王小龍

(阜陽市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，安徽 阜陽 236000)

國家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，2015年我國新增癌癥患者392.9萬，并有233.8萬人死亡，其中肺癌發(fā)病和死亡人數(shù)均居惡性腫瘤第1位，它是我國最常見的癌癥，也是導(dǎo)致癌癥死亡的首要原因[1-2]。中醫(yī)并無“肺癌”病名，相關(guān)論述多散見于歷代關(guān)于“肺積”“息賁”“咳嗽”“咯血”“痞癖”“胸痛”“癥瘕積聚”等記載[3]，對(duì)肺癌的認(rèn)識(shí)較早，相關(guān)治則治法亦有多種，以“母病及子”“脾虛痰聚于肺”為理論的培土生金法在治療肺癌方面具有一定的特色和優(yōu)勢(shì)。本研究借助TCMISS平臺(tái)及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫，從阜陽市中醫(yī)醫(yī)院處方切入，篩選治療肺癌的新處方，并分析培土生金法治療肺癌的組方規(guī)律及分子機(jī)制，闡釋中醫(yī)藥治法理論內(nèi)涵，并為臨床用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 處方來源 2019年度阜陽市中醫(yī)醫(yī)院中藥房診斷為肺癌、肺惡性腫瘤個(gè)人史的門診中藥處方，經(jīng)篩選后共納入86張，均由阜陽市中醫(yī)醫(yī)院門診部、國醫(yī)堂專家開具，具有一定的代表性。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理 由于歷史演變、各地習(xí)慣等因素，導(dǎo)致中藥名稱混亂，同藥異名、同名異藥現(xiàn)象普遍存在，給臨床及科研工作帶來諸多不便[4]。為便于統(tǒng)計(jì)，降低分析結(jié)果的偏差，本研究參考2015版《中國藥典》[5]、高等院校《中藥學(xué)》[6]教科書(作為藥物一級(jí)和二級(jí)功效、性味、歸經(jīng)分類的文獻(xiàn)依據(jù))《常用中藥別名速查手冊(cè)》[7]，對(duì)藥名進(jìn)行規(guī)范化處理，其余保證藥名一致即可，中藥拉丁名參考《中藥鑒定學(xué)》[8]教材及南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥標(biāo)本中心(Chinese medicine specimen center of Nanjing University of Chinese Medicine，http://zybb.njucm.edu.cn/)進(jìn)行規(guī)范。

1.3 數(shù)據(jù)挖掘研究及新處方篩選 將86張?zhí)幏街械乃幬镏鹨讳浫胫嗅t(yī)傳承輔助平臺(tái)(TCMISS-V2.5，Traditional Chinese medicine inheritance support system)軟件，建立肺癌中藥處方數(shù)據(jù)庫。進(jìn)入“數(shù)據(jù)分析”系統(tǒng)，方劑類別選擇“肺癌”，使用“頻次統(tǒng)計(jì)”模塊對(duì)藥物使用頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并參照《中藥學(xué)》教科書對(duì)頻次>2次中藥的功效、性味、歸經(jīng)進(jìn)行分類。應(yīng)用Apriori關(guān)聯(lián)規(guī)則分析模塊，在置信度為0.8條件下，將支持度個(gè)數(shù)調(diào)至26、21、17，分別展示由核心到外圍的藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則。采用熵層次聚類分析方法，設(shè)置相關(guān)度為6，懲罰度為5，基于復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類以及無監(jiān)督的熵層次聚類得出用于新方聚類的4條藥物組合，并演化出2首用于治療肺癌的新處方。本研究擬對(duì)方二進(jìn)行進(jìn)一步的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，以探討其治療肺癌的分子機(jī)制。

1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 進(jìn)入中藥分子機(jī)制在線分析工具(BATMAN-TCM，a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，選擇Example-2模塊，在Score cutoff為35、AdjustedP-value為0.05條件下，篩選新方活性分子及相應(yīng)基因。同時(shí)以“l(fā)ung cancer”為檢索詞，在人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards，https://www.genecards.org/)尋找支氣管肺癌相關(guān)基因。依據(jù)基因數(shù)量，保留打分≥30的基因進(jìn)行分析。在Venny-2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)平臺(tái)導(dǎo)入新處方相應(yīng)基因(去重后)及肺癌相關(guān)基因，通過取兩者交集，預(yù)測(cè)新處方治療肺癌的靶基因。同時(shí)將預(yù)測(cè)得到的靶標(biāo)匹配新方活性分子，建立活性分子-潛在靶基因?qū)?yīng)關(guān)系，并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。使用STRING(https://string-db.org)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建靶基因PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)應(yīng)用Cytoscape軟件對(duì)核心網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。將Degree值>10的16個(gè)核心靶標(biāo)導(dǎo)入Metascape(http://metascape.org/gp/index.html)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶標(biāo)途徑和通路富集總分析[9]，應(yīng)用David(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對(duì)GO功能及KEGG代謝通路進(jìn)行進(jìn)一步的深入分析。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)挖掘研究 86張?zhí)幏街泄灿弥兴?58味，合計(jì)1 479味次。使用頻次≥30次的有12味，前5味分別為半夏、甘草、薏苡仁、白術(shù)、砂仁，出現(xiàn)頻次均>40次。使用頻次≥30次的中藥見表1，根據(jù)藥物數(shù)量，對(duì)出現(xiàn)頻次>2次者進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)功效分類，見表2。在四氣五味方面，以溫性、平性、微寒及甘、辛、苦味較多；在歸經(jīng)方面，以歸肺、脾、胃經(jīng)最多，見表3。本研究在置信度0.8條件下，分別設(shè)置支持度個(gè)數(shù)為26、21、17，隨著支持度個(gè)數(shù)的降低，逐漸出現(xiàn)由核心到外圍的藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則。如支持度個(gè)數(shù)為26時(shí)的款冬花-甘草、白術(shù)-半夏，支持度個(gè)數(shù)為21時(shí)的款冬花-桂枝、白術(shù)-黃芪、紫菀-干姜，支持度個(gè)數(shù)為17時(shí)的款冬花-干姜-桂枝等，見圖1。在Apriori關(guān)聯(lián)規(guī)則分析的基礎(chǔ)上，將相關(guān)度設(shè)置為6，懲罰度設(shè)置為5，聚類出4條用于新方組合的藥組，見表4。通過對(duì)4條中藥組合進(jìn)一步整理，得出2首治療支氣管肺癌的新處方。

表4 新方聚類組合(相關(guān)度6，懲罰度5)

圖1 中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則(置信度0.8)

表1 使用頻次≥30次的前12味中藥

表2 使用頻次>2次的中藥功效分布

表3 中藥四氣、五味、歸經(jīng)分布(使用頻次>2次)

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究 本研究擬對(duì)圖2中的新處方二(白術(shù)-干姜-桂枝-款冬花)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究。在BATMAN-TCM平臺(tái)搜集新處方活性分子，去除缺乏結(jié)構(gòu)信息和靶標(biāo)預(yù)測(cè)項(xiàng)，共整理出新方活性分子66個(gè)，包含白術(shù)4個(gè)，干姜37個(gè)，桂枝14個(gè)，款冬花11個(gè)，見表5；活性分子相應(yīng)基因分別為白術(shù)26條，干姜739條，桂枝208條，款冬花147條，共獲得新處方相應(yīng)基因1 120條，去重后290條。在Genecards數(shù)據(jù)庫搜集肺癌相關(guān)基因22 399個(gè)，其中打分≥30的有614條。將614條肺癌基因與290條新處方基因取交集，獲得交集基因34個(gè)，見圖3。將34個(gè)交集基因匹配中藥活性分子并導(dǎo)入Cytoscape軟件，得到活性分子-靶基因網(wǎng)絡(luò)圖，共90個(gè)節(jié)點(diǎn)，166條邊，其中內(nèi)圈為相應(yīng)基因，外圈散點(diǎn)為活性分子，見圖4。使用STRING、Cytoscape構(gòu)建靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，共34個(gè)節(jié)點(diǎn)，174條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值10.2，局部集聚系數(shù)0.616，見圖5。進(jìn)一步分析其核心網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，篩選Degree值>10的16條核心蛋白節(jié)點(diǎn)用于進(jìn)一步的GO功能及KEGG代謝通路富集分析，見圖6、表6。使用Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)核心靶標(biāo)進(jìn)行熱圖富集總分析，基因組中的所有基因都被用于富集背景，依據(jù)P<0.01、最小計(jì)數(shù)為3、富集因子>1.5收集相關(guān)項(xiàng)，并根據(jù)其相似度進(jìn)行分組，將前19條具代表性的富集結(jié)果予以展示，見圖7。根據(jù)DAVID分析結(jié)果，核心靶標(biāo)主要參與的生物過程(BP)共25條，其中P<0.05的有21條；細(xì)胞組分(CC)共3條，其中P<0.05的有2條；分子功能(MF)共10條，其中P<0.05的有8條，見圖8。KEGG代謝通路分析顯示34條，其中P<0.05的有27條，見圖9。

圖7 Metascape生物途徑及通路富集總分析

圖8 GO富集分析

圖9 KEGG通路富集分析

表6 新處方二中核心靶標(biāo)(度值>10)

圖2 治療肺癌新處方(相關(guān)度6，懲罰度5)

圖3 肺癌靶基因韋恩圖

圖4 活性分子-靶基因網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖6 PPI核心網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)

表5 新處方二中4味藥材活性分子

3 討論

中醫(yī)歷來重視痰飲與腫瘤間的關(guān)系，因腫瘤是全身疾病的局部表現(xiàn)，肺癌的發(fā)生亦與痰飲相關(guān)。津液代謝障礙，痰氣郁結(jié)阻滯中焦氣機(jī)，久則痰飲內(nèi)停，聚結(jié)于肺，發(fā)為腫瘤[10]，故痰飲可能是肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。治法方面，當(dāng)以甘、溫之藥為主。以甘溫除痰飲，蓋因肺為貯痰之器，然脾乃生痰之源。古有仲景之黃芪建中湯治肺虛損不足，創(chuàng)甘溫培土法；又有東垣謂脾胃一虛，肺氣先絕，創(chuàng)甘溫健脾之法[11]。

培土生金是古代五行學(xué)說在中醫(yī)治法方面的具體應(yīng)用，根據(jù)“虛則補(bǔ)其母”“其標(biāo)在肺……其制在脾”等理論，從脾胃入手，通過健脾胃使得肺氣充實(shí)，土旺則金自生[12]。中醫(yī)培土生金法在祛邪的同時(shí)更加注重扶正的作用，從病因的角度看待疾病的發(fā)展，扶助正氣，激發(fā)患者自愈潛能，不失為治療肺癌的重要思路[13]。中西并舉，遵循“認(rèn)病辨證”的原則，充分發(fā)揮現(xiàn)代醫(yī)學(xué)精準(zhǔn)定性、定位，局部腫瘤控制率高的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合中醫(yī)培土生金的診療特色，可極大改善患者的臨床獲益[14]。尤其在緩解臨床癥狀[15]、防治復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[16]、治療癌因性疲乏[17]、以及對(duì)化療藥的減毒增效[18]等方面均體現(xiàn)其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，值得進(jìn)一步深入研究。

在宏觀層面，本研究從86張肺癌處方中過濾出半夏、甘草、薏苡仁、白術(shù)、砂仁等高頻藥物。以化痰止咳平喘、補(bǔ)虛、清熱、利水滲濕、化濕等藥物為主，包含了補(bǔ)氣、清熱解毒、止咳平喘、清化熱痰、利水消腫、溫化寒痰、補(bǔ)陰等二級(jí)功效。通過進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)本院治療肺癌的中藥性味以甘溫為多，主入肺、脾、胃經(jīng)。進(jìn)一步應(yīng)用Apriori關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，從核心到外圍全面展示了本院治療支氣管肺癌的用藥規(guī)律。通過熵層次聚類分析，得出“大棗-魚腥草-山慈菇”“款冬花-桂枝-干姜”“黨參-白花蛇舌草-重樓-半枝蓮”“款冬花-白術(shù)-干姜”四條核心藥組。經(jīng)進(jìn)一步整合，篩選出2首治療肺癌的新處方，皆有脾肺同治之意。尤其新處方二，桂枝-白術(shù)能化氣健脾，干姜-白術(shù)善溫中化飲，伍以款冬花溫肺化痰，四藥合用，發(fā)揮健脾溫肺、培土生金的功效。本研究對(duì)處方“白術(shù)-干姜-桂枝-款冬花”進(jìn)行進(jìn)一步的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，闡釋該方培土生金治療肺癌的分子機(jī)制。

從“宏觀到微觀”角度看，脾胃為氣機(jī)之樞、居中央以灌四旁，脾胃在人體的特殊地位決定了其對(duì)生命調(diào)控的特殊作用[19]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展一直伴隨著分子、細(xì)胞與宿主-腫瘤微環(huán)境的相互修飾，中醫(yī)藥改善調(diào)節(jié)宿主-腫瘤微環(huán)境的作用，可能是其抗腫瘤的最終作用機(jī)制[20]。本研究結(jié)果顯示，新處方“白術(shù)-干姜-桂枝-款冬花”治療肺癌具有多靶點(diǎn)-多通路-整合調(diào)節(jié)的特點(diǎn)，其培土生金的實(shí)質(zhì)內(nèi)涵可能主要通過影響能量代謝而發(fā)揮“補(bǔ)脾”“培土”的功效，通過作用于細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)等發(fā)揮“溫肺”“生金”的作用。一方面，脾胃居中焦，主運(yùn)化，為“后天之本”“氣血生化之源”“氣機(jī)升降之樞”，脾胃的這些功能特點(diǎn)決定了其與細(xì)胞能量代謝的密切關(guān)系[21-23]。腫瘤細(xì)胞不但可以盡可能多地吸收和利用周圍的營養(yǎng)物質(zhì)，而且可以根據(jù)微環(huán)境的改變選擇更有利的代謝方式[24]?；罨腁MPK可以增強(qiáng)分解代謝，抑制合成代謝，應(yīng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的刺激，并且影響細(xì)胞的生長、增殖、凋亡、自噬等基本生物學(xué)過程，廣泛影響腫瘤的發(fā)生、生長，發(fā)揮重要的腫瘤拮抗作用[25]。另一方面，細(xì)胞因子在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生及發(fā)展過程中扮演重要角色[26]。首先，有研究[27]提示血清 TNF-α、IL-1β等炎性細(xì)胞因子可能參與了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展，且與NSCLC的病理進(jìn)程和預(yù)后密切相關(guān)。IFNG基因編碼的干擾素-γ(IFN-γ) 在病毒和細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，IFNG基因rs2069705位點(diǎn)可能與肺癌風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性[28]。HIF-1α的高表達(dá)與NSCLC臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而CXCR4作為HIF-1α的下游因子之一，兩者通過相互調(diào)控促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移[29]。其次，INS的高低或與肺癌的發(fā)展有關(guān)。盡管糖尿病和肺癌之間存在諸多混雜因素，其對(duì)肺癌影響的詳盡機(jī)制仍需大量研究深入證實(shí)[30]。但胰島素抵抗和高胰島素血癥的代償可通過INS及IGF-1受體的激活而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長的作用[31]。IGF-1在胰島素受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用[32]。其可能通過自分泌和旁分泌等方式作用于肺癌細(xì)胞，并通過AKT信號(hào)通路促進(jìn)人肺癌A549細(xì)胞增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移[33-34]。此外，MMP9[35]、SERPINE1(PAI-1)[36]表達(dá)的上調(diào)亦與肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

綜上所述，本研究從阜陽市中醫(yī)醫(yī)院86張肺癌處方中篩選出以“白術(shù)-干姜-桂枝-款冬花”組成的新處方，新處方甘溫護(hù)中、健脾溫肺，體現(xiàn)了培土生金的治則治法。這一治法的實(shí)質(zhì)內(nèi)涵可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、免疫應(yīng)答以及炎癥反應(yīng)有關(guān)。其可能主要通過影響能量代謝、細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)等而作用于肺癌的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移等環(huán)節(jié)，從而發(fā)揮培土生金的作用。