李國輝，班 楠，王道兵，常 迪，岳紅衛(wèi)，武竹英，鐘其頂,

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015；2.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，北京 101300）

苯甲酸及其鈉鹽是目前國際上應用最廣、用量最大的食品防腐劑[1]，GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》[2]中規(guī)定，苯甲酸及其鈉鹽可作為防腐劑，用于碳酸飲料、配制酒等22 類食品中，最大使用量范圍為0.2～2.0 g/kg（以苯甲酸計）。然而，在自然條件下，苯甲酸又是許多植物的次級代謝產(chǎn)物[3-8]。據(jù)食品添加劑聯(lián)合專家委員會（Joint FAO/WHO Expert Committeeon Food Additives，JECFA）報告，在谷物、蔬菜、水果、堅果、豆類等食品中天然存在一定量的苯甲酸，尤以漿果含量最高[1,5-6]。在雜食和食草動物的內(nèi)臟、肌肉以及乳類及其制品中也天然存在微量的苯甲酸。JECFA根據(jù)9 個國家提供的數(shù)據(jù)對苯甲酸鹽通過食物的攝入量進行了評估，其中醬油是我國居民苯甲酸鹽攝入的主要來源，澳大利亞、新西蘭、法國、英國和美國主要通過軟飲料攝入苯甲酸鹽[1]。

醬油是我國居民攝入苯甲酸的主要來源，GB 2760—2014中要求苯甲酸在醬油中的最大使用量為1.0 g/kg。在“健康中國2030”的大背景下，零添加醬油以其不添加外源物質(zhì)的創(chuàng)新特質(zhì)受到廣大消費者青睞。但從目前對于零添加醬油的調(diào)查結果看，醬油中存在微量的苯甲酸本底。由于醬油中允許添加外源苯甲酸，零添加醬油中是否存在人為添加苯甲酸的可能性，目前尚不明確，也給食品安全監(jiān)管部門以及相關生產(chǎn)企業(yè)帶來很大的困擾。為確保零添加醬油市場有序發(fā)展，解決醬油行業(yè)發(fā)展所面臨的微量苯甲酸以及市場監(jiān)管問題，本研究旨在明確醬油中內(nèi)源性微量苯甲酸的含量水平，闡明內(nèi)源性苯甲酸的生成途徑及變化規(guī)律，為零添加醬油的市場監(jiān)管提供基礎數(shù)據(jù)，支撐醬油行業(yè)有序發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油原料（小麥、大豆、水）和生產(chǎn)過程樣品：落黃（各原料經(jīng)前處理、混合后，剛進入發(fā)酵罐時的樣品）、過程油（發(fā)酵過程中壓榨抽提的醬油，第1次抽提簡稱為頭油，第2次抽提簡稱為二油、第3次抽提簡稱為三油）、醬油原油（簡稱為原油）以及部分零添加醬油預售品和成品采自某知名醬油企業(yè)，部分不同生產(chǎn)企業(yè)的常規(guī)醬油和零添加醬油購自超市。

苯丙氨酸（純度≥99.8%）、苯甲酸（純度≥ 99.8%）、甲醇（分析純）、乙腈（分析純） 上海安譜實驗科技股份有限公司；異硫氰酸苯酯（分析純） 美國Sigma公司；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、三乙胺、乙酸鈉、乙酸、鹽酸、正己烷（均為分析純） 北京化工廠有限責任公司；蔗糖（IAEA-CH-6，參考值（－10.449±0.2）‰） 國際原子能機構。

1.2 儀器與設備

2695高效液相色譜儀（配紫外檢測器） 美國Waters公司；3k15高速離心機 德國Sigma公司；ME104E萬分之一天平 瑞士梅特勒-托利多公司；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器 美國Scientific Industries 公司；1260 Infinity II制備液相色譜儀 美國安捷倫 公司；Flash 2000-Delta V元素分析儀-穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 苯甲酸含量測定

采用GB 5009.28—2016《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》[9]中液相色譜法進行。

1.3.2 苯丙氨酸含量測定

參考QB/T 4356—2012《黃酒中游離氨基酸的測定 高效液相色譜法》[10]進行測定。液體樣品取1.00 mL于10 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸定容至刻度（固體樣品粉碎或勻漿后取2.50 g于50 mL帶蓋離心管中，加入25 mL 0.1 mol/L鹽酸，超聲提取30 min，離心，取上清液500 μL），進行測定并定量。

1.3.3 苯甲醛含量測定

采用液相色譜法[11]，液體樣品取10 mL醬油樣品，50%甲醇溶液定容于50 mL容量瓶中（固體樣品粉碎或勻漿后取2.5 g于50 mL帶蓋離心管中，加入50%甲醇溶液，超聲提取30 min，離心），過0.22 μm濾膜后經(jīng)高效液相色譜測定。

色譜條件：C18色譜柱，柱溫30 ℃；流動相為甲醇-水（35∶65，V/V），流速0.8 mL/min；紫外檢測器，波長250 nm；進樣量20 μL。

1.3.4 樣品中苯甲酸穩(wěn)定碳同位素比值（δ13C）測定

采用GB 5009.28—2016[9]方法對樣品中苯甲酸進行提取，采用制備液相色譜儀對提取液中苯甲酸進行分離并收集，收集液經(jīng)冷凍干燥后使用100 μL 0.1 mol/L的鹽酸溶液進行復溶，復溶后的溶液經(jīng)元素分析儀-穩(wěn)定同位素比例質(zhì)譜儀分析苯甲酸的δ13C值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計分析，采用Origin 8.5 作圖。

2 結果與分析

2.1 醬油中苯甲酸的含量

在醬油生產(chǎn)企業(yè)采集不同批次的成品零添加醬油8 份，零添加醬油預售品8 份，醬油原油32 份，分別分析其苯甲酸含量，結果見表1。醬油原油中，苯甲酸含量范圍為7.52～14.44 mg/kg，均值為11.61 mg/kg；零添加醬油預售品中，苯甲酸含量范圍為9.43～17.09 mg/kg， 均值為13.31 mg/kg；市售零添加醬油成品中，苯甲酸含量范圍為12.53～14.23 mg/kg，均值為13.25 mg/kg； 在所有的48 份企業(yè)零添加原始樣品中，苯甲酸含量范圍為7.52～17.09 mg/kg，均值為12.72 mg/kg。 所有樣品中苯甲酸的檢出率為100%，表明在醬油生產(chǎn)過程中存在自然生成的微量苯甲酸，所有樣品中苯甲酸含量小于20 mg/kg，可初步認為醬油生產(chǎn)過程中微量苯甲酸的本底值或在20 mg/kg以內(nèi)，遠低于GB 2760—2014中對于醬油中苯甲酸最大使用量1 000 mg/kg。同樣參考GB 2760—2014中對于苯甲酸最大使用量要求，最低為碳酸飲料200 mg/kg，基本可以認為含量低于20 mg/kg不具備實際防腐能力。

表1 醬油中苯甲酸含量 Table 1 Benzoic acid concentration in soy sauce mg/kg

2.2 醬油生產(chǎn)過程中苯甲酸本底跟蹤分析

上述分析可知，醬油原油中存在微量苯甲酸，均值為10.17 mg/kg，由于是企業(yè)直接采樣，排除人為添加苯甲酸的可能，因此醬油原油中微量苯甲酸來源于生產(chǎn)過程。本研究系統(tǒng)分析醬油生產(chǎn)過程（原料、落黃、過程油）中苯甲酸的動態(tài)變化，結果見表2。

表2 醬油生產(chǎn)過程中苯甲酸含量跟蹤分析 Table 2 Analysis of benzoic acid content during the production process of soy sauce mg/kg

3 種原料中，大豆的苯甲酸含量最高，均值為14.57 mg/kg，小麥次之均值為7.58 mg/kg，釀造用水中未檢出苯甲酸。大豆和小麥中的苯甲酸應該為植物生長過程中的次生代謝產(chǎn)物，相關文獻已有報道[3,12-15]。大豆和小麥的苯甲酸均值為11.07 mg/kg，考慮醬油的實際生產(chǎn)，大豆用量遠高于小麥，按大豆用量90%計算，醬油生產(chǎn)過程中原料帶入的苯甲酸含量約為13.87 mg/kg，略高于醬油原油中苯甲酸的含量均值。認為醬油中微量苯甲酸主要來源于原料大豆和小麥帶入。

對醬油生產(chǎn)過程中落黃和過程油中苯甲酸含量進行跟蹤分析可知，落黃樣品中，苯甲酸含量范圍為7.11～21.94 mg/kg，均值為13.23 mg/kg，基本和原料中苯甲酸含量均值13.87 mg/kg一致；不同階段的過程油中苯甲酸含量范圍為7.36～16.00 mg/kg，均值為 12.08 mg/kg，略高于最終原油中苯甲酸的均值11.61 mg/kg， 接近于零添加醬油成品和預售品中苯甲酸均值13.31 mg/kg和13.25 mg/kg。

2.3 貯存時間對醬油中苯甲酸本底含量的影響

上述分析表明，醬油中存在微量的苯甲酸本底值，且預售零添加醬油和成品零添加醬油中苯甲酸含量略高于原油，分析可能為零添加醬油所選擇的過程油批次（頭油、二油、三油）不同以及醬油貯存階段苯甲酸會有微量增加。本實驗對不同生產(chǎn)日期的零添加醬油成品在不同模擬貨架期內(nèi)苯甲酸含量變化繼續(xù)測定分析，結果見圖1。

圖1 不同貨架期的零添加醬油中苯甲酸含量變化Fig. 1 Changes in the content of benzoic acid in zero-additive soy sauce with different shelf lives

不同生產(chǎn)日期以及貨架期零添加醬油產(chǎn)品的苯甲酸含量，隨貯藏時間延長呈略有增加的趨勢，表明除發(fā)酵過程中苯甲酸產(chǎn)生之外，在醬油的貯存（或貨架）期過程中，同樣存在微量苯甲酸的生成，也表明醬油中存在一定量的苯甲酸前體物質(zhì)。

2.4 醬油中微量苯甲酸前體物質(zhì)分析

綜合目前關于食品中苯甲酸來源的文獻報道[16-18]，其主要分為4 個途徑：1）食品加工原料中帶入；2）食品中馬尿酸水解生成苯甲酸和甘氨酸；3）苯丙氨酸降解為苯甲酸和肉桂酸；4）苯甲醛氧化生成苯甲酸。結合上述分析結果，醬油原油中微量苯甲酸絕大部分來源于原料帶入，在貯存過程中某種前體物質(zhì)會緩慢轉(zhuǎn)化為微量苯甲酸。依據(jù)醬油的實際生產(chǎn)工藝與產(chǎn)品特點，該類前體物質(zhì)可能為苯丙氨酸和苯甲醛。

2.4.1 醬油生產(chǎn)過程中苯丙氨酸含量分析

本實驗優(yōu)化QBT 4356—2012測定醬油樣品中苯丙氨酸的方法，方法分離度良好（圖2），在5.16～206.5 mg/L 線性范圍內(nèi)，線性方程為y=28 115x－5 879，R2=0.999 9，平均回收率為92.5%（表3），方法穩(wěn)定性相對標準偏差為1.42%（表4）。

表3 醬油中苯丙氨酸回收率測定Table 3 Recoveries of phenylalanine in spiked soy sauce

表4 醬油中苯丙氨酸測定重復性分析Table 4 Repeatability for phenylalanine in soy sauce

圖2 高效液相色譜測定醬油中苯丙氨酸色譜圖Fig. 2 HPLC chromatogram of phenylalanine in soy sauce

落黃、過程油、原油、零添加醬油預售品以及成品零添加醬油中苯丙氨酸含量，見圖3。其中落黃樣品中苯丙氨酸平均含量為4 071.5 mg/kg，過程油中游離苯丙氨酸平均含量為3 244.4 mg/kg，原油中游離苯丙氨酸平均含量為4 238.5 mg/kg，零添加醬油預售品中平均游離苯丙氨酸含量為3 854.5 mg/kg，零添加醬油成品中游離苯丙氨酸平均含量為3 759.7 mg/kg。上述對于醬油中苯丙氨酸的測定結果與文獻報道結果相接近[12-14]。根據(jù)苯丙氨酸的含量水平以及苯甲酸可能生成途徑（圖4），苯丙氨酸可能為醬油中苯甲酸的前體物質(zhì)。

圖3 醬油生產(chǎn)過程中苯丙氨酸含量跟蹤分析Fig. 3 Analysis of phenylalanine content during the production process of soy sauce

圖4 苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為苯甲酸途徑示意圖Fig. 4 Schematic diagram of the transformation of phenylalanine to benzoic acid

2.4.2 醬油生產(chǎn)過程中苯甲醛含量分析

苯甲酸的另一生成途徑為苯甲醛的氧化途徑（圖5）。 本研究建立了醬油中苯甲醛測定方法，方法分離度良好（圖6），在0.25～5 mg/L線性范圍內(nèi)，方法線性相關系數(shù)為0.999 6，方法定量限（RSN=10）為0.2 mg/L，加標回收率實驗結果見表5，平均回收率為90.6%。

表5 醬油中苯甲醛測定方法回收率Table 5 Recoveries of benzaldehyde in soy sauce

圖5 苯甲醛轉(zhuǎn)化為苯甲酸途徑示意圖Fig. 5 Schematic diagram of the transformation of benzaldehyde to benzoic acid

圖6 醬油中添加苯甲醛液相色譜圖Fig. 6 HPLC chromatogram of different concentrations of benzaldehyde added in soy sauce

所有醬油原料、生產(chǎn)過程樣品以及原油樣品中均未檢出苯甲醛，因此確定苯甲醛不是醬油中苯甲酸生成的前體物質(zhì)。

2.4.3 醬油中苯丙氨酸對苯甲酸的貢獻率分析

結合不同生產(chǎn)日期的零添加成品醬油在實驗室存放5 個月貨架期數(shù)據(jù)，成品零添加醬油在貨架期內(nèi)苯甲酸的年增加率為10.30%～18.83%，年增加量為1.58～ 1.99 mg/kg，平均年增加率14.26%（表6）。因此，苯丙氨酸對醬油中苯甲酸具有一定的貢獻率。

表6 醬油中苯甲酸含量貨架期變化分析Table 6 Change in benzoic acid content in soy sauce during shelf life

2.5 醬油生產(chǎn)過程中苯甲酸13C穩(wěn)定同位素分析

穩(wěn)定同位素技術在鑒別天然/外源添加物質(zhì)中具有重要應用，化合物的最初碳源均來自植物光合作用固定的CO2，因光合作用類型差異使得不同來源的有機物存在碳同位素差異。來源于同一原料的化合物，理論上其13C穩(wěn)定同位素豐度值應與原料特征一致（同位素分餾效應會有微小影響）[19-23]。如果醬油中苯甲酸與原料中的苯甲酸13C豐度值一致，也可證明醬油中苯甲酸主要來源于原料帶入。

本實驗通過制備液相色譜儀將各樣品中苯甲酸分離制備，收集液經(jīng)冷凍干燥后溶解進元素分析-同位素比率質(zhì)譜分析測定。元素分析儀經(jīng)IAEA-CH-6蔗糖標準品進行校正，選取一個醬油樣品和一個大豆樣品重復處理5 次，分析測定方法穩(wěn)定性，苯甲酸δ13C測定的標準偏差分別為0.14‰和0.13‰，滿足測定要求，結果見表7。醬油生產(chǎn)過程中苯甲酸δ13C值變化情況如圖7所示，大豆中苯甲酸δ13C值為－27.36‰，小麥中苯甲酸δ13C值為－27.76‰，因為大豆和小麥均屬于C3植物，這一特征符合C3植物的穩(wěn)定碳同位素特征，也說明大豆和小麥中苯甲酸來源于自身次級代謝。落黃中苯甲酸δ13C均值為－26.43‰，而過程樣品以及原油、成品醬油中苯甲酸δ13C值均在－25‰附近，均值為－25.57‰。苯甲酸值在落黃和發(fā)酵產(chǎn)油過程中可能出現(xiàn)同位素分餾現(xiàn)象，導致苯甲酸δ13C值有微小偏正，但整體處于C3植物δ13C特征范圍內(nèi)（－36.00‰～－22.00‰）[24-26]，表明醬油中微量苯甲酸來源于原料帶入。

表7 苯甲酸δ13C測定重復性分析Table 7 Repeatability for benzoic acid δ13C‰

圖7 醬油生產(chǎn)過程中苯甲酸δ13C跟蹤分析Fig. 7 Analysis of benzoic acid δ13C during the production of soy sauce

2.6 市售醬油中苯甲酸含量分析

從超市分別購置7 份不同品牌的常規(guī)醬油（CG）和不同品牌的零添加醬油（LTJ），分析不同醬油之間苯甲酸含量差異，結果見表8。其中，常規(guī)醬油中苯甲酸含量均值為462.87 mg/kg，與文獻報道結果相近[27-33]，含量均小于GB 2760—2014規(guī)定的最大使用量1 000 mg/kg，零添加醬油中苯甲酸含量均值為13.38 mg/kg，遠低于常規(guī)醬油，與上述對于醬油中苯甲酸含量本底值分析結果一致。

表8 不同醬油之間苯甲酸含量差異Table 8 Benzoic acid contents in regular and zero-additive soy sauce

3 結 論

本實驗對醬油中微量苯甲酸本底含量以及溯源進行研究，系統(tǒng)分析了醬油生產(chǎn)以及貯存過程中苯甲酸含量變化。結果表明：1）醬油中苯甲酸本底值為7.52～17.09 mg/kg，均值為12.72 mg/kg，且苯甲酸的檢出率為100%；2）醬油中微量苯甲酸本底主要來源于原料帶入；3）在貯存或貨架期階段，苯丙氨酸的降解致使醬油中苯甲酸含量呈緩慢增加的趨勢，平均年增加率為14.26%、年增加量為1.80 mg/kg。本研究闡明了醬油中內(nèi)源性苯甲酸本底值與生成途徑，將為零添加醬油的市場監(jiān)管提供基礎數(shù)據(jù)，為醬油行業(yè)有序發(fā)展提供基礎支撐。