王 朔， 解 靜， 徐一蘭， 高樹明， 李 琳， 高 杉， 于春泉

(天津中醫(yī)藥大學， 天津 301617)

心血管疾病是導致我國人群死亡及疾病負擔的主要病因。據調查顯示，缺血性腦卒中和心臟病分別在心血管疾病死亡占比為49.7%和37.8%，位居心血管疾病致死率首位[1，2]。我國每年因患冠心病死亡人數近300萬，且發(fā)病率不斷增加并呈年輕化態(tài)勢，故早期診斷對于冠心病治療意義重大。冠心病早期診斷基于患者的臨床癥狀、心電圖及生物標志物得以實現，其中生物標志物對于冠心病診斷尤為重要[3]。臨床研究發(fā)現，開展以病證結合的中西醫(yī)診療模式，對提高冠心病診斷和臨床療效方面作用顯著。中醫(yī)流行病學調查[4]表明，以痰濁、血瘀為證素的證型最為多見，痰瘀互結證冠心病是中醫(yī)臨床常見的辨證分型，因此開展冠心病痰瘀相關的證候本質研究，找到證候特異性標志物，將其作為微觀辨證依據，是目前中醫(yī)藥防治冠心病研究的焦點。隨著系統生物學的發(fā)展，運用現代組學技術從分子水平研究證候生物標志物，在揭示冠心病病理機制，早期臨床診斷、評估和治療以及藥物研發(fā)意義重大。

筆者以“冠心病”“痰”“瘀”及“生物標志物”為主題詞檢索近10年相關文獻，并從臨床生化指標、蛋白組學技術、基因組學技術、代謝組學技術等方面做出梳理與總結，旨在為發(fā)現冠心病痰瘀相關特異性生物標志物，并用以早期臨床診斷提出思考。

1 基于臨床生化冠心病痰瘀相關標志物發(fā)現

目前對于冠心病痰瘀相關的臨床常用指標主要以客觀實驗室指標特征結果居多，且多為蛋白類標志物。

1.1 冠心病痰瘀相關常見生化標志物的研究

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的標志物主要有肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzymes，CK-MB)、心肌肌鈣蛋白(cardiac troponin，cTn)、肌紅蛋白(myoglobin，Myo)等，其中CK-MB 是臨床診斷AMI使用最多的標志物，cTn包括cTn I(cardiac troponin I，cTN I)和cTn T(cardiac troponin T，cTN T)，是診斷心肌損傷的“金標準”，是最具特異性、敏感性的標志物。Myo雖然特異性較低, 但具有良好的敏感性，三者常聯合檢測并作為診斷心肌缺血的主要證據，可以提高診斷心肌梗死的有效性和敏感性[5]。李偉海[6]研究表明，急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)不同證型與非ACS組比較差異明顯，且痰阻心脈證患者CK-MB、高敏肌鈣蛋白T(hs-cTn T)在不同證型中水平最高，氣虛血瘀證患者Myo水平最高，對于在已有實驗室檢查情況下，診斷冠心病證型、評估患者心肌損傷狀態(tài)具有參考價值。研究發(fā)現，心肌酶的變化在AMI不同證型中存在明顯差異，陰血虧虛型患者與陽氣虧虛型患者CK-MB、CK、乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)、血清α-羥丁酸脫氫酶(α-HBDH)異常率及均值明顯高于痰濁閉塞型患者和氣滯血瘀型患者，提示陰陽虧虛與心肌缺血標志物相關性更加密切[7]。

心臟型脂肪酸結合蛋白(heart fatty acid bindingprotein，h-FABP)是存在于心肌細胞胞質中的一種可溶性非結合、低分子量蛋白，在心肌損傷后可快速釋放入血，且檢測時間要優(yōu)于肌鈣蛋白T，因此是早期篩查ACS的重要標志物。劉福忠等[8]觀察中醫(yī)不同證型患者血清h-FABP及B型腦鈉肽(type B natriuretic peptide, BNP)水平，發(fā)現冠心病心力衰竭患者h-FABP水平較高，且在不同中醫(yī)證型間存在差異性，一定程度上可作為心衰患者中醫(yī)辨證分型量化指標的參考依據。

B型腦鈉肽(BNP)和氨基末端腦鈉肽前體(n terminal pro b type natriuretic peptide, NT-pro B-NP)是在心室壁壓力改變下，心肌細胞缺血和細胞因子分泌增加，從而導致血清濃度增加產生的肽類物質，是診斷心衰的重要標志物。趙華云等[9]將納入研究的90例冠心病患者辨證分為心血瘀阻證、痰濁閉阻、心腎陽虛等3個證型，發(fā)現BNP水平與證型間有明顯的相關性，且在上述證型中呈現依次遞增趨勢，表明不同證型與冠心病危險程度存在密切關系，提示BNP可指導冠心病辨證分型。王路宏[10]將76名心衰患者辨證分為氣陰兩虛、氣虛血瘀、陽虛水泛等3個證型，結果顯示陽虛水泛型患者的BNP值明顯高于其他證型患者，說明BNP增高聯合其他指標對心衰嚴重程度及預后判斷更加規(guī)范和客觀。

1.2 冠心病痰瘀相關炎癥標志物的研究

動脈粥樣硬化(AS)的病理特點是炎細胞浸潤，冠心病作為一種炎癥性疾病，炎癥反應貫穿始終。眾多研究指出冠心病與炎癥、免疫密切相關，因此將炎癥相關因子作為生物標志物的研究也越來越廣泛，其中包括超敏C-反應蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)、人可溶性細胞間黏附分子-1(soluble adhesion molecules，sICAM - 1)、血同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)、白介素-6(Interleukin-6，IL-6)等，對于早期診斷、治療及準確判斷預后提供幫助。劉燕琴[11]研究表明，冠心病患者血CRP、HCY、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein，LDL-C)水平高于健康人群，且不同中醫(yī)證型之間存在的相關性，CRP、HCY、LDL-C水平越高越容易辨為氣虛血瘀證，CRP、LDL-C水平越高越容易辨為痰瘀互阻證，為冠心病辨證分型的客觀化提供參考。脂聯素(adiponectin，APN)是一種主要由脂肪細胞分泌的生物活性多肽因子，具有抗炎的作用，并可抑制sICAM - 1的黏附，同時具有抗AS的作用。冠心病不同中醫(yī)證型患者血清 sICAM - 1和APN含量存在差異，心血瘀阻證和陽氣虛衰證患者上述指標明顯高于痰阻心脈證和氣陰兩虛證患者，監(jiān)測和關注二者的動態(tài)變化對于不同證型冠心病的診斷治療具有指導意義，或可作為冠心病中醫(yī)證型關聯性研究及臨床微觀辨證的重要指標[12]。

2 基于蛋白質組學冠心病痰瘀相關標志物的發(fā)現

蛋白質組學是以蛋白質層面為研究對象，觀察所有蛋白及其變化規(guī)律的一門科學。利用蛋白組學可以對存在于組織或體液中某一層面的蛋白進行定性定量研究，高通量篩查出各種因素引起的樣本差異蛋白質譜，并對特異性生物分子功能進行分析，以此用于冠心病的診斷及治療(見表1)。

表1 冠心病痰、瘀相關蛋白質標志物的研究

2.1 冠心病血瘀相關蛋白質標志物的研究

王剛[13]等采集冠心病心血瘀阻證和心腎陰虛證患者血漿，通過熒光差異蛋白電泳 (2 D-DIGE) 、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(MALDI-TOF-MS)，發(fā)現二者存在10種差異蛋白，包括聚集素和血清淀粉樣p物質2種上調蛋白和血紅素結合蛋白、載脂蛋白E等8種下調蛋白，分析發(fā)現阿爾茲海默癥信號通路和補體凝血級聯通路可能為2種證型辨證的相關通路。

孟永梅等[14]基于同位素標記相對和絕對定量(i TRQ)聯合串聯質譜技術(MS)，對慢性心力衰竭氣虛血瘀證組和健康人組血清進行差異蛋白表達分析，鑒定出16個差異蛋白質，包括載脂蛋白E等11個表達上調的蛋白和5個表達下調的蛋白，為氣虛血瘀證的客觀研究開拓新思路。

Wang等[15]建立氣虛血瘀證慢性心肌缺血小型豬模型，通過二維電泳圖譜(2-DE)和基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)進行差異蛋白分析，發(fā)現異檸檬酸脫氫酶3α、還原型輔酶Ⅰ脫氫酶、Fe-S蛋白1、鏈A、熱休克蛋白27等11種特征性蛋白，可能與NADH呼吸鏈和心肌損傷介導的能量代謝失調相關，為發(fā)現氣虛血瘀證的潛在標志物提供線索。

劉如秀等[16]采用四級桿飛行時間質譜(Q- TOF)技術研究滋腎活血方對冠心病腎虛血瘀型大鼠缺血心肌蛋白表達，發(fā)現滋腎活血方調節(jié)乳酸脫氫酶B鏈、肉堿棕櫚酰轉移酶-2、異檸檬酸脫氫酶、ATP合酶α亞基、肌凝蛋白-6等蛋白表達明顯，且這些差異蛋白表達可能與能量代謝、細胞骨架等作用相關。

尚青華[17]研究冠心病穩(wěn)定期-潛毒-瘀毒過程自身血清蛋白質組學變化特點，鑒定得到“瘀毒”病機轉變相關蛋白有人激肽原1(kininogen-1，KNG1)等4種，其中KNG1和過氧化物酶1(peroxiredoxin 1，PRDX1)是穩(wěn)定期患者“瘀毒”病機轉變的相關蛋白。

2.2 冠心病痰濁相關蛋白質標志物的研究

朱明丹等[18]對冠心病心血瘀阻證和痰濁內阻證進行差異蛋白分析，得到抗凝血酶等10種差異蛋白，富集通路主要與凝血系統、補體系統、脂質代謝及炎癥反應系統相關，提示以上蛋白及通路可能是區(qū)別冠心病心血瘀阻證、痰濁內阻證等不同證型的蛋白標志物。

趙慧輝等[19]研究冠心病不穩(wěn)定心絞痛氣虛血瘀證患者、痰瘀互阻證患者及健康人的去高豐度蛋白血漿進行蛋白組學，發(fā)現反映氣虛血瘀證蛋白表達變化的有結合珠蛋白α1鏈、α1抗胰蛋白酶等7個蛋白，痰瘀互阻證的有載脂蛋白C-Ⅲ、載脂蛋白A-Ⅱ等2個蛋白，二者在炎癥反應、脂質代謝紊亂等方面表現一定的共性特征，但痰瘀互阻證表現得更為復雜。

崔佩佩等[20]以冠心病心氣虛弱證和痰濁內阻證患者為研究對象，得出載脂蛋白H等12種蛋白水平在冠心病痰濁內阻證患者體內高表達，結合生物信學分析得到蛋白富集通路，包括血液連鎖反應系、磷酸戊糖途徑、半乳糖代謝、糖酵解等，提示區(qū)分痰濁證與心氣虛弱證的客觀量化證據，可從血液凝固、脂類代謝和能量代謝水平等方面查找。

3 基于基因組學冠心病痰瘀相關標志物發(fā)現

基因組學是通過基因芯片或分子測序等技術，研究整體水平基因組結構、功能及基因間相互作用規(guī)律的一門科學，主要包括結構基因組學、功能基因組學及比較基因組學[21]。利用基因組學可以對包括DNA和各層面信使RNA(mRNA)基因水平表達譜進行全面的高通量篩選，得到不同證候差異表達的基因組，并根據生物信息學方法對基因數據進行解讀，有助于揭示中醫(yī)病證的差異基因表達，并推斷其功能和作用機理(表2)。

表2 冠心病痰瘀相關基因標志物的研究

3.1 冠心病血瘀相關基因標志物的研究

王階課題組[22，23]利用高通量測序對冠心病血瘀證差異基因進行篩選，將所得差異基因進行匹配，構建長鏈非編碼RNA-微小RNA-信使RNA(lncRNA-miRNA-mRNA)多層次調控網絡，發(fā)現CTA-38D8.35等4個基因作為關鍵靶點，從轉錄組學層面闡釋冠心病血瘀證的病理機制。

研究采用高通量測序分別從DNA甲基化、miRNA和mRNA不同層面對冠心病血瘀證患者基因進行篩選，確定miR194 promoter-miR194-絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路為關鍵通路，通過血塞通藥物干預對該通路重要節(jié)點進行驗證，證明冠心病血瘀證的發(fā)病機制[24]。

Liao等[25]通過檢測冠心病血瘀證和缺血性中風血瘀證患者miRNA，發(fā)現血瘀證患者miR-146b-5p和miR-199a-5p明顯上調，并通過定量即時聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)靶向驗證，證實miR-146b-5p和miR-199a-5p作為血瘀證生物標志物的可信度。

張月娟等[26]利用Aglient miRNA表達芯片，結合實驗和臨床研究篩選并構建冠心病慢性血瘀證miRNA調控網絡，驗證確定miR-24-3p、miR-223-3p、miR-106b-5p為關鍵基因，揭示冠心病血瘀證與炎癥反應、免疫反應、能量代謝級細胞增殖凋亡等關系密切。

朱惠征[27]以冠心病ACS氣虛血瘀證和氣虛痰瘀證為研究對象，采用高通量長鏈非編碼RNA(microRNA)表達譜，分別篩選出差異基因127條和72條，通過比對得到2組患者差異表達microRNA共4條，可作為二者辨證分型的客觀依據。

3.2 冠心病痰濁相關基因標志物的研究

虞桂[28]以冠心病不穩(wěn)定性心絞痛患者為研究對象，發(fā)現miR-363-5p、miR-668、絲氨酸/蘇氨酸激酶2(recombinant receptor interacting serine threonine kinase 2，RIPK2)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶4(serine/threonine-protein kinase，STK4)與炎癥和凋亡機制相關，可作為痰濁證生物標志物；miR-146b-5p、miR-199a-5p、人鈣網蛋白(calreticulin，CALR)和腫瘤抑制蛋白(tumor protein P53，TP53)調節(jié)炎癥和凋亡，可作為血瘀證生物標志物。

4 基于代謝組學冠心病痰瘀相關標志物發(fā)現

代謝組學是通過采集樣本血漿、尿樣等代謝產物，通過各種現代分離分析技術得到代謝產物譜，并結合生物信息學方法，尋找標志性代謝產物或代謝通路，并對其相應功能或變化趨勢進行分析，為中醫(yī)藥現代化研究提供平臺(表3)。

表3 冠心病痰瘀相關代謝標志物的研究

4.1 冠心病血瘀相關代謝標志物的研究

以冠心病血瘀證患者為研究對象，通過超高效液相色譜-串聯質譜聯用(UHPLC/MS)技術檢測患者血液樣本，發(fā)現檸檬酸等4種內源性代謝標志物，為繼續(xù)探究冠心病血瘀證生物學基礎及發(fā)現新藥作用靶點提供新思路[29]。鄭景輝等[30-33]對冠心病心血瘀阻證患者血漿、尿液代謝組學進行研究，主要涉及糖酵解和糖異生、丙酸代謝、脂肪酸生物合成等代謝通路，有望從以上通路深入研究，揭示血瘀證的生物學機制。鄭娟娟等[34]研究發(fā)現，冠心病心血瘀阻證可能生物標志物有丙酮酸、磷酸甲酯、2-羥基戊酸等，并采用血府逐瘀湯干預進行驗證，發(fā)現各靶點均有回調趨勢，進一步證明丙酮酸等物質可作為心血瘀阻證標志物。

Zhao等[35]分別對冠心病心肌梗死小型豬和不穩(wěn)定心絞痛患者血漿進行代謝組學檢測，并與對照組比較分別發(fā)現21個和20個差異代謝物，通過主成分分析和聚類分析得到8個共有代謝物，為冠心病血瘀證的微觀辨證指標提供依據。

采用高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜(LC-Q/TOF-MS)技術和多元統計分析方法篩選出大鼠血漿代謝產物，并用當歸干預血瘀證大鼠確定具有明顯變化的15個內源性代謝標志物，涉及有脂代謝、氨基酸代謝等途徑[36]。Tan等[37]采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜(UPLC-Q/TOF-MS)技術，檢測冠心病血瘀證大鼠血漿和尿液代謝物，發(fā)現皮質酮，3α，21-二羥基-5β-孕烷-11，20-二酮和19羥二十烷四烯酸和白三烯A4等代謝物與血瘀證相關，并通過血栓心脈寧片干預發(fā)現，可調節(jié)上述代謝物表達，為揭示血瘀證發(fā)病機制及血栓心脈寧片治療作用提供參考。

朱明丹等[38]對心肌梗死恢復期氣虛血瘀證患者血漿進行研究，發(fā)現磷脂酰膽堿、花生四烯酸、亞油酸等存在明顯下調趨勢，推測能量代謝、磷脂代謝等可能是氣虛血瘀證的重要發(fā)病機制，為后期“方-證-效”對應驗證生物標志物研究提供實驗依據。

徐利云[39]建立不同證型胸痹大鼠模型，鑒別出氣滯血瘀型生物標志物為L-蛋氨酸、L-高半胱氨酸、十八烷酰胺等，氣虛血瘀型生物標志物為4-吡啶氧酸、棕櫚酰溶血卵磷脂和3-羥基十六烷酸，發(fā)現證型多與能量代謝、氨基酸代謝等途徑相關。

4.2 冠心病痰濁相關代謝標志物的研究

鹿小燕等[40]比較痰證、瘀證冠心病患者與健康人血清代謝產物，結果顯示痰濁組和血瘀阻差異代謝物主要包括蘋果酸、琥珀酸、果糖、葡萄糖、甘氨酸、丙氨酸和棕櫚烯酸等。程鵬[41]測定痰濁證、氣虛證血漿代謝物，分析顯示絲氨酸、纈氨酸、2羥基丙酸、花生四烯酸甲酯等物質差異性最大，可作為區(qū)別2種證型差異標志物。分別對12例冠心病痰濁痹阻證、氣虛血瘀證和氣滯血瘀證患者血、尿代謝物進行檢測，并從能量代謝、糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝等方面分析出差異代謝標志物，其中乳酸、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰糖蛋白等可能是區(qū)分不同證型的標志物[42，43]。

陳浩等[44]利用代謝組學技術，分別檢測冠心病氣虛血瘀證組和氣虛血瘀痰濁證組不同人群的血液、尿液代謝物，發(fā)現氣虛血瘀證組潛在生物標志物有天冬氨酰蛋氨酸等，氣虛血瘀痰濁證組的標志物有馬尿酸等，為臨床對不同證型冠心病防治提供借鑒。

Li[45]采用UPLC-Q-TOF/MS技術對丹蔞方主要化學成分進行定性分析，通過丹蔞方干預冠心病痰瘀互結證大鼠模型，鑒定大鼠血清中甜菜堿、γ-亞麻酸、亞油酸、11,14,17-二十碳三烯酸、二十二碳六烯酸等17種生物標志物，分析得出丹蔞方可通過改善能量代謝、甘油磷脂代謝等途徑，發(fā)揮對痰瘀互結型冠心病的治療作用。

5 討論

目前開展冠心病痰瘀相關標志物研究眾多，綜合來看，主要運用蛋白組學、基因組學、代謝組學等系統生物學技術以及IPA、MetaCore、KEGG數據庫及網絡藥理學等生物信息學分析方法，通過對比不同證型間的差異蛋白、基因、代謝物等找出相應生物標志物，涉及到脂質代謝、能量代謝、炎癥反應等途徑及作用機制頗多，對于深入研究冠心病不同證型候選標志物，尤其是痰瘀互結證的關鍵性分子，實現疾病與證候的準確診斷具有指導意義[46-49]。隨著組學技術與生物信息學方法結合日臻完善，多學科交叉融合揭示中醫(yī)藥理論內涵和本質規(guī)律成為中醫(yī)藥領域研究的新風尚，聯合多組學技術進行冠心病痰瘀互結證的研究或可成為未來深化冠心病病證結合、方證對應視角下中藥新藥開發(fā)研究的趨勢[50，51]。

當然，組學技術支持下冠心病痰瘀相關證型的研究，篩選并鑒定出的生物標志物種類繁多，存在標志物特異性不明確的問題，這就需要研究者在明確辨證分型的基礎上，提高對病證診斷、治療量化、規(guī)范化標準。此外，不同層面的標志物如何進行有效的關聯性分析與結合，如何對標志物所在路徑及作用機制進行深入探討，是否需要大樣本前瞻性研究對以往研究進行補充和驗證，這些問題仍值得研究者思考與探索[52，53]。