馬 芳 ，錢 成 ，肖風(fēng)麗 ，2*

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)科研實驗中心，安徽 合肥 230032；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚研究所和皮膚科，安徽 合肥 230032）

細胞培養(yǎng)技術(shù)是現(xiàn)代生物與醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域的基礎(chǔ)技術(shù)及基本技能，也是細胞工程、基因工程和生物醫(yī)學(xué)工程的重要研究手段[1]。細胞培養(yǎng)室是進行細胞相關(guān)研究活動的重要場所，是生物與醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域科研產(chǎn)出的重要平臺，高效和科學(xué)的管理是細胞培養(yǎng)室正常運行的重要保障[2]。細胞培養(yǎng)室在生物與醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域具有重要的地位，但由于細胞培養(yǎng)需要無菌操作，有別于其他實驗室[3-4]，這為制定統(tǒng)一的細胞培養(yǎng)室管理標(biāo)準(zhǔn)增加了難度。目前，各大細胞培養(yǎng)實驗平臺按照無菌操作的要求并結(jié)合自身的實際情況與發(fā)展目標(biāo)實現(xiàn)對細胞培養(yǎng)室的管理。安徽醫(yī)科大學(xué)科研實驗中心細胞培養(yǎng)實驗平臺對運行中遇到的各種管理問題進行不斷探索、改善，從而積累了一些經(jīng)驗。本文從其實際經(jīng)驗出發(fā)主要探討細胞培養(yǎng)室制度建設(shè)、環(huán)境管理以及安全管理等問題，并對制度建設(shè)以及環(huán)境管理進行重點闡述。

1 制度建設(shè)

1.1 準(zhǔn)入制度

申請使用細胞培養(yǎng)室的學(xué)生不限專業(yè)和年級，細胞實驗技能的差異性較大，如一名學(xué)生操作不當(dāng)可能造成整個培養(yǎng)室環(huán)境污染，這是細胞培養(yǎng)室管理上的一個難題。為此，本平臺制訂了準(zhǔn)入制度及準(zhǔn)入流程，如圖1所示。所有申請使用細胞培養(yǎng)室的人員均要接受培訓(xùn)，培訓(xùn)內(nèi)容包括實驗室安全、各項制度、細胞培養(yǎng)基礎(chǔ)理論、細胞培養(yǎng)實際操作和儀器使用。通過理論講解讓學(xué)生初步了解細胞培養(yǎng)的概念、原理及應(yīng)用；通過細胞培養(yǎng)的教學(xué)視頻讓學(xué)生充分了解細胞培養(yǎng)的操作步驟及注意事項；通過實際操作能夠讓學(xué)生掌握細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)；在學(xué)生培訓(xùn)過程中，強調(diào)無菌的重要性，幫助其樹立無菌觀念[5]，并注重人才培養(yǎng)，在培訓(xùn)學(xué)生掌握基本實驗技術(shù)的同時，注重培養(yǎng)學(xué)生嚴謹?shù)目蒲兴季S和素養(yǎng)，有利于其實驗的開展[5]。培訓(xùn)結(jié)束后的考核分理論與實際操作，考核合格后進入過渡間實習(xí)1個月，過渡間是僅用于實習(xí)的專用細胞培養(yǎng)室，主要目的是不影響其他人實驗，并完成對考核合格者技術(shù)掌握程度的評價。實習(xí)期未違規(guī)違紀(jì)，未出現(xiàn)污染方能長期使用細胞培養(yǎng)室。

圖1 細胞培養(yǎng)室準(zhǔn)入流程

1.2 預(yù)約制度

本細胞培養(yǎng)室內(nèi)的每臺生物安全柜均安裝有智能化預(yù)約終端，同時制定了預(yù)約制度：使用人員一般提前一天預(yù)約生物安全柜的使用時段，并簡單描述實驗內(nèi)容，經(jīng)審核通過使用。如實驗開始時間前后15 min未刷開儀器或使用時間超過預(yù)約時長，或使用時長不超過預(yù)約時長的一半，系統(tǒng)會自動扣除個人的信用分，如能按預(yù)約完成一次實驗，系統(tǒng)會自動加分，信用分低于一定分值將不能預(yù)約。預(yù)約制度保證了每臺生物安全柜在每個時段僅一人使用，可以促使學(xué)生規(guī)劃好實驗流程，保證細胞培養(yǎng)平臺高效運行，同時系統(tǒng)也記錄學(xué)生的使用信息，以便于查詢和統(tǒng)計。

1.3 儀器使用制度

為實現(xiàn)細胞培養(yǎng)室內(nèi)儀器規(guī)范化管理，保證儀器高效運轉(zhuǎn)，本平臺制定了儀器使用制度，主要內(nèi)容包括以下幾點：（1）細胞培養(yǎng)箱和冰箱劃分區(qū)域，不允許擅自動用他人細胞或物品；（2）培養(yǎng)箱與冰箱的門打開時間不能過長，必須及時關(guān)閉；（3）使用人員發(fā)現(xiàn)儀器故障，立即告知專責(zé)教師；（4）每天的值日生須查看氣瓶壓力表以及培養(yǎng)箱顯示屏，發(fā)現(xiàn)異常須告知專責(zé)教師；（5）所有儀器須嚴格按照使用說明進行操作，不能隨意更改參數(shù)；（6）實驗結(jié)束后，離心機、細胞計數(shù)儀、生物安全柜和顯微鏡等儀器須關(guān)閉開關(guān)。

1.4 液氮罐的使用及細胞凍存制度

細胞凍存與細胞復(fù)蘇是細胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵技術(shù)，液氮罐是用來長期儲存細胞最常用的設(shè)備[6]。本平臺制定了液氮罐的使用及細胞凍存制度。主要內(nèi)容包括以下幾條：（1）液氮容量的查看以及訂購由專責(zé)教師負責(zé)，保證液氮罐內(nèi)始終含有足夠的液氮維持細胞活力；（2）按照第幾桿—第幾層—第幾排—第幾列將液氮罐內(nèi)的每一個凍存位置進行編號，同時凍存管上標(biāo)記細胞名稱以及時間，將凍存管放入液氮罐時一定要在存放記錄本上登記每個凍存管的細胞名稱、放入的具體位置、時間以及存放人等信息，方便復(fù)蘇細胞時查找；（3）存取細胞時須穿戴好液氮罐室配備的專用護目鏡和手套，并速存速取，防止凍存管爆炸給操作人員帶來的傷害，保障操作者的安全。

2 環(huán)境管理

細胞培養(yǎng)室的環(huán)境對細胞培養(yǎng)實驗有著非常關(guān)鍵性的影響，良好的環(huán)境對實驗的順利進行具有促進作用，不良的環(huán)境可能會導(dǎo)致細胞死亡或細胞污染等，不僅造成了科研資源的浪費，而且會耽誤實驗進程[7]。因此，細胞培養(yǎng)室的環(huán)境如何管理是每個細胞培養(yǎng)室都必須重點考慮的問題。細胞培養(yǎng)室的環(huán)境管理可分為細胞污染預(yù)防和細胞污染處理。

2.1 細胞污染預(yù)防

細胞污染預(yù)防主要通過環(huán)境衛(wèi)生管理和儀器設(shè)備維護來實現(xiàn)，環(huán)境衛(wèi)生管理主要是通過每日值日和定期大掃除來完成。每日值日是通過安排并監(jiān)督每日的值日生對桌面、生物安全柜的臺面以及各個儀器的表面進行清理并殺菌消毒；定期大掃除是定期對細胞培養(yǎng)室內(nèi)的桌面、柜子、儀器、地面以及各死角進行清理并殺菌消毒。儀器設(shè)備維護主要是指定期檢查、更換細胞培養(yǎng)室高效過濾系統(tǒng)、生物安全柜的過濾器、紫外燈管等設(shè)備配件，以及定期檢查液氮罐和超低溫冰箱等細胞存儲設(shè)備，確保設(shè)備能夠正常運行[3]。

2.2 細胞污染處理

細胞污染是指混入細胞培養(yǎng)環(huán)境中，對細胞生存有害的成分和造成細胞不純的異物[8]。學(xué)生在進行細胞培養(yǎng)實驗時，可能因操作不規(guī)范或?qū)嶒炍锲窚缇粡氐椎仍斐杉毎廴綶9]。輕則導(dǎo)致污染細胞廢棄，重則連帶污染培養(yǎng)箱內(nèi)其他細胞甚至整個實驗室環(huán)境，給科研工作帶來嚴重的損失和威脅[10]。因此，了解細胞污染類型并及時進行檢測鑒別，從而清除污染，是成功培養(yǎng)細胞的重要因素。本平臺針對細菌污染[11]、真菌污染[10]、支原體污染[12]、“黑膠蟲”污染[13]這4類常見的細胞污染總結(jié)了較為實用的檢測鑒別方法和清除步驟，見表1。

表1 細胞污染鑒別與清除

3 安全管理

細胞培養(yǎng)室存在多種危險因素，除常見的幾種（如消防水電、危險化學(xué)品和有毒有害廢棄物）以外，還包括高壓滅菌鍋、紫外線、液氮、二氧化碳氣瓶等。這些危險因素如若管理不當(dāng)可能造成人員傷亡、儀器設(shè)備損壞及環(huán)境污染。為了實驗操作人員的人身安全、儀器設(shè)備安全以及環(huán)境保護，細胞培養(yǎng)室必須加強安全管理。針對以上危險因素，細胞培養(yǎng)室的管理人員須定期檢查電路、水管及儀器狀態(tài)，及時消除安全隱患[14]；危險化學(xué)品須儲存于?；裰校浯嫒∮蓪Ｈ斯芾?，并做好相關(guān)登記；實驗人員須及時按照相關(guān)的規(guī)定對實驗廢棄物進行無害化處理，避免造成人員感染和環(huán)境污染；高壓滅菌鍋的操作人員須通過特種設(shè)備培訓(xùn)，并持有相關(guān)證書；禁止使用年檢不合格的高壓滅菌鍋；紫外燈照射時間須控制在適當(dāng)范圍，既能殺菌消毒，也能避免產(chǎn)生過多臭氧而危害實驗人員健康；細胞凍存和復(fù)蘇須遵守以上“液氮罐的使用及細胞凍存制度”，避免液氮給操作人員造成的傷害；二氧化碳氣瓶須置于氣瓶固定架，并將安全鏈條扣好，防止氣瓶傾倒、噴射以及爆炸等造成事故。