劉雨，呂冬梅，薛婷，丑曉華，高杏△

重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）患者是侵襲性真菌感染（invasive fungal infections，IFI）的高發(fā)人群，且ICU患者IFI 的病死率較高，僅次于血液系統(tǒng)腫瘤患者［1］。ICU患者病情危重復(fù)雜、有創(chuàng)性治療手段的應(yīng)用、廣譜抗菌藥物的使用、合并各種基礎(chǔ)疾病及激素與免疫抑制劑的使用等都是IFI 的高危因素。目前臨床應(yīng)用較多的抗真菌藥物為三唑類伏立康唑，但在使用過程中發(fā)現(xiàn)不同患者的治療效果存在較大差異，相同劑量治療效果參差不齊且部分患者出現(xiàn)嚴(yán)重程度不一的不良反應(yīng)［2-3］。酪氨酸激酶2（Janus kinase 2，JAK2）作為JAK 家族的重要一員，在細(xì)胞信號通路傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖與凋亡及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，JAK2 基因突變則可能對上述過程產(chǎn)生影響［4-5］。有文獻(xiàn)報(bào)道，JAK2 rs10119004 基因多態(tài)性與真菌角膜炎患者體內(nèi)伏立康唑血藥濃度存在相關(guān)性［6-8］，但該研究結(jié)論未在ICU肺部真菌感染或其他部位感染患者中得到證實(shí)。本研究以ICU 中IFI 患者為研究對象，分析JAK2 rs10119004位點(diǎn)基因型對伏立康唑血藥濃度的影響，為臨床個(gè)體化治療提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019 年1 月—2020 年1 月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診ICU 臨床診斷為IFI 的患者70 例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參見《重癥患者侵襲性真菌感染診斷與治療指南》［9］。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡≥18歲。（2）使用伏立康唑治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）用藥之前已明確存在中重度腎功能損害（內(nèi)生肌酐清除率≤50 mL/min）。（2）重度肝功能異常（丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶超出正常值3倍，或Child-Pugh評分≥10分）。（3）同時(shí)服用與伏立康唑產(chǎn)生相互作用的藥物（如奧美拉唑）。（4）伏立康唑禁忌證。（5）使用伏立康唑少于3 d。（6）使用除伏立康唑外其他抗真菌藥物（如泊沙康唑）。伏立康唑給藥方案：首日 6 mg/kg 體質(zhì)量，每 12 h 靜脈注射或鼻飼給藥 1 次；第 2 日起調(diào)整劑量為4 mg/kg 體質(zhì)量，用法用量不變。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批件號：XYFY2019-KL044-01），取得全部患者知情同意。

1.2 血藥谷濃度（Cmin）檢測

1.2.1 檢測儀器 美國Thermo 公司TSQ Quantum Ultra 三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；日本島津LC-10AD VP 高效液相色譜儀。

1.2.2 色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱：Thermo C18 柱；預(yù)柱為securityGuard C18 保護(hù)柱；流動(dòng)相為乙腈-0.1%的甲酸水溶液（體積比為80∶20）；流速為0.2 mL/min，柱溫為20 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧（electrospray ionization，ESI）離子源，掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）。源噴霧電壓4.2 kV，加熱毛細(xì)管溫度280 ℃。鞘氣（N2）壓力為3 MPa，輔助氣（NS2）壓力為0.5 MPa，碰撞氣（Ar）壓力為0.133 Pa；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為伏立康唑m/z350→281（碰撞電壓18 eV）和內(nèi)標(biāo)氟康唑m/z307→238（碰撞電壓18 eV）。于用藥第3 日清晨采集患者空腹靜脈全血2 mL。取5 μL 處理血樣進(jìn)樣分析。

1.3 基因型檢測

1.3.1 檢測儀器 美國Applied Biosystems 公司PCR 擴(kuò)增儀（ABI 2720型），北京六一儀器廠電泳儀（DYY-7C），上海復(fù)日科技有限公司FR-100凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.3.2 基因分型 取剩余靜脈血，按照核酸提取試劑盒（上海百敖科技股份有限公司，批號20190321）說明提取樣本DNA，對樣本進(jìn)行PCR，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后驗(yàn)證有目標(biāo)產(chǎn)物，然后以Sanger 測序方法進(jìn)行測序（由上海生工生物工程有限公司完成）。JAK2 rs10119004基因引物：上 游 5′-AGTCAGGTGGTGAGGGTTGAT-3′，下 游 5′-AGTTACCTGGCCACTCTGTTT-3′，產(chǎn)物大小985 bp。擴(kuò)增體系50 μL：2×PCR Master 25 μL，DNA 模板 1.0 μL，上、下游引物各 1.0 μL，ddH2O 22 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 30 s，62 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，循環(huán) 30 次；72 ℃延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳與DNA Marker 條帶對比來判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小。

1.4 伏立康唑療效觀察指標(biāo)及不良反應(yīng)判定 收集患者性別、年齡、身高、體質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)（BMI），檢測白蛋白水平。肝功能異常及其他不良反應(yīng)的判定依據(jù)常見不良事件評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（common terminology criteria for adverse events，CTCAE）［10］。發(fā)生以下情況認(rèn)定為肝功能異常：（1）肝功能正常者使用伏立康唑后肝損傷大于3級的患者。（2）基礎(chǔ)肝功能損傷為2 級患者，使用伏立康唑后肝功能損傷大于4 級者。神經(jīng)毒性及其他不良反應(yīng)包括：視覺障礙、精神障礙和皮疹等。使用伏立康唑治療結(jié)果的有效或無效參考《重癥患者侵襲性真菌感染診斷與治療指南》［9］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，正態(tài)分布計(jì)量資料采用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布資料用M（P25，P75）表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。采用χ2檢驗(yàn)分析不同基因型患者伏立康唑療效和不良反應(yīng)的發(fā)生率；多重線性回歸分析伏立康唑Cmin的影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料 共納入患者70 例，其中男48例，女22 例，平均年齡（64.0±16.2）歲；體質(zhì)量（61.9±8.9）kg。靜脈滴注18 例，鼻飼給藥52 例；肺部感染58例（82.9%），腹腔感染8例（11.4%），其他部位感染4例（5.7%）。

2.2 JAK2 rs10119004基因多態(tài)性 納入的70例患者JAK2 rs10119004位點(diǎn)共有野生型G/G 25例、雜合子突變型G/A 32例、純合子突變型A/A 13例（G表示野生等位基因，A 表示突變等位基因），測序結(jié)果見圖1。本研究樣本基因型符合Hardy-Weinberg 平衡（χ2=0.237，P＞0.05），表明所選患者具有代表性，可用于后續(xù)研究。

Fig.1 JAK2 rs10119004 genotype sequencing map圖1 JAK2 rs10119004位點(diǎn)基因型測序圖

2.3 伏立康唑Cmin及JAK2 rs10119004 基因型與療效及不良反應(yīng)的關(guān)系 70例患者伏立康唑Cmin范圍0.12～12.23 mg/L，平均3.07（1.92，5.48）mg/L。JAK2 rs10119004 位點(diǎn) 3 種基因型 GG、GA 和 AA 患者的伏立康唑血藥谷濃度（mg/L）分別為2.31（1.23，3.30）、3.36（2.25，6.87）和5.27（2.47，7.94），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.763，P＜0.05）。70 例患者總體治療有效率70.00%（49/70），發(fā)生肝功能異常16例，出現(xiàn)皮疹4例。根據(jù)《伏立康唑個(gè)體化用藥指南》［11］推薦的伏立康唑血藥濃度劃分 3 組：＜0.5 mg/L 組、0.5～5.0 mg/L 組、＞5.0 mg/L 組。3 組的不同 Cmin患者和 3 種基因型患者在治療有效率及不良反應(yīng)發(fā)生率方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.4 臨床非遺傳因素對伏立康唑Cmin的影響 按照性別、年齡、BMI、基礎(chǔ)疾病、白蛋白水平等進(jìn)行分組，對每組Cmin水平進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，得出年齡≥60 歲患者的伏立康唑Cmin明顯高于＜60 歲患者；血漿白蛋白水平低于正常值的患者，其伏立康唑Cmin明顯高于血漿白蛋白正?；颊撸≒＜0.05），見表2。

2.5 多重線性回歸分析 在影響伏立康唑Cmin的因素中，將具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的血漿白蛋白（ALB）水平、年齡（Age）和JAK2 rs10119004基因型納入模型中進(jìn)行多重線性回歸分析。將分類變量JAK2 基因型進(jìn)行啞變量設(shè)置，用0 或1 表示，將G/G 基因型作為參考變量，G/A基因型設(shè)置為啞變量X1，A/A基因型為啞變量X2。賦值情況如下：X1=1代表G/A型，X1=0代表非G/A型；X2=1代表A/A型，X2=0代表非A/A型。得到線性回歸方程：C1=7.479+0.048×年齡-0.233×白蛋白+1.405×X1；C2=7.479+0.048×年齡-0.233×白蛋白+1.208×X2。結(jié)果表明，排除了年齡和白蛋白對伏立康唑Cmin的影響外，JAK2 rs10119004位點(diǎn)基因型仍然會(huì)對Cmin產(chǎn)生影響（R2=0.475，P＜0.05），見表3。

Tab.1 Comparison of therapeutic effects and adverse reactions between patients with different voriconazole Cmin and different JAK2 rs10119004 genotypes表1 不同伏立康唑Cmin及JAK2 rs10119004基因型患者治療效果及不良反應(yīng)的比較 例（%）

Tab.2 The influence of non-genetic factors on voriconazole plasma concentration表2 非遺傳因素對伏立康唑Cmin的影響

Tab.3 Multiple linear regression analysis of the effect of voriconazole on Cmin表3 影響伏立康唑Cmin的多重線性回歸分析

3 討論

伏立康唑的治療效果與其血藥濃度密切相關(guān)，一般認(rèn)為有效治療濃度在1～5.5 mg/L，低于此范圍則治療無效，高出此范圍則可能出現(xiàn)各種不良反應(yīng)［12-13］。在使用伏立康唑治療IFI 的過程中，大約25%的患者出現(xiàn)了肝功能異常及皮疹等情況，這些反應(yīng)通常會(huì)在停藥后逐漸消失［14］。藥物基因組學(xué)研究從遺傳角度解釋患者用藥后出現(xiàn)的個(gè)體間差異，尤其對于伏立康唑這種非線性藥動(dòng)學(xué)藥物很有必要［15-16］。如何合理制定給藥方案使伏立康唑血藥濃度在安全范圍內(nèi)，是臨床個(gè)體化給藥治療的主要研究內(nèi)容。

伏立康唑通過阻止細(xì)胞色素P450依賴性的14-甾醇去除甲基化來阻止麥角甾醇合成，從而阻礙真菌合成細(xì)胞膜，導(dǎo)致真菌非正常死亡。已有文獻(xiàn)證實(shí)伏立康唑在某種程度上有著不可忽視的間接免疫調(diào)節(jié)作用，這種間接作用會(huì)對伏立康唑的抗菌活性產(chǎn)生較大影響［17］。此外，JAK2在致炎和免疫調(diào)節(jié)過程中也發(fā)揮重要作用。有研究顯示，伏立康唑用于角膜真菌感染患者進(jìn)行抗感染治療過程中，使用JAK2 阻斷劑后患者感染癥狀減輕［18］。另有國內(nèi)一項(xiàng)研究觀察了遺傳多態(tài)性對伏立康唑治療角膜真菌感染時(shí)血藥濃度的影響，結(jié)果顯示JAK2 rs10119004位點(diǎn)的基因型與伏立康唑血藥濃度之間存在相關(guān)性［19］。

和上述研究不同，本研究患者感染部位大多為肺部和腹腔。本研究在檢測患者JAK2 rs10119004位點(diǎn)基因多態(tài)性的同時(shí)檢測了伏立康唑的血藥谷濃度，在排除年齡、性別、BMI、給藥途徑、基礎(chǔ)疾病和血漿白蛋白水平等非遺傳因素的影響后，JAK2 rs10119004 位點(diǎn)基因型對伏立康唑Cmin仍然會(huì)產(chǎn)生影響，且GA 型和AA 型患者的伏立康唑Cmin明顯高于未突變GG 型。由于目前缺少關(guān)于侵襲性真菌感染與JAK2/STAT3信號通路活化相關(guān)性的機(jī)制研究，因此關(guān)于JAK2 基因多態(tài)性對伏立康唑血藥濃度的影響機(jī)制尚不明確，推斷可能與如下機(jī)制有關(guān)：（1）JAK2 rs10119004 基因多態(tài)性可能直接影響該信號通路的正?；罨^程，繼而激活被該信號通路調(diào)控的相關(guān)藥物代謝基因，影響伏立康唑血藥濃度。（2）有臨床研究表明，JAK2基因多態(tài)性對機(jī)體免疫功能會(huì)產(chǎn)生重要影響［4］。存在JAK2 基因突變患者的免疫功能產(chǎn)生變化，可能影響到伏立康唑的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，進(jìn)而影響抗真菌活性和療效。上述機(jī)制需要更大的樣本量和更深入的研究驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)突變組的伏立康唑Cmin高于未突變組，但是尚未發(fā)現(xiàn)突變組患者伏立康唑治療有效率和安全性與未突變組存在差異，這可能與研究的樣本量偏少有關(guān)，且ICU 重癥患者病情復(fù)雜，感染重，往往同時(shí)合并其他細(xì)菌感染，療效和不良反應(yīng)的判定缺乏精準(zhǔn)性。

綜上所述，ICU 侵襲性真菌感染患者在使用伏立康唑抗感染治療的過程中，不僅要監(jiān)測血藥濃度，還要考慮到相關(guān)代謝基因多態(tài)性對療效和安全性的影響，臨床藥師對伏立康唑臨床應(yīng)用開展相關(guān)藥學(xué)監(jiān)護(hù)，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)化藥物治療，從而提高伏立康唑治療的有效率及臨床治療方案的準(zhǔn)確性。