李曉東，常淤浩，潘 悅，林 爽，劉 璐，張宏達，周星宇，馬 欣

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

母乳（human milk，HM）脂肪是嬰兒重要能量來源，可為出生6 個月內(nèi)的嬰兒提供45%～55%所需 能量[1]。HM脂肪主要包括甘油三酯（triglyceride，TG，占總脂肪98%～99%）、磷脂（占總脂肪0.26%～0.80%）、甾醇（占總脂肪0.25%～0.34%，其中主要是膽固醇）及其他低豐度脂肪，如甘油一酯、甘油二酯（diglyceride，DG）、游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）等[2-6]。TG是HM脂肪的主要成分，由甘油連接3 個脂肪酸分子構(gòu)成，其性質(zhì)與功能根據(jù)其所連接的脂肪酸種類、位置的不同具有很大差異，這種差異不僅會影響乳脂的理化性質(zhì)，還與人體吸收效率有關(guān)[7-9]。目前已經(jīng)從HM中鑒別出400余種TG[10-11]，且發(fā)現(xiàn)其脂肪酸分布并非完全隨機，大多數(shù)飽和脂肪酸都酯化在sn-2位置。其中約70%的sn-2位置被C16:0占據(jù)[2,12]。

為了實現(xiàn)脂肪組成HM化，目前嬰兒配方食品中嬰兒配方奶粉（infant formula powder，IFP）是市場上常見的形式，多采用多種油脂復配的方式調(diào)節(jié)脂肪酸組成，其中植物油和牛乳脂是目前IFP中最常見的脂肪來源[13]。此外，還有少量添加海藻油、魚油補充配方粉中的多不飽和脂肪酸[14]。這些脂肪的添加雖然使IFP在部分重要脂肪酸、TG含量上接近了HM，但IFP整體脂肪組 成變得復雜，導致IFP與HM在脂肪消化和吸收效果的差異[15-17]。結(jié)構(gòu)油脂的出現(xiàn)，例如1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯（1,3-dioleoyl-2-palmitoyl triglyceride，OPO），雖一定程度上解決了IFP與HM中TG結(jié)構(gòu)差異問題，但目前仍局限于sn-2位棕櫚酸結(jié)構(gòu)的TG，而對于HM中其他含量豐富的TG研究尚不深入，對于不同脂肪來源IFP中脂肪的存在形式與HM的差異也尚不明確。因此，本研究選取5 款市售不同脂肪來源的IFP，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對其甘油酯組成與HM進行比較研究，分析不同脂肪來源的IFP與HM脂肪組成的差異及其可能對脂肪消化產(chǎn)生的潛在影響，以期為IFP的設(shè)計與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HM是由來自哈爾濱的哺乳期志愿者提供的成熟HM（大于產(chǎn)后21 d，n=6），年齡18～30 歲，分娩足月兒，HM充足，孕期或哺乳期間無乳腺炎、感染性疾病、心血管疾病、代謝性疾病、精神系統(tǒng)疾病、癌癥及其他惡性消耗性疾病，最近2 周未使用過藥物及催乳用西藥。采樣時間為上午9—11點之間，志愿者母親一側(cè)乳房在喂哺嬰兒時，用電動人乳采集泵同時采集另外一側(cè)乳房的乳汁，同時記錄HM的采集時間、乳樣質(zhì)量。HM采集后保存在10 mL凍存管中，編號后迅速降溫至－4 ℃，冷藏狀態(tài)運送至實驗室，轉(zhuǎn)移至－80 ℃冰箱避光保存，使用前將不同樣品混合，制成混合樣品進行實驗。HM混合樣的脂肪質(zhì)量濃度為4.2 g/100 mL。

IFP選取了市售的5 種具有不同油脂來源的0～6 個月的嬰兒配方粉，包括植物脂肪基配方奶粉IF1、IF2共2 種及牛乳/植物脂肪基配方奶粉IF3～IF5共3 種，如表1所示。

表1 奶粉樣品及脂肪來源Table 1 IFP samples and their fat sources

37 種脂肪酸甲酯標準品、氯仿（色譜級）、甲醇（質(zhì)譜級） 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TripleTOF?5600+四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國AB SCIEX公司；LC-30A超高效液相色譜儀 日本島津公司；UGC-24M氮吹儀 北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪提取

采用Cheong等[18]改善的Folch法并加以調(diào)整，將不同脂肪來源的IFP（IF1～5）用超純水分別配制成脂肪質(zhì)量濃度4.2 g/100 mL的乳液，取5 mL乳液或HM于50 mL離心管中，加入20 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液和5 mL質(zhì)量分數(shù)0.73% NaCl溶液混勻，超聲提取10 min后，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，用注射器吸取下層有機相收集；向剩余上層液中加入10 mL氯仿-甲醇溶液，超聲10 min后，于4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取下層有機相。合并2 次提取的有機相，氮氣吹干，制得脂 肪－20 ℃貯存。

1.3.2 甘油酯檢測

稱取一定質(zhì)量脂肪，用氯仿-甲醇（2∶1，V/V）復溶，制成質(zhì)量濃度20 mg/mL的脂肪溶液，過0.22 nm有機相濾膜，之后利用液相色譜-飛行時間質(zhì)譜對脂肪中的TG進行分析。

液相色譜條件：Phenomen Kinetex C18色譜柱（100 m×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A為10 mmol/L醋酸銨與乙腈-水（4∶6，V/V）；流動相B為10 mmol/L醋酸銨與乙腈-異丙醇（1∶9，V/V）；流速300 μL/min。洗脫條件：0～12 min，60%～0% A、40%～100% B；12～13.7 min，0%～60% A、100%～40% B；13.7～18 min，60% A、40% B；進樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：在Analyst TF 1.7，AB SCIEX軟件控制下，基于信息依賴（information dependent acquisition，IDA）功能進行一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。在每個數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，采集強度最強且大于100的分子離子對應的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。電子能量35 eV，每50 ms采集15 張二級譜圖。電噴霧電離源參數(shù)設(shè)置如下：霧化氣壓力60 Pa；輔助氣壓力60 Pa；氣簾氣壓力30 Pa，溫度550 ℃；噴霧 電壓5 500 V[19]。

數(shù)據(jù)處理：使用ProteoWizard軟件將原始質(zhì)譜轉(zhuǎn)化為mzXML格式。再使用XCMS軟件進行保留時間矯正、峰識別、峰提取、峰積分、峰對齊等工作。使用基于XCMS軟件、R程序包及脂肪二級數(shù)據(jù)庫（源自Lipid Maps）進行脂肪鑒定及定量工作；使用SPSS 23.0和Simca 14.1軟件對數(shù)據(jù)進行差異分析和單變量統(tǒng)計分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 IFP與HM的甘油酯組成分析

如表2所示，在不同脂肪來源的配方奶粉和HM中共檢出DG 12 種、TG 30 種，其中HM的DG相對含量很高，為（7.84±0.57）%，這與前期研究中HMDG含量較高的趨勢一致[20]。另外，HM中相對含量最高的DG種類為DG(18∶2/18∶2)和DG(18∶1/18∶1)，二者占HM中總DG的80%以上。同時，HM中相對含量最高的TG種類為TG(16∶0/18∶1/18∶2)、TG(16∶0/18∶1/18∶1)、TG(16∶0/18∶0/18∶1)、TG(12∶0/12∶0/16∶1)、TG(18∶0/18∶2/18∶2)，這一結(jié)果與文獻[21-22]中1-油酸-2-棕櫚酸-3-亞油酸甘油三酯為中國地區(qū)HM中含量最高的TG類物質(zhì)。

表2 不同脂肪來源的IFP與HM的DG和TG組成Table 2 DG and TG compositions in IFP with different fat sources and HM

植物油基的IF1、IF2中，相對含量最高的TG種類均為TG(18∶1/18∶1/18∶1)、TG(16∶0/16∶0/18∶1)、TG(16∶0/18∶1/18∶1)和TG(16∶1/17∶2/22∶6)。而添加了牛乳脂的IF3、IF4和IF5含量最高的TG種類各不相同，其中IF3相對含量最高的TG種類為TG(16∶0/18∶1/18∶1)、TG(16∶1/17∶2/22∶6)、TG(18∶1/18∶1/18∶1)和TG(16∶0/16∶0/18∶2)，IF4相對含量最高的TG種類為TG(18∶1/18∶1/18∶1)、TG(16∶0/18∶1/18∶1)、TG(16∶0/18∶1/18∶2)和TG(18∶0/18∶2/18∶2)，IF5相對含量最高的TG種類則為TG(16∶1/17∶2/22∶6)、TG(16∶0/17∶1/22∶6)、TG(18∶2/18∶2/18∶2)和TG(18∶1/18∶1/18∶1)。

IFP中的DG含量顯著低于HM（P＜0.05），這可能對嬰幼兒的脂質(zhì)消化產(chǎn)生一定影響。IFP中含量最高的TG種類不僅與HM不同，且在不同脂質(zhì)來源的IFP中也不同。這表明IFP雖然在主要脂肪酸的組成上接近了HM，但在整體的脂肪組成上仍與HM存在很大差異。

2.2 IFP與HM的甘油酯組成的差異分析

為進一步明確不同脂肪來源的IFP與HM在DG和TG組成上的差異，對表2中不同樣品的DG和TG的組成進行了偏最小二乘判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）[23]，篩選不同消化產(chǎn)物中具有差異的脂肪種類，可以對不同脂肪來源的IFP與HM的甘油酯組成差異進行有效表征，分析結(jié)果如圖1、2所示。

圖1中所有樣本點表現(xiàn)出明顯的聚類趨勢，且均分布在95%的置信區(qū)間內(nèi)（圖2），圖1中無離群樣本點，說明建立的PLS-DA模型有效地對30 個樣品進行了分類，同時模型的R2X=0.671、R2Y=0.974、Q2=0.957，說明建立的PLS-DA模型穩(wěn)定性較好，可對95.7%的原始數(shù)據(jù)進行解釋并具有良好的預測性[23]。

圖1 不同脂肪來源IFP及H?M甘油酯組成的PLS-DA模型得分圖Fig. 1 PLS-DA score plot of glyceride composition in IFP with different fat sources and HM

圖2 不同脂肪來源IFP及HM甘油酯PLS-DA模型Hotelling T2圖Fig. 2 Hotelling T2 of PLS-DA model for glyceride composition in IFP with different fat sources and HM

由圖1可知，HM與不同IFP形成了明顯區(qū)分，因此不同脂肪來源的嬰兒配方在甘油酯上均與HM存在不同。在IFP中，純植物油脂基的IF1和IF2較為接近，并與添加了牛乳脂的IF3、IF4和IF5形成了明顯不同的分布區(qū)域，這說明乳脂成分對配方奶粉的甘油酯組成影響十分明顯。IF4在分布圖中與IF1和IF2是較為接近的，因此IF4雖然同樣含有牛乳脂成分，但含量可能低于IF3和IF5。

圖3為不同脂肪來源IFP及HM胃相脂肪酸釋放 PLS-DA模型的因子載荷圖，離密集區(qū)越遠的變量對分類起的作用越關(guān)鍵，為將這種對差異的貢獻度量化，計算不同因素對模型的可變重要性投影（variable importance for the projection，VIP）值，VIP值越大，對樣本分類作出的貢獻越大。VIP值大于1的變量在不同類別之間差異顯著，對分類起重要作用[24-25]。

圖3 不同脂肪來源IFP及HM甘油酯PLS-DA模型因子荷載圖Fig. 3 Factor loading plot of PLS-DA model for glyceride composition in IFP with different fat sources and HM

對于VIP值大于1的甘油酯種類進行非參數(shù)檢驗中的Kruskal Wallis檢驗，驗證這些甘油酯在不同樣品中的顯著差異（P＜0.05），最終篩選VIP值大于1且P值小于0.05的甘油酯種類作為不同組樣品間具有差異的甘油酯種類。不同脂肪來源的IFP與HM的差異甘油酯種類結(jié)果見表3，其中具有顯著差異的DG有5 種，TG有11 種。

不同脂肪來源IFP及HM中差異甘油酯種類Table 3 Differential glycerides between IFP with different fat sources and HM 表 3

通過繪制熱圖和層次聚類分析，對差異甘油酯在不同脂肪來源IFP及HM中的分布進行了表征。如圖4所示，在DG方面，HM中具有顯著較高DG(18∶2/18∶2)和DG(18∶1/18∶1)，而IFP中含量極少，這與HM中高C18:2和C18:1的趨勢一致[26-27]；IF5中則有顯著較高的DG(18∶0/18∶0)和DG(21∶0/22∶6)；而植物基IFP中則有相對較高的DG(22∶6/25∶0)。

圖4 顯著差異DG、TG在不同脂肪來源IFP及HM中的分布Fig. 4 Distribution of differential DG and TG between IFP with different fat sources and HM

在TG方面，HM具有TG(12∶0/12∶0/16∶0)、TG(16∶0/18∶0/18∶1)和TG(16∶0/18∶1/18∶1)顯著較高的特點（P＜0.05），其中TG(16∶0/18∶1/18∶1)在HM中的主要存在形式為OPO[21,28]，其對改善嬰幼兒便秘和鈣利用具有重要意義[13]，雖然IF1、IF2、IF3和IF4均添加了OPO成分，但其含量仍顯著低于HM（P＜0.05）。植物基的IF1和IF2則含有顯著較高的TG(16∶0/16∶0/18∶1)（P＜0.05），這可能與二者較高的棕櫚油添加量有關(guān)[29]。添加了乳脂的IF3、IF4和IF5則具有顯著較高 （P＜0.05）的TG(16∶0/16∶0/16∶0)、TG(14∶0/16∶0/16∶0)、TG(16∶0/17∶0/18∶1)、TG(18∶1/18∶1/18∶2)和TG(12∶0/18∶1/16∶1)含量，這是添加了乳脂的IFP的共性特點。同時IF5中的TG(18∶2/18∶2/18∶2)顯著高于其他樣品（P＜0.05）而TG(16∶0/18∶1/18∶1)顯著低于其他樣品，這與IF5添加了較多大豆油而未添加OPO的趨勢一致[30]。此外，IFP相比于HM均含有顯著較高的TG(16∶1/17∶2/22∶6) （P＜0.05），這說明IFP中C22:6的存在形式可能與HM不同，而這可能與IFP中C22:6主要來源于海藻油或魚油有關(guān)。

綜上，IFP中OPO含量仍顯著低于HM，且其C22:6存在形式與HM不同。在不同脂肪來源的IFP中，可根據(jù)是否添加牛乳脂形成較為清晰的聚類劃分，說明IFP中牛乳脂的添加對其甘油酯組成的影響十分巨大，其中TG(16∶0/16∶0/16∶0)、TG(14∶0/16∶0/16∶0)、TG(16∶0/17∶0/18∶1)、TG(18∶1/18∶1/18∶2)和TG(12∶0/18∶1/16∶1)相對含量顯著較高是添加了牛乳脂的配方奶粉的明顯特征，而這可能會對嬰兒胃腸道中脂肪的消化產(chǎn)生一定影響。

3 結(jié) 論

不同脂肪來源的IFP在脂肪組成上與HM存在顯著差異，HM中DG相對含量高達（7.84±0.57）%，而IFP中DG相對含量不足2%，其中HM含量最高的DG種類為DG(18∶2/18∶2)和DG(18∶1/18∶1)，二者占HM中總DG的80%以上，這可能更加有利于嬰幼兒對C18∶1和C18∶2的吸收和利用。在TG組成上，已添加OPO的IFP，其含量仍顯著低于HM，同時IFP中TG(16∶1/17∶2/22∶6)含量顯著高于HM，這說明IFP中C22∶6的主要存在形式與HM不同。此外，IFP中牛乳脂的添加會使其TG(16∶0/16∶0/16∶0)、TG(14∶0/16∶0/16∶0)、TG(16∶0/17∶0/18∶1)、TG(18∶1/18∶1/18∶2)和TG(12∶0/18∶1/16∶1)的相對含量顯著提高，這可能會對嬰兒胃腸道中脂肪的消化產(chǎn)生一定影響。