吳瀟蕓,鄭盛鋒,張明津,付偉金△

1廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院(廣西南寧 530023)；2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科(廣西南寧 530022)

華蟾素(bufalin)是傳統(tǒng)中藥蟾蜍皮膚中提取的有效成分，是一種類地高辛類物質(zhì)[1]。研究證實(shí)華蟾素可促進(jìn)胃癌、肝癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖及細(xì)胞侵襲性，發(fā)揮抗腫瘤活性[2-4]。近年發(fā)現(xiàn)華蟾素不僅抑制泌尿系腫瘤中如膀胱癌、前列腺癌細(xì)胞增殖[5-6]，還可抑制腎癌細(xì)胞增殖和侵襲[7]，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路已被證實(shí)與腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲密切相關(guān)。Gai等[8]證實(shí)華蟾素可下調(diào)Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移。目前不清楚華蟾素抑制腎癌細(xì)胞增殖和侵襲，是否與調(diào)控Wnt /β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究開展于2019年1—12月，擬探討華蟾素抑制腎癌細(xì)胞侵襲和增殖可能相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎癌細(xì)胞786-0購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫；華蟾素購自美國Invitrogen公司，RPMI 1640 細(xì)胞培養(yǎng)液、10%胎牛血清購自杭州四季青公司；單克隆抗體Wnt購自美國cell signaling公司；β-catenin(ab32572)，E-cadherin(ab1416)，N-cadherin(ab76011)，Vimentin(ab92547)，內(nèi)參GAPDH購自英國Abcam公司；流式細(xì)胞試劑盒，CCK-8試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 腎癌786-0細(xì)胞在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將處于對數(shù)生長期的腎癌細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，華蟾素組添加華蟾素；對照組添加等量的PBS。本細(xì)胞實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號：2017-KY-102)。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取處于對數(shù)生長期的腎癌細(xì)胞，調(diào)整濃度為5×103·mL-1，置于96孔板培養(yǎng)，用不同濃度的華蟾素(0、10、20、50、100、200 nmol/L)添加于腎癌細(xì)胞，分別于培養(yǎng)24、48、72 h后將10 μL CCK-8試劑添加各組腎癌細(xì)胞中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱共培養(yǎng)1 h，多功能掃描自動(dòng)閱讀儀檢測吸光度(OD)值，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 華蟾素添加于腎癌細(xì)胞48 h后，加入無血清培養(yǎng)基，在Transwell上室及下室分別加入濃度為5×104·mL-1的細(xì)胞懸液和含10%胎牛血清的培養(yǎng)液；培養(yǎng)48 h后，將樣本進(jìn)行PBS洗滌，95%酒精固定，0.1%結(jié)晶紫染色。每組選取至少4個(gè)隨機(jī)視野計(jì)數(shù)穿出細(xì)胞觀察照相(200×)，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 華蟾素添加于腎癌細(xì)胞48 h后，將腎癌細(xì)胞移到6孔板培養(yǎng)，當(dāng)每孔鋪滿90%細(xì)胞時(shí)，用200 μL加樣槍頭，進(jìn)行劃痕損傷，每孔劃痕1次，48 h后，使用倒置顯微鏡，隨機(jī)選5個(gè)區(qū)域劃痕面進(jìn)行拍照 (×100)，根據(jù)細(xì)胞間距計(jì)算遷移率。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 將腎癌細(xì)胞2×105·mL-1接種在6孔板中，華蟾素添加于腎癌細(xì)胞48 h后。PBS洗滌細(xì)胞2次，取100 μL細(xì)胞懸液(加入1×Binding Buffer結(jié)合緩沖液制成1×106細(xì)胞/mL的懸液)。加入AnnexinV與核酸染料各1 μL后輕輕混勻，室溫避光處放置15 min。再加入1×Binding Buffer 結(jié)合緩沖液80 μL 1 h內(nèi)上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡。胰酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。PBS清洗細(xì)胞，離心去除PBS，加入70%乙醇，4℃冰浴過夜。1 000 r/min×5 min，棄去固定液，PBS清洗細(xì)胞2次。用1 mL PI染液重懸細(xì)胞，4℃避光30 min，上機(jī)檢測細(xì)胞周期。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.7 免疫蛋白印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn) 華蟾素添加于腎癌細(xì)胞48 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白，每孔上40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后添加一抗(Wnt、β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin濃度分別為1∶300、1∶500、1∶50、1∶5 000、1∶1 000)，4℃過夜。洗滌后加二抗室溫孵育2 h，洗滌，DAB顯色，成像，GAPDH作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 華蟾素可抑制腎癌細(xì)胞增殖 CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，不同濃度華蟾素(0、10、20、50、100、200 nmol/L)作用于腎癌細(xì)胞24、48、72 h后，隨著濃度增加，腎癌細(xì)胞增殖率顯著下降(圖1)，呈劑量和時(shí)間依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。華蟾素劑量(10～100 nmol/L)都有抑制作用，而到了200 nmol/L，細(xì)胞增殖明顯下降，隨后的實(shí)驗(yàn)使用100 nmol/L濃度的華蟾素，因?yàn)樗鼘σ种颇I癌細(xì)胞增殖最有效。

注：*與對照組比較P<0.05圖1 華蟾素對腎癌細(xì)胞增殖力的影響

2.2 華蟾素可抑制腎癌細(xì)胞侵襲 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組(344±35.56)個(gè)/視野細(xì)胞相比，華蟾素組(207±10.12)個(gè)/視野細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，見圖2、表1。

2.3 華蟾素可抑制腎癌細(xì)胞遷移 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組相比，華蟾素組腎癌細(xì)胞遷移率下降,組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3、表1。

表1 華蟾素對腎癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

2.4 華蟾素可促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，與對照組相比，華蟾素組腎癌細(xì)胞凋亡率增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對照組G1、S細(xì)胞周期與華蟾素組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，G2/M細(xì)胞周期與華蟾素組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表2。

表2 華蟾素對腎癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

注：A：對照組；B:華蟾素組圖2 華蟾素對腎癌細(xì)胞侵襲力的影響(光鏡，×100)

注：A:流式細(xì)胞檢測各組腎癌細(xì)胞凋亡；B:流式細(xì)胞檢測各組腎癌細(xì)胞周期情況圖4 華蟾素對腎癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

2.5 華蟾素對Wnt/β-catenin和上皮間質(zhì)變(EMT)的影響 與對照組相比，華蟾素組中Wnt、β-catenin蛋白表達(dá)下調(diào) (P<0.05)，同時(shí)EMT信號通路E-cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，見圖5～6、表3。

表3 華蟾素對相關(guān)表達(dá)蛋白的影響

圖5 Western blot 檢測Wnt和β-catenin蛋白表達(dá)

3 討論

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤，約占成人惡性腫瘤的3%[9]。2020年美國預(yù)計(jì)新診斷RCC患者63 920例，13 680例患者死亡[10]。早期或局限性RCC患者可通過手術(shù)獲得治愈，晚期或轉(zhuǎn)移期RCC患者預(yù)后不佳，5年總生存率(OS)<10%，明確RCC侵襲及轉(zhuǎn)移機(jī)制對于提高患者OS至關(guān)重要。

研究已證實(shí)華蟾素可抑制泌尿系腫瘤細(xì)胞如前列腺癌、膀胱癌等的增殖和侵襲，但對華蟾素對腎癌細(xì)胞的相關(guān)研究少見。與Xie等[7]研究結(jié)果相似，本研究使用不同濃度的華蟾素作用于腎癌細(xì)胞后，可抑制腎癌細(xì)胞增殖，以100 nmol/L濃度抑制效率最佳。Transwell侵襲試驗(yàn)和細(xì)胞遷移證實(shí)，華蟾素可抑制腎癌細(xì)胞細(xì)胞侵襲和遷移的能力。流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明華蟾素可促進(jìn)腎癌細(xì)胞凋亡，阻滯腎癌細(xì)胞周期，以上研究結(jié)果提示，華蟾素抑制腎癌細(xì)胞增殖可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。

Xie等[7]研究發(fā)現(xiàn)華蟾素可調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制腎癌細(xì)胞的增殖和侵襲，提示調(diào)控腫瘤細(xì)胞信號通路可能是治療RCC的有效策略。但腫瘤的發(fā)生及發(fā)展非常復(fù)雜，可能涉及多個(gè)信號通路。Wnt/β-catenin是由配體蛋白質(zhì)Wnt和膜蛋白受體結(jié)合激發(fā)的一組多下游通道的信號通路，包括Wnt蛋白家族、糖原合成激酶3β(GSK-3β)、APC、Axin、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)等多個(gè)關(guān)鍵蛋白，該信號通路已證實(shí)與惡性腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)[11-13]，該信號通路增強(qiáng)后可與細(xì)胞膜受體結(jié)合，并將信號傳遞給β-catenin，蓄積的β-catenin可進(jìn)一步發(fā)揮調(diào)控通路下游蛋白和靶基因功能,并可影響EMT[14]。

EMT與腫瘤細(xì)胞包括腎癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[15]。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，上皮細(xì)胞標(biāo)記物如E-cadherin下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin上調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[16-17]。目前不清楚華蟾素抑制腎癌細(xì)胞增殖和侵襲是否與調(diào)控Wnt /β-catenin通路后、影響EMT相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，華蟾素作用于腎癌細(xì)胞后，下調(diào)Wnt /β-catenin信號通路中關(guān)鍵蛋白Wnt和β-catenin表達(dá)，上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)N-cadherin和Vimentin表達(dá)，逆轉(zhuǎn)EMT。本研究推測華蟾素作用腎癌細(xì)胞后，可調(diào)控Wnt /β-catenin信號通路，導(dǎo)致該通路重要蛋白Wnt和β-catenin表達(dá)下調(diào)后，對腎癌細(xì)胞EMT起抑制作用，從而降低腎癌細(xì)胞侵襲及遷移力，這可能是華蟾素抑制腎癌細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制。

綜上所述，本研究推測華蟾素可能通過抑制腎癌細(xì)胞中的Wnt /β-catenin信號通路中重要蛋白Wnt、β-catenin表達(dá)后，逆轉(zhuǎn)EMT，表現(xiàn)為E-cadherin上調(diào)，N-cadherin、Vimentin表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而抑制腎癌細(xì)胞增殖和侵襲，提示華蟾素有可能成為治療RCC的新策略。但腎癌細(xì)胞的侵襲力及EMT的調(diào)控可能涉及多個(gè)信號通路及上游信號分子，因此仍需要進(jìn)一步研究明確華蟾素調(diào)控腎癌細(xì)胞侵襲及EMT的具體機(jī)制。