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        熒光微球免疫層析方法定量檢測水產品中 4 種硝基呋喃代謝物

        2021-11-05 10:48:46張萬利邵靜梅劉飄雪
        食品科學 2021年20期
        關鍵詞:呋喃層析硝基

        吳 爍,張 彪,張萬利,邵靜梅,劉飄雪,生 威

        (食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室,天津科技大學食品科學與工程學院,天津 300457)

        硝基呋喃類獸藥是合成廣譜抗菌劑,該類藥物能抑制大多數革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌、真菌及原蟲等病原體的活性,因而被廣泛應用于預防和治療疾病[1-3]。同時,硝基呋喃類藥物還被應用于家禽及畜牧業(yè)、蜜蜂及水產養(yǎng)殖中[4],其作為飼料添加劑、生長促進劑。戴欣等[5]發(fā)現,高劑量或長期對動物使用硝基呋喃類獸藥,可產生毒性作用,可誘導突變,甚至致畸、致癌。這些藥物的代謝物被人體吸收后會對人體健康造成巨大危害[6-7]。 因此,各國都對硝基呋喃類獸藥作出限量規(guī)定。2019年歐盟規(guī)定在可食用性食品中,硝基呋喃代謝物的最低殘留限量為0.5 μg/kg[8]。農業(yè)農村部2020年1月6日發(fā)布的第250號公告,明確規(guī)定在動物飼養(yǎng)過程中禁止使用硝基呋喃類藥物,并且在動物性食品中不得檢出[9]。

        硝基呋喃類藥物在動物體內代謝迅速,但其代謝物1-氨基-乙內酰脲(1-aminohydantoin,AHD)、5-嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(5-methylmorpholino-3-amino-2-oxazolidinone,AMOZ)、3-氨基-2-惡唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone,AOZ)、氨基脲(semicarbazide,SEM)與蛋白質結合,形成穩(wěn)定的蛋白結合物,可在生物組織中停留高達8 周[10]。對硝基呋喃類獸藥的檢測主要有高效液相色譜法[11-13]、液相色譜-質譜聯用法[14-15]、 液相色譜-串聯質譜法[16-18]等分析方法,其具有較高的靈敏度及準確性,但是需要專業(yè)人員操作,費時費力,成本高,通常用于驗證性實驗。酶聯免疫吸附測試(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 法[19-21]、熒光免疫分析法[22-23]、化學發(fā)光法[24-26]、免疫層析法[27-32]等免疫分析方法,依靠抗原抗體的特異性結合,具有靈敏度高、特異性好、成本低、操作簡單快速等優(yōu)點。特別是免疫層析法,適用于現場快速檢測大量樣品獸藥殘留,是目前最普遍應用的方法。

        本研究基于抗原抗體的特異性結合作用,根據T線熒光強度(fluorescence intensity of T line,FIT)與目標物濃度間關系,建立新型熒光微球免疫層析方法(fluorescent microspheres immunochromatographic assays,FMICA),制備熒光微球抗體偶聯標記物(fluorescent microspheres antibody conjugated markers,FMs-Ab)為信號探針,以期在最優(yōu)實驗條件借助便攜式試紙條熒光讀數儀,實現水產品中4 種硝基呋喃代謝物的快速定量檢測。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        多寶魚、蝦 天津市場;呋喃妥因(nitrofurantoin,NFT)、呋喃它酮(furaltadone,FTD)、呋喃唑酮(furazolidone,FZD)、呋喃西林(nitrofurazone,NFZ)、AHD、AMOZ、AOZ、SEM、鄰硝基苯甲醛(2-nitrobenzaldehyde,2-NBA)、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)、AHD衍生物(NPAHD)、AMOZ衍生物(NPAMOZ)、AOZ衍生物(NPAOZ)、SEM衍生物(NPSEM)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide,EDC)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA) 美國Sigma公司;熒光微球(fluorescent microsphere,FM) 美國Ocean Nano Tech公司;硝酸纖維素膜 美國Milllipore公司;其他試劑均為國產分析純。

        1.2 儀器與設備

        HM3035三維平面點膜噴金儀、ZQ2000微電腦自動斬切機 上海金標生物有限公司;硝酸纖維素(cellulose nitrate,NC)膜、純水儀 美國Millipore 公司;熒光分光光度計 美國Thermo公司;Savant-100便攜式熒光讀數儀 天津博碩科技有限公司;ZF1-II紫外分析儀 上海嘉鵬科技有限公司;商業(yè)化ELISA 試劑盒 德國R-Biopharm AG公司。

        1.3 方法

        1.3.1 FMs-Ab復合物制備

        取40 μL 10 mg/L熒光微球溶液于2 mL 0.02 mol/L pH 7.4磷酸緩沖液(phosphate buffer,PB)中,加入300 μg EDC和200 μg NHS,250 r/min攪拌活化2 h。置于100 mL離心管中,4 ℃、10 000 r/min離心20 min后棄去上清液,將沉淀復溶于2 mL 0.02 mol/L pH 7.4 PB中,清洗2 次。逐滴加入一定量的抗體,置于磁力攪拌器上,常溫250 r/min緩慢攪拌1 h進行偶聯。加入2 mg BSA,室溫靜置,避光反應1 h進行封閉。置于100 mL離心管中,4 ℃、10 000 r/min離心30 min后棄上清液,將沉淀復溶于400 μL 0.02 mol/L pH 7.4 PB中。得到FMs-Ab復合物,置于4 ℃避光保存。

        1.3.2 熒光微球免疫層析試紙條的組裝

        熒光微球免疫層析試紙條結構如圖1所示,將樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙依次粘貼在PVC膠板上,以0.5 μL/cm的噴涂量將二抗、包被原分別作為控制線 (C線)和測試線(T線)劃在NC膜上,置于37 ℃干燥烘箱孵育6 h,用微電腦自動斬切機切成3.7 mm寬度的試紙條,置于密閉干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

        圖1 熒光微球免疫層析試紙條組裝Fig. 1 Schematic diagram for the assembling of fluorescent microsphere immunochromatographic test strip

        1.3.3 FMICA實驗條件的優(yōu)化

        樣品緩沖液的種類、NC膜的種類、二抗、包被原的稀釋倍數及FMs-Ab添加量均影響試紙檢測的準確性及靈敏度。本實驗選取不同pH值的PB、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)、3 種不同的NC膜進行試紙條檢測,最終選擇使試紙條C、T線FI一致且適中、熒光條帶清晰、背景干擾程度較小時的實驗條件為最優(yōu)條件。借助便攜式試紙條光讀數儀測出C、T線的FI值,分別記為FIC、FIT。當添加樣品緩沖液測得的 FIT/FIC(空白)接近于1,且(FIT/FIC(加標))/(FIT/FIC(空白)) 最?。ㄒ种坡首畲螅r為最佳二抗、包被原稀釋倍數和FMs-Ab添加量。

        1.3.4 FMICA方法靈敏度檢測

        確定好最佳抗體添加量、樣品緩沖液種類、二抗和包被原稀釋倍數及FMs-Ab最佳添加量條件后,用試紙條檢測樣品緩沖液(目標物濃度為0)和一系列濃度梯度NPAHD、NPAMOZ、NPAOZ、NPSEM標準品溶液,用便攜式試紙條熒光讀數儀測出FIC、FIT值,以目標物濃度為橫坐標,FIT/FIC為縱坐標,得到該方法的標準曲線,檢出限定義為抑制率10%對應的NPAHD、NPAMOZ、NPAOZ、NPSEM濃度。

        1.3.5 FMICA方法特異性驗證

        選取硝基呋喃類獸藥原藥、代謝物、衍生物、結構類似物及其他常見獸藥,通過比較不同物質的FIT/FIC值,驗證方法特異性。

        1.3.6 實際樣品處理

        衍生:將實際樣品粉碎后均質,稱取1.0 g均質后的樣品于50 mL的離心管中,加入4 mL去離子水和0.5 mL 1 mol/L HCl溶液混勻。加入100 μL的鄰硝基苯甲醛溶液(50 mmol/L),混勻后置于60 ℃水浴反應3 h。

        萃?。喝〕鲅苌蟮臉悠芳尤? mL PBS和0.4 mL 1 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH值至中性,再加入5 mL乙酸乙酯,旋渦混勻30 s,于25 ℃、5 000 r/min離心10 min。取上層于玻璃試管中,50 ℃氮氣吹干,重懸于2 mL正己烷中,加入2 mL pH 7.4 PBS,振蕩混勻后,于25 ℃、5 000 r/min離心10 min,下層溶液備用。

        1.3.7 方法有效性驗證

        采用ELISA試劑盒驗證FMICA方法的有效性。

        1.4 數據分析

        2 結果與分析

        2.1 制備FMs-Ab時最佳抗體量的優(yōu)化

        按照1.3.1節(jié)方法,添加不同抗體量制備FMs-Ab,分別用pH 7.4 PBS、1 μg/L標準品溶液進行試紙條檢測。當試紙條C、T線FI一致且適中,靈敏度最理想時,抗體添加量即為最優(yōu)添加量。如圖2所示,在制備FMs-Ab復合物時,NPAHD、NPAMOZ、NPAOZ、NPSEM抗體量分別添加90、70、60、60 μg時,試紙條C、T線FI一致且適中,且T線FI明顯減弱,靈敏度較高,此時為最佳添加量。

        圖2 FMs-Ab制備中抗體添加量的優(yōu)化Fig. 2 Optimization of antibody dosage in the preparation of FMs-Ab

        2.2 樣品緩沖液的優(yōu)化

        樣品緩沖液為試紙條的檢測提供反應環(huán)境,其直接影響試紙條的靈敏度和準確性。本實驗分別選取pH 5.7、7.4、8.5的PB和PBS為樣品緩沖液進行試紙條檢測。如 圖3所示,樣品緩沖液為pH 7.4 PBS時,4 種試紙條C、T線的熒光強度一致且適中,效果最好,最終選擇pH 7.4 PBS為最佳樣品緩沖液。

        圖3 FMICA樣品緩沖液的優(yōu)化Fig. 3 Optimization of loading buffer used in FMICA

        2.3 二抗、包被原的最佳稀釋倍數和FMs-Ab最佳添加量的優(yōu)化

        4 種包被原(NPAHD-BSA、NPAMOZ-BSA、NPAOZ-BSA、NPSEM-BSA)分別稀釋70、50、20、100 倍,對應二抗分別稀釋50、30、70、50 倍,FMs-Ab分別添加5、3、5、3 μL時,AHD、AMOZ、AOZ、SEM熒光微球免疫層析試紙條FIT/FIC(空白)接近于1,且 (FIT/FIC(加標))/(FIT/FIC(空白))最?。ㄒ种坡首畲螅?,此時為最佳二抗、包被原稀釋倍數和FMs-Ab添加量。

        2.4 硝酸纖維素膜的優(yōu)化

        選擇Milllipore HF 90s、135s、140s共3 種硝酸纖維素膜進行優(yōu)化。如圖4所示,用Milllipore HF 90s硝酸纖維素膜上樣,C線FI適中,但其膜孔徑較大,層析過快,FMs-Ab與T線上的包被原未充分結合,導致T線FI太弱。用Millipore HF 140s硝酸纖維素膜上樣,C線FI適中,但其膜孔徑較小,層析緩慢,FMs-Ab與T線上的包被原過度結合,導致T線FI比C線強。最終選擇C、T線FI一致且適中、條帶清晰、無背景干擾的Millipore HF 135s硝酸纖維素膜。

        圖4 硝酸纖維素膜的優(yōu)化Fig. 4 Optimization of NC membrane

        2.5 試紙條檢測方法標準曲線和檢出限

        樣品緩沖液分別配制0、0.005、0.01、0.1、0.5、1、2、5 μg/L的NPAHD標準品溶液和0、0.01、0.05、0.1、1、2、5、10 μg/L的NPAMOZ、NPAOZ、NPSEM標準品溶液,進行試紙條檢測,得出標準曲線。AHD、AMOZ、AOZ、SEM熒光免疫層析試紙條FIT/FIC(y)與目標物質量濃度(x)的線性方程分別為:y=-0.249 06lgx+0.217 38(R2=0.990 49)、y=-0.222 41lgx+0.481 98(R2=0.990 79)、y= -0.215 89lgx+0.398 11(R2=0.992 32)、y=-0.240 88lgx+ 0.500 61(R2=0.991 14),線性均良好(R2>0.99)。檢出限分別為0.004、0.01、0.008、0.009 μg/L,檢測線性范圍分別為0.005~5、0.01~10、0.01~10、0.01~10 μg/L。

        2.6 特異性評價

        選取4 種硝基呋喃類藥物原藥、代謝物、結構類似物及其他常見獸藥進行方法特異性評價。添加質量濃度均為5 μg/L的 NPAHD、NPAMOZ、NPAOZ、NPSEM標準品,代謝物標準品質量濃度為100 μg/L,原藥質量濃度為100 μg/L,結構類似物、常見獸藥質量濃度均為1 000 μg/L,用便攜式試紙條熒光讀數儀測定得出結果,如圖5所示,AHD、AMOZ、AOZ、SEM熒光微球免疫層析試紙條分別對NPAHD、NPAMOZ、NPAOZ、NPSEM的FIT/FIC有較強響應,對代謝物和原藥響應較小,其原因為代謝物的衍生物、代謝物和原藥具有部分相似化學結構。其他結構類似物和常見獸藥沒有交叉反應,這些物質對檢測結果沒有影響。

        圖5 FMICA方法的交叉反應Fig. 5 Cross-reactivity of FMICA

        2.7 實際樣品的檢測與有效性驗證

        表2 實際樣品中AMOZ的回收率(n=3)Table 2 Recoveries of AMOZ in spiked samples (n= 3)

        表3 實際樣品中AOZ的回收率(n=3)Table 3 Recoveries of AOZ in spiked samples (n = 3)

        選取多寶魚、蝦作為實際樣品,將質量濃度分別為0、0.02、0.1、0.5、1 μg/L的4 種代謝物標準品分別添加到實際樣品中,用FMICA方法及商業(yè)化ELISA試劑盒進行檢測。其實測含量、回收率、變異系數(coefficient of variation,CV)結果如表1~4所示,FMICA方法測出AHD、AMOZ、AOZ、SEM回收率為75.88%~104.81%,CV為1.90%~10.61%,商品化ELISA試劑盒的添加回收率為81.89%~107.65%,CV為2.57%~7.29%。2 種方法檢測結果一致,證明FMICA方法準確性好,且FMICA方法能快速、簡單地實現對多寶魚、蝦中AHD、AMOZ、AOZ、SEM的定量檢測。

        表1 實際樣品中AHD的回收率(n=3)Table 1 Recoveries of AHD in spiked samples (n = 3)

        表4 實際樣品中SEM的回收率(n=3)Table 4 Recoveries of SEM in spiked samples (n = 3)

        3 結 論

        本研究采用FM納米材料作為信號標記物,基于抗原抗體的特異性結合作用,建立FMICA法用于定量檢測水產品中4 種硝基呋喃類獸藥代謝物的殘留。與儀器驗證方法相比,本研究建立的方法檢測時間更短、操作更簡單。與傳統(tǒng)ELISA方法相比,靈敏度更高、操作更簡單。與膠體金免疫層析檢測方法相比,本方法在保留快速、簡單的優(yōu)勢的同時,檢測靈敏度更高。實際樣品中硝基呋喃類獸藥含量的測定結果與商品化ELISA試劑盒的測定結果具有理想的一致性,因此本方法具有很好的準確性和實用性。此外,FM納米材料由于其優(yōu)良的光學特性,其作為信號標記物在建立食品中小分子危害物的高靈敏、快速定量檢測方法中具有良好的應用前景。

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