馬轉(zhuǎn)霞， 孫嵐萍， 顧志榮， 馬天翔， 呂 鑫， 許愛(ài)霞， 葛 斌

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730000)

扶正治癃方由黃芪、熟地、肉蓯蓉3味中藥組成，是甘肅省人民醫(yī)院的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有補(bǔ)氣溫腎、補(bǔ)血養(yǎng)陰、補(bǔ)腎潤(rùn)燥等功效，常用于治療前列腺增生等疾病。方中君以黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)、益氣溫腎、調(diào)節(jié)氣血；臣以熟地填精益髓、補(bǔ)血養(yǎng)陰，肉蓯蓉補(bǔ)腎、益精、潤(rùn)燥。全方以補(bǔ)腎為主，氣血陰陽(yáng)統(tǒng)調(diào)，標(biāo)本兼治。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪利尿機(jī)制為競(jìng)爭(zhēng)性抑制Na+-K+-ATP酶活力，且黃芪皂苷可促進(jìn)膀胱逼尿肌的收縮，緩解尿道內(nèi)口括約肌緊張度，減輕前列腺增生排尿無(wú)力、排尿困難的癥狀[1]。熟地、肉蓯蓉均含有黃酮、多糖、生物堿等多種化學(xué)成分，具有抑菌、抗炎、提高機(jī)體免疫的生物活性，可保護(hù)前列腺免遭細(xì)菌和其他病原微生物侵襲，解除尿路炎性梗阻，改善局部癥狀。

中醫(yī)常將前列腺增生歸為“癃閉”“淋證”等范疇，其發(fā)病基礎(chǔ)為年老體衰、腎氣虧虛，基本病理因素為瘀血、痰濁、濕熱，常見(jiàn)發(fā)病條件為勞力過(guò)度、情志刺激、外感六淫、飲食不節(jié)等[2]。中藥及復(fù)方制劑治療該類疾病具有療效確切、整體調(diào)節(jié)、毒副作用小、適合長(zhǎng)期服用等諸多明顯優(yōu)勢(shì)[3]。故擬將原湯劑制備成便于服用、攜帶與貯存的顆粒劑，以解決傳統(tǒng)湯劑煎煮費(fèi)時(shí)、繁瑣，且藥液味苦量大等問(wèn)題。本研究采用正交試驗(yàn)、均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化提取及成型工藝，為扶正治癃顆粒的開(kāi)發(fā)研究提供技術(shù)資料。

1 材料

1.1 儀器 LC-16型高效液相色譜儀(日本島津公司)；UV8100A型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)；BSA4202S-CW型電子天平(百萬(wàn)分之一，德國(guó)賽多利斯公司)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(西安超杰儀器有限公司)；DHG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；DD-5M型低速大容量離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；YC-1000型實(shí)驗(yàn)室噴霧制粒包衣機(jī)(上海雅程儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 試劑與藥物 黃芪(批號(hào)180606)、熟地(批號(hào)180602)、肉蓯蓉(批號(hào)180201)均購(gòu)于甘肅冠蘭中藥飲片有限公司，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)李碩副教授鑒定為正品，符合2015年版《中國(guó)藥典》一部相關(guān)規(guī)定。5-羥甲基糠醛(批號(hào)CHB171016)、松果菊苷(批號(hào)CHB170302)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號(hào)CHB171102)、毛蕊花糖苷(批號(hào)CHB171103)、D-無(wú)水葡萄糖(批號(hào)CHB180115)、蘆丁(批號(hào)CHB170303)對(duì)照品均購(gòu)于成都克洛瑪生物科技有限公司。預(yù)膠化淀粉、麥芽糊精、甘露醇、微晶纖維素均為藥用規(guī)格。甲醇、甲酸為色譜純(天津大茂化學(xué)試劑廠)；其他試劑均為分析純(天津大茂化學(xué)試劑廠)；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝優(yōu)化

2.1.1 HPLC法測(cè)定4種成分含量

2.1.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取5-羥甲基糠醛、松果菊苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，置于25 mL量瓶中，甲醇超聲溶解，定容至25 mL，即得(四者質(zhì)量濃度分別為0.10、4.40、0.19、0.53 mg/mL)。

2.1.1.2 供試品溶液制備 取水煎液10 mL，置于100 mL具塞三角瓶中，精密加入15 mL甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲(功率500 W、頻率40 kHz、溫度20 ℃)處理60 min，提取液冷卻至室溫，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取上清液，溶劑回收至干，殘?jiān)蛹兓芙?，轉(zhuǎn)移至 25 mL量瓶中，純化水洗滌并定容至刻度，即得。

2.1.1.3 色譜條件 WondaSil C18-WR色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相甲醇(A)-水(含0.1%甲酸)(B)，梯度洗脫(0～30 min，8%～62%A；30～32 min，62%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

1.5-羥甲基糠醛 2.松果菊苷 3.毛蕊異黃酮葡萄糖苷 4. 毛蕊花糖苷

2.1.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，各取10 μL，在“2.1.1.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.1.1.5 方法學(xué)考察 選擇正交1號(hào)水煎液，按照2015年版《中國(guó)藥典》四部指導(dǎo)原則進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率試驗(yàn)，測(cè)得RSD均小于1.88%，各成分平均加樣回收率在99.39%～102.26%之間，表明儀器精密度、方法重復(fù)性良好，水煎液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.2 總多糖含量測(cè)定

2.1.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取5.00 mgD-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品，置于50 mL量瓶中，純化水振搖溶解，定容至刻度，即得。

2.1.2.2 供試品溶液制備 取1 mL水煎液至離心管中，加入無(wú)水乙醇適量，邊加邊攪拌，使其體積分?jǐn)?shù)高于80%，放置過(guò)夜，濾過(guò)，殘?jiān)訜崴芙?，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，純化水定容，即得。

2.1.2.3 吸光度測(cè)定 取對(duì)照品溶液、供試品溶液、純化水(空白對(duì)照溶液)各1 mL，參照文獻(xiàn)[4]中總多糖含量的檢測(cè)方法，在486 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。

2.1.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液2、3、4、5、6、7、8、9 mL，置于10 mL量瓶中，純化水定容至刻度，按“2.1.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行回歸，得方程為A=63.184 0X-0.004 1(r=0.999 3)，在0.020 0～0.090 0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2.5 方法學(xué)考察 選擇正交1號(hào)水煎液，按照2015年版《中國(guó)藥典》四部指導(dǎo)原則進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率試驗(yàn)，測(cè)得RSD均小于2.00%，平均加樣回收率為101.39%，表明儀器精密度、方法重復(fù)性良好，水煎液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3 總黃酮含量測(cè)定

2.1.3.1 對(duì)照品溶液制備 精密取蘆丁對(duì)照品10.00 mg至50 mL量瓶中，60%乙醇溶解并定容至刻度，即得。

2.1.3.2 供試品溶液制備 取4 mL水煎液至50 mL三角瓶中，沿壁緩緩加無(wú)水乙醇，邊加邊振搖，待沉淀完全后過(guò)濾，取上清液，定容至刻度，即得。

2.1.3.3 吸光度測(cè)定 同“2.1.2.3”項(xiàng)，參照文獻(xiàn)[4]中總黃酮含量的檢測(cè)方法，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。

2.1.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液2、3、4、5、6、7、8、9 mL，置于25 mL量瓶中，純化水定容至刻度，按“2.1.3.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行回歸，得方程為A=11.939 0X-0.058 8(r=0.999 5)，在0.016 5～0.074 2 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3.5 方法學(xué)考察 選擇正交1號(hào)水煎液，按照2015年版《中國(guó)藥典》四部指導(dǎo)原則進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率試驗(yàn)，測(cè)得RSD均小于1.94%，平均加樣回收率為99.62%，表明儀器精密度、方法重復(fù)性良好，水煎液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4 干浸膏得率測(cè)定 取水煎液20 mL，置于已干燥恒重的蒸發(fā)皿中，95 ℃水浴蒸干后于105 ℃烘箱中干燥3 h，蒸發(fā)皿轉(zhuǎn)移至干燥器內(nèi)，待其冷卻至室溫后稱定質(zhì)量，計(jì)算干浸膏得率，公式為干浸膏得率=(干浸膏質(zhì)量/藥材總質(zhì)量)×100%。

2.1.5 正交試驗(yàn) 依照處方配比稱取相應(yīng)中藥飲片，選擇煎煮時(shí)間(A)、加水量(B)、煎煮次數(shù)(C)作為影響因素，5-羥甲基糠醛(X1)、松果菊苷(X2)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(X3)、毛蕊花糖苷(X4)、總多糖(X5)、總黃酮(X6)含量及干浸膏得率(X7)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝[5]。因素水平見(jiàn)表2。

表2 提取工藝因素水平

2.1.6 數(shù)據(jù)處理 采用信息熵理論[6]確定各評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，首先建立原始評(píng)價(jià)指標(biāo)矩陣X，將其轉(zhuǎn)換為概率矩陣P，計(jì)算各指標(biāo)的信息熵(Hi)(Hi=[0.971 4 0.929 4 0.973 7 0.948 3 0.500 5 0.960 1 0.988 1])、i項(xiàng)指標(biāo)的系數(shù)Wi(Wi=[0.039 3 0.096 8 0.036 1 0.070 9 0.685 9 0.054 8 0.016 3])，根據(jù)公式M=X1m×W1+X2m×W2+X3m×W3+…+Xnm×Wn計(jì)算綜合評(píng)分M，結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。由表3可知，各因素影響程度依次為C>A>B，即煎煮次數(shù)>煎煮時(shí)間>加水量；由表4可知，因素A、C有顯著影響(P<0.05)，而B(niǎo)無(wú)顯著影響(P>0.05)；各因素較高水平組合理論上為A3B3C3，結(jié)合生產(chǎn)成本考慮，最終確定為A3B3C2，即加10倍量水煎煮2次，每次2 h。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 方差分析

2.1.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方配比稱取相應(yīng)中藥飲片3份，按“2.1.6”項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。由此可知，3批樣品綜合評(píng)分及各指標(biāo)成分得率的RSD均小于3.00%，表明該工藝穩(wěn)定可行，可用于扶正治癃方的工業(yè)化提取。

表5 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.2 成型工藝優(yōu)化

2.2.1 顆粒制備 按處方量稱取相應(yīng)中藥飲片，按“2.1.6”項(xiàng)下優(yōu)化工藝制備水煎液，濃縮，噴霧干燥后制得干燥恒重的浸膏粉。取相應(yīng)比例的浸膏粉與輔料混合，因前者黏性較大，故以95%乙醇為潤(rùn)濕劑制軟材(“握之成團(tuán)，觸之即散”)，過(guò)20目篩，濕法制粒，在60 ℃烘箱中烘干整粒，即得。

2.2.2 指標(biāo)測(cè)定

2.2.2.1 吸濕率 取顆粒2 g，置于已干燥恒重的扁形稱量瓶中，輕搖使顆粒均勻分布于稱量瓶底部，敞口放入盛有NaCl過(guò)飽和溶液的干燥器內(nèi)，干燥器密封，48 h后取出稱定質(zhì)量，計(jì)算吸濕率[7]，公式為吸濕率=[(吸濕后顆粒質(zhì)量-吸濕前顆粒質(zhì)量)/吸濕前顆粒質(zhì)量]×100%。

2.2.2.2 成型率 取過(guò)1號(hào)篩而不過(guò)5號(hào)篩的合格顆粒，稱定質(zhì)量，計(jì)算成型率[8]，公式為成型率=(合格顆粒質(zhì)量/顆?？傎|(zhì)量)×100%。

2.2.2.3 溶化率 取顆粒1 g，置于已干燥至恒重的50 mL離心管中，加入100 ℃沸水20 mL，攪拌并振搖5 min，離心，棄去上清液，殘?jiān)糜?0 ℃下烘干至恒重，稱定質(zhì)量，計(jì)算溶化率[9]，公式為溶化率=(溶化的顆粒質(zhì)量/顆?？傎|(zhì)量)×100%。

2.2.2.4 休止角 將3個(gè)漏斗串聯(lián)固定在鐵架臺(tái)上，鐵架臺(tái)置于坐標(biāo)紙上，保持最底端的漏斗口距坐標(biāo)紙1 cm(H)，將顆粒沿壁倒入最頂端漏斗口中，待坐標(biāo)紙上顆粒椎體頂端觸及最底端漏斗下沿時(shí)停止，記錄顆粒錐體底部直徑為2R，計(jì)算休止角α[10]，公式為α=arctanH/R。

2.2.2.5 堆密度 將顆粒放入已干燥恒重的量筒中，反復(fù)振蕩，記錄體積，稱定顆粒質(zhì)量，計(jì)算堆密度[10]，公式為堆密度=顆粒質(zhì)量/顆粒體積。

2.2.3 輔料篩選 對(duì)預(yù)膠化淀粉、麥芽糊精、甘露醇、微晶纖維素進(jìn)行篩選，設(shè)定浸膏粉與輔料比例為1∶1，潤(rùn)濕劑(95%乙醇)用量0.35倍，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備顆粒，測(cè)定其吸濕率、成型率、溶化率，結(jié)果見(jiàn)表6。由此可知，預(yù)膠化淀粉成型率及麥芽糊精吸濕率、溶化率明顯優(yōu)于其他輔料，綜合考慮，選用預(yù)膠化淀粉與麥芽糊精作為輔料[11]。

2.2.4 均勻設(shè)計(jì) 選擇浸膏粉與輔料比例(A)、95%乙醇用量(B)、預(yù)膠化淀粉與麥芽糊精比例(C)作為影響因素，吸濕率(X1)、成型率(X2)、溶化率(X3)、休止角(X4)、堆密度(X5)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，G1-熵權(quán)法確定權(quán)重系數(shù)，計(jì)算綜合評(píng)分(Y)，采用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化成型工藝[12-13]，因素水平見(jiàn)表7。

表7 成型工藝因素水平

表8 評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重值

表9 均勻設(shè)計(jì)結(jié)果

2.2.6 工藝驗(yàn)證 按“2.2.5”項(xiàng)下優(yōu)化的成型工藝制備3批顆粒，測(cè)定吸濕率、成型率、溶化率、休止角、堆密度，計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表10。由此可知，顆粒平均綜合評(píng)分高于表9最高值93.715 2分，而且各指標(biāo)RSD均<3.00%，表明該工藝穩(wěn)定可行。

表10 成型工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.2.7 臨界相對(duì)濕度測(cè)定 在棕色干燥器內(nèi)配置7種鹽(CH3COOK、MgCl2、K2CO3、NaBr、NaCl、KCl、K2SO4)的過(guò)飽和溶液，放置48 h。取顆粒2 g，置于已干燥恒重的扁形稱量瓶中，輕搖使其均勻分布在稱量瓶底部，敞口放在盛有不同鹽過(guò)飽和溶液的干燥器中，放置48 h后稱定質(zhì)量，計(jì)算吸濕率[16]，結(jié)果見(jiàn)表11。以相對(duì)濕度為橫坐標(biāo)(X)，吸濕率為縱坐標(biāo)(Y)繪制曲線，在曲線前后拐點(diǎn)處做切線，結(jié)果見(jiàn)圖2，可知前、后拐點(diǎn)處切線方程分別為Y=0.073 4X+0.955 4、Y=0.502 6X-26.447 4，兩切線交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)為臨界相對(duì)濕度(CRH)，其數(shù)值為63.85%。

表11 顆粒吸濕率測(cè)定結(jié)果

圖2 顆粒吸濕曲線

3 討論

中藥治療過(guò)程中“多靶點(diǎn)、多途徑”的特點(diǎn)與所含的多種化學(xué)成分密不可分，因此評(píng)價(jià)指標(biāo)的選擇是中藥提取工藝研究中十分重要的環(huán)節(jié)[17]。本研究所選的7種評(píng)價(jià)指標(biāo)，不僅包含毛蕊異黃酮葡萄糖苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷等對(duì)前列腺增生有明確治療作用的單體成分[18]，又有總黃酮、總多糖等有效部位，可較全面地評(píng)價(jià)所選工藝參數(shù)的優(yōu)劣。

因扶正治癃方中含熟地、肉蓯蓉兩味中藥，故黏性大，吸濕性大，流動(dòng)性差，在制成顆粒時(shí)需加入合適的潤(rùn)濕劑與輔料。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)潤(rùn)濕劑乙醇濃度為95%時(shí)，顆粒成型性好。微晶纖維素和甘露醇作為填充劑時(shí)，所得顆粒松散、硬度不夠。麥芽糊精和預(yù)膠化淀粉價(jià)格低廉、口感滑膩、具有流動(dòng)性好，溶解性能好，不易吸潮等特點(diǎn)。兩者結(jié)合使用可以很好的降低顆粒吸濕性，提高成型性與溶化性。

權(quán)重系數(shù)是中藥多指標(biāo)評(píng)價(jià)時(shí)必須考慮的問(wèn)題之一。目前應(yīng)用較多的是主觀賦權(quán)法[19]，這類方法雖在一定程度上體現(xiàn)了中藥復(fù)方的配伍規(guī)律，但主觀性較強(qiáng)，常忽略實(shí)際樣本的數(shù)據(jù)信息特點(diǎn)。近年來(lái)，信息熵理論加權(quán)法、G1-熵權(quán)法、AHP-CRITIC混合加權(quán)法等在工藝優(yōu)化中逐漸得到廣泛應(yīng)用。該類方法簡(jiǎn)單易行、結(jié)果精確，避免了人為確定權(quán)重的隨意性和不確定性，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠、科學(xué)。