō)是“流動(dòng)地棲居”“遷移地棲居”更能反映出旅游的動(dòng)態(tài)性特征，也更符合人類發(fā)展演化的歷史事實(shí)。

1.7 全方、去附子和單用附子對(duì)LPS 誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 表達(dá)的影響 將IEC-6 細(xì)胞漂洗后，加入裂解液后收集，12 000 r/min離心10 min。取上清液，采用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。各組樣本經(jīng)分離、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗洗滌；二抗經(jīng)HRP稀釋、孵育、洗滌等步驟，再加入顯影液曝光條帶。以GAPDH 作為內(nèi)參，通過(guò)Gel-PRO Analyzer 軟件分析各組結(jié)果。

1.8 全方、去附子和單用附子對(duì)LPS 誘導(dǎo)的IEC-6 細(xì)胞跨細(xì)胞單層電阻的影響 將IEC-6 細(xì)胞以5×105/孔接種于Millipore Transwell 24 孔板上室，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種第4 天開(kāi)始，每2 天用Millicell ERS-2 伏特歐姆計(jì)監(jiān)測(cè)單層IEC-6 細(xì)胞的跨膜電阻值（TEER）。待TEER 上升到平臺(tái)期時(shí)，分組造模，方法同“1.5”。最后檢測(cè)各組細(xì)胞TEER。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，若符合正態(tài)分布資料數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析；若為非正態(tài)分布資料數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney U 秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 全方對(duì)LPS 誘導(dǎo)IEC-6 細(xì)胞活性及炎癥因子表達(dá)的影響 與模型組比較，10 mg/mL 薏苡附子敗醬散明顯提高 LPS 損傷后的 IEC-6 細(xì)胞活率（P＜ 0.01），見(jiàn)表1，且明顯降低 TNF-α 和 IL-6 分泌量（P＜ 0.01），見(jiàn)表2，增強(qiáng)細(xì)胞活性和抗炎作用均最佳，故以10 mg/mL 作為全方組后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度并以此換算出去附子組和單用附子組的濃度。

表1 不同濃度YFBS 對(duì)IEC-6 細(xì)胞活率比較（±s，n = 5）%

表1 不同濃度YFBS 對(duì)IEC-6 細(xì)胞活率比較（±s，n = 5）%

注：與對(duì)照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01

組別細(xì)胞活率對(duì)照組100模型組70.94±4.25##0.5 mg/mL75.32±4.40 1 mg/mL80.86±4.21△△5 mg/mL85.25±4.43△△10 mg/mL88.87±5.97△△20 mg/mL82.80±5.45△△

表2 不同濃度YFBS 對(duì)IEC-6 細(xì)胞TNF-α 和IL-6 分泌量的影響（±s，n = 5） pg/mL

表2 不同濃度YFBS 對(duì)IEC-6 細(xì)胞TNF-α 和IL-6 分泌量的影響（±s，n = 5） pg/mL

注：與對(duì)照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別TNF-αIL-6對(duì)照組 73.99±7.25117.71±4.69模型組106.45±7.12##149.20±6.32##0.5 mg/mL103.39±5.21147.08±6.16 1 mg/mL 98.51±4.93△142.48±4.68 5 mg/mL 91.67±5.00 △△133.63±7.00 △△10 mg/mL 83.12±5.25 △△124.06±7.06 △△20 mg/mL 95.24±5.71 △△135.92±8.28 △△

2.2 全方、全方去附子和單用附子對(duì)LPS 誘導(dǎo)的IEC-6 細(xì)胞活性的影響 3 組均能提高LPS 損傷后的IEC-6 細(xì)胞活率（P＜0.05），但以全方組最高，去附子組次之，單用附子組最低，見(jiàn)表3。

表3 各組IEC-6 細(xì)胞活率比較（±s，n = 5） %

表3 各組IEC-6 細(xì)胞活率比較（±s，n = 5） %

注：與對(duì)照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與全方組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與去附子組比較，**P ＜0.01

組別細(xì)胞活率對(duì)照組100模型組69.62±6.58##全方組88.27±1.46△△去附子組82.90±3.68△△▲單用附子組74.21±4.17△▲▲**

2.3 全方、去附子和單用附子對(duì)LPS 誘導(dǎo)的IEC-6 細(xì)胞TNF-α 和IL-6 分泌量的影響 全方和去附子組均可明顯降低LPS 誘導(dǎo)下TNF-α 和IL-6 分泌量（P＜0.01），且全方和去附子組效應(yīng)相當(dāng)（P＞0.05），單用附子組無(wú)明顯作用（P＞0.05），見(jiàn)表4。

表4 各組IEC-6 細(xì)胞TNF-α 和IL-6 分泌量的比較（±s，n = 5） pg/mL

表4 各組IEC-6 細(xì)胞TNF-α 和IL-6 分泌量的比較（±s，n = 5） pg/mL

注：與對(duì)照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與全方組比較，▲▲P ＜0.01；與去附子組比較，*P ＜0.05

組別TNF-αIL-6對(duì)照組 66.52±5.91110.79±8.19模型組110.65±7.37##143.12±9.62##全方組 89.58±7.84△△119.10±8.00△△去附子組 93.18±2.82△△122.47±6.18△△單用附子組103.69±5.46▲▲*133.60±6.84▲▲*

2.4 全方、去附子和單用附子對(duì)LPS 誘導(dǎo)的IEC-6 細(xì)胞ZO-1 和Occludin 蛋白表達(dá)的影響 3 組均可減輕

LPS 對(duì)ZO-1 蛋白的破壞，3 組間兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即ZO-1 表達(dá)量全方組＞去附子組＞單用附子組。在Occludin 表達(dá)量上，全方組、去附子組均表達(dá)增高（P＜0.01），單用附子組無(wú)明顯作用（P＞0.05），見(jiàn)表5，如圖1。

圖1 各組IEC-6 細(xì)胞ZO-1、Occludin 蛋白表達(dá)量比較

表5 各組細(xì)胞ZO-1、Occludin 蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s，n = 3） GAPDH

表5 各組細(xì)胞ZO-1、Occludin 蛋白相對(duì)表達(dá)量（±s，n = 3） GAPDH

注：與對(duì)照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與全方組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與去附子組比較，**P ＜0.01

組別ZO-1Occludin對(duì)照組0.74±0.020.72±0.01模型組0.20±0.01##0.35±0.02##全方組0.59±0.02△△0.52±0.01△△去附子組0.55±0.01△△▲0.50±0.02△△單用附子組0.34±0.01△△▲▲**0.38±0.02▲▲**

2.5 全方、全方去附子和單用附子對(duì)LPS 誘導(dǎo)的IEC-6 細(xì)胞通透性的影響 與對(duì)照組相比，模型組TEER 值顯著下降（P＜0.01），與模型組相比，3 組均顯著升高TEER 值（P＜0.01）。各組相比，全方組TEER 最高（P＜0.01），去附子和單用附子組沒(méi)有明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)表6。

表6 各組IEC-6細(xì)胞跨細(xì)胞單層電阻值（±s，n = 3）Ω·cm2

表6 各組IEC-6細(xì)胞跨細(xì)胞單層電阻值（±s，n = 3）Ω·cm2

注：與對(duì)照組比較，## P ＜0.01；與模型組比較，△△P ＜0.01；與全方組比較，▲▲P ＜0.01

組別TEER對(duì)照組627.8±9.18模型組276.8±7.50##全方組587.4±35.85△△去附子組461.4±31.75△△▲▲單用附子組463.2±49.39△△▲▲

3 討論

腸上皮細(xì)胞既能交換營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，又充當(dāng)著腸黏膜屏障的角色[8-9]。在病理狀態(tài)下，維持腸上皮細(xì)胞的適度增殖是重建腸上皮屏障完整性的重要環(huán)節(jié)[10-11]。TJs在電鏡下表現(xiàn)為緊密連接蛋白相互交錯(cuò)，包繞在相鄰細(xì)胞的連接面上，以封閉細(xì)胞間隙。TJs 中的Occludin蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞旁路滲透性中起到重要作用[12-13]。ZO-1 蛋白位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜表面，通過(guò)PDZ 結(jié)構(gòu)域與絕大多數(shù)緊密連接蛋白及細(xì)胞骨架相連[14]，對(duì)于維持TJ 的穩(wěn)固性發(fā)揮重要作用。此外，ZO-1 和Occludin還發(fā)揮著促進(jìn)細(xì)胞黏附、維持上皮極性、調(diào)控細(xì)胞增殖分化等功能。兩者減少、缺失或移位均能引起腸上皮細(xì)胞間通透性的增加。腸上皮屏障的通透性可通過(guò)測(cè)定跨細(xì)胞電阻值（transepithelial electrical resistance，TEER）來(lái)反應(yīng)，兩者成反比，即TEER 越大，細(xì)胞通透性越低[15]。

薏苡附子敗醬散中薏苡仁清熱利濕，消癰利腸[16]；敗醬草瀉熱解毒，祛瘀排膿[17-18]；少佐附子為妙用，既可扶助脾腎之陽(yáng)以治本，又可辛通溫散，以利濕熱瘀毒排出。三藥共奏溫陽(yáng)健脾、清熱祛濕解毒之功[19]。臨床實(shí)踐也表明，薏苡附子敗醬散加減對(duì)UC 具有較好的治療效果[20]。為此，我們建立以LPS 刺激IEC-6細(xì)胞模擬腸黏膜屏障功能損傷模型，觀察薏苡附子敗醬散納入附子及單用附子對(duì)炎癥損傷后腸黏膜屏障的影響進(jìn)一步佐證溫陽(yáng)解毒除濕治法治療UC 和CAC 的合理性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：全方組、去附子組均能夠提高LPS 損傷下IEC-6 細(xì)胞的活率，降低炎癥狀態(tài)下的TNF-α 和IL-6 分泌量，上調(diào)ZO-1、Occludin 的表達(dá)，降低跨膜電阻值，降低上皮屏障通透性。全方組在提高細(xì)胞活率作用強(qiáng)于去附子組；在降低TNF-α 和IL-6分泌上2 組作用相當(dāng)；在增加ZO-1 蛋白表達(dá)上，全方組強(qiáng)于去附子組，而對(duì)Occludin 的表達(dá)，2 組作用相當(dāng)。單味附子無(wú)明顯抗炎作用，但可以提高損傷細(xì)胞的活性，是全方良好增殖效應(yīng)的基礎(chǔ)之一。另外，單味附子雖然只對(duì)ZO-1 蛋白促表達(dá)有明顯作用，但仍可明顯降低黏膜通透性究其原因可能附子主要作用于其他緊密連接蛋白或涉及其他機(jī)制。可見(jiàn)，薏苡仁+敗醬草主要作用在于抗炎、提高細(xì)胞活性，保護(hù)緊密連接蛋白；附子則主要集中在增強(qiáng)細(xì)胞活性、維持上皮屏障緊密性等作用，與前兩味藥相配使腸上皮屏障的保護(hù)作用發(fā)揮到最大。當(dāng)然，全方的效應(yīng)不是三味藥藥理作用的簡(jiǎn)單疊加，而是各有側(cè)重，密切配合，其中的機(jī)制通路尚待進(jìn)一步研究。