亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        桂枝茯苓丸對慢性盆腔炎大鼠血清炎癥因子水平及子宮組織caspase-3、caspase-8表達的影響

        2021-10-26 12:57:02姜夢婕
        中成藥 2021年10期
        關(guān)鍵詞:茯苓氧氟沙星盆腔炎

        江 利, 姜夢婕, 韓 克

        (南京大學醫(yī)學院附屬泰康仙林鼓樓醫(yī)院,江蘇 南京 210000)

        慢性盆腔炎是婦科常見疾病,是女性生殖器官及周圍組織出現(xiàn)的炎癥,主要包括子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、盆腔腹膜炎等[1]。臨床常表現(xiàn)為易疲勞、下腹墜痛、白帶增多等。嚴重者會導致不孕。由于慢性盆腔炎具有久治難愈,易反復的特點,對患者身心帶來嚴重傷害[2]。目前慢性盆腔炎常見的西醫(yī)治療方法以抗生素為主,雖然具有一定療效,但是易產(chǎn)生耐藥性,難以治愈[3]。

        中醫(yī)認為慢性盆腔炎是陰陽失調(diào)、火毒濕熱、氣滯血瘀所引起,桂枝茯苓丸主治氣於經(jīng)閉,適用于消癥。有研究表明,桂枝茯苓丸加減可改善慢性盆腔炎患者臨床體征,緩解疼痛感,并且藥物安全性高[4]。桂枝茯苓丸治療慢性盆腔炎的作用機制尚有待研究。有研究表明,終止或緩解炎性反應與細胞發(fā)生凋亡有關(guān),其中半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)參與細胞凋亡,并在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[5]。本研究探討桂枝茯苓丸對慢性盆腔炎大鼠炎癥反應的影響及子宮組織caspase-3、caspase-8表達的變化,為桂枝茯苓丸在臨床治療上的應用提供理論依據(jù)。

        1 材料

        1.1 動物 90只8~12周齡無特定病原體(SPF)級Wistar雌性大鼠,體質(zhì)量210~230 g,購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2018-0010。

        1.2 菌株 大腸桿菌ATCC25922與金黃色葡萄球菌ATCC25923均購自中國國家菌種庫。

        1.3 藥物與試劑 桂枝茯苓丸購自成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司(國藥準字Z20027562);左氧氟沙星購自北京第一三共制藥有限公司(國藥準字H20000655)。大鼠白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒均購自美國R&D systems公司(批號R180412、R180622、R180703);蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司(批號201806A);原位末端轉(zhuǎn)移酶標記技術(shù)(TUNEL)檢測試劑盒購自美國羅氏公司(批號20180413);核糖核酸(RNA)提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自德國QIAGEN公司(批號180126);蛋白提取試劑盒購自深圳子科生物科技有限公司(批號20181018);蛋白質(zhì)免疫印跡法(WB)試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司(批號R201807045)。引物合成委托蘇州泓迅生物科技股份有限公司。

        1.4 儀器 BX43光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司;Sunrise酶標儀購自瑞士Tecan公司;RM2125RTS切片機購自德國徠卡公司;KH20R高速冷凍離心機購自湖南凱達科學儀器有限公司;CFX96Touch熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀購自美國伯樂公司。

        2 方法

        2.1 造模與給藥 從90只SPF級Wistar雌性大鼠中隨機挑選75只建立慢性盆腔炎模型[6]。大鼠麻醉后,使用磨去針頭尖的10 mL注射器針頭從陰道底部的子宮頸分叉處進入一側(cè)宮腔,并子宮腔內(nèi)來回劃2次,造成子宮內(nèi)膜組織機械性損傷,使用2×109個/mL金黃色葡萄球菌和大腸桿菌1∶1混合菌液0.1 mL從子宮子宮另一側(cè)宮腔方向注入,倒置2 min以防菌液漏出;余下15只記作假手術(shù)組,不進行機械損傷,僅向子宮腔內(nèi)注射0.1 mL的生理鹽水。于建模后第7天隨機挑出3只建模大鼠,取子宮組織,HE染色觀察病理變化,以判斷建模是否成功。將建模成功大鼠隨機分為模型組,左氧氟沙星組,桂枝茯苓丸高、中、低劑量組,桂枝茯苓丸高、中、低劑量組分別給予18、9、4.5 g/kg桂枝茯苓丸混懸于生理鹽水中灌胃,左氧氟沙星組給予30 mg/kg左氧氟沙星溶于生理鹽水中灌胃,假手術(shù)組和模型組灌胃等量的生理鹽水,每日1次,連續(xù)給藥21 d。

        2.2 血清促炎因子檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA),在給藥前后檢測大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平。取大鼠尾靜脈血,室溫靜置2 h,1 000×g離心20 min,上層清液即為血清。按照ELISA試劑盒說明書操作,檢測大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平,使用酶標儀在450 nm波長處讀取各樣品OD值。

        2.3 子宮病理學觀察 將大鼠頸椎脫臼處死,剖取子宮,在4%多聚甲醛溶液中固定,經(jīng)過脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、復水后,按照試劑盒說明書進行HE染色,封片后在光學顯微鏡下觀察。

        2.4 子宮細胞凋亡率檢測 切片制備過程同“2.3”項下,復水后按照TUNEL試劑盒說明書操作,封片后在光學顯微鏡下觀察。選取隨機不重疊的5個視野,使用配套計算機軟件分析細胞凋亡率。

        2.5 子宮caspase-3、caspase-8 mRNA表達檢測 取大鼠子宮組織,加入少許液氮研磨勻漿,使用RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒,提取組織中的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI Genebank中的目的基因mRNA序列,設計出正反向引物。caspase-3正向引物為5′-AGACTAGGATCGATACCATT-3′,反向引物為5′-TTGATCGATCAATCGATGCCAT-3′;caspase-8正向引物為5′-TACCTGCTAATCGATTACAGCC-3′,反向引物為5′-GTAGTCCATGATACAGGTTA-3′;β-actin正向引物為5′-TGATAGGCCATAATCCGATAG-3′,反向引物為5′-GATTGCTTAAGCTAAGGATC-3′。反應體系為cDNA 1 μL,dNTP 1 μL,配套熒光預混劑1 μL,正反向引物各1 μL,ddH2O 15 μL,總體積20 μL。經(jīng)過預變性95 ℃ 3 min,40個循環(huán)條件為解鏈95 ℃ 30 s,退火56 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s。通過配套熒光采集系統(tǒng)檢測樣本CT值,并以β-actin為內(nèi)參計算目的基因表達。

        2.6 子宮caspase-3、caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8蛋白表達檢測 取大鼠子宮組織,加入少許液氮研磨勻漿,使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白,加入上樣緩沖液,于沸水中煮沸變性處理5 min。按照WB檢測試劑盒說明書操作,經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗、二抗處理后,進行化學發(fā)光顯色,使用QuantityOne軟件對條帶灰度值進行分析,以β-actin為內(nèi)參得出目的蛋白表達。

        3 結(jié)果

        3.1 血清促炎因子水平 大鼠造模過程中出現(xiàn)4只死亡,解剖發(fā)現(xiàn)大量腹水。分組情況為假手術(shù)組15只,左氧氟沙星組、模型組和桂枝茯苓丸高劑量組各14只,桂枝茯苓丸中、低劑量組各13只,模型組由于灌胃操作不當導致1只大鼠死亡。大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平:給藥后左氧氟沙星組,桂枝茯苓丸高、中、低劑量組均低于給藥前;給藥前,模型組、左氧氟沙星組和桂枝茯苓丸高、中、低劑量組均高于假手術(shù)組;給藥后,模型組均高于假手術(shù)組(P<0.01),左氧氟沙星組與桂枝茯苓丸高、中、低劑量組均低于模型組(P<0.01),與左氧氟沙星組比較,桂枝茯苓丸高劑量組降低(P<0.01),低劑量組升高(P<0.01),見表1。

        表1 給藥前后大鼠血清促炎因子水平

        3.2 大鼠子宮組織病理學觀察 假手術(shù)組子宮內(nèi)膜無充血、上皮組織結(jié)構(gòu)清晰完整,上皮細胞排列整齊;模型組可見大量炎性細胞浸潤,子宮內(nèi)膜擴張充血,纖維結(jié)締組織增生嚴重;左氧氟沙星組與桂枝茯苓丸中劑量組炎性細胞浸潤減少,子宮內(nèi)膜充血減輕,纖維組織減少;桂枝茯苓丸高劑量組炎性浸潤減少,子宮內(nèi)膜輕度充血,未見結(jié)締組織增生;桂枝茯苓丸低劑量組較明顯炎性細胞浸潤,子宮內(nèi)膜輕度充血,結(jié)締組織增生明顯,見圖1。

        圖1 大鼠子宮病理切片(HE染色,×400)

        3.3 大鼠子宮細胞凋亡率 模型組細胞凋亡率高于假手術(shù)組(P<0.01);左氧氟沙星組和桂枝茯苓高、中、低劑量組均高于模型組(P<0.01);與左氧氟沙星組比較,桂枝茯苓丸高劑量組升高(P<0.01),低劑量組降低(P<0.01),見圖2、表2。

        圖2 子宮組織細胞凋亡(TUNEL,×400)

        表2 各組細胞凋亡率

        3.4 子宮caspase-3、caspase-8 mRNA表達caspase-3、caspase-8 mRNA表達為模型組高于假手術(shù)組(P<0.01);左氧氟沙星組和桂枝茯苓丸高、中、低劑量組均高于模型組(P<0.05,P<0.01);與左氧氟沙星組比較,桂枝茯苓丸高劑量組升高(P<0.01),低劑量組降低(P<0.01),見表3。

        表3 子宮caspase-3、caspase-8 mRNA表達

        3.5 子宮caspase-3、caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8蛋白表達 子宮caspase-3、caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8蛋白表達為模型組高于假手術(shù)組(P<0.05);左氧氟沙星組與桂枝茯苓丸高、中、低劑量組均高于模型組(P<0.05);與左氧氟沙星組比較,桂枝茯苓丸高劑量組升高(P<0.05),低劑量組降低(P<0.05),見圖3、表4。

        表4 子宮caspase-3、caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8蛋白表達

        圖3 子宮caspase-3、caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8蛋白表達

        4 討論

        慢性盆腔炎主要病原體來源有2類。一類是來自陰道寄居菌群如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等,另一類來自性傳播病原如沙眼衣原體、淋病奈氏菌等[7]。目前針對慢性盆腔炎的治療以抗生素為主,但是抗生素的療效尚不能令人滿意,此外其毒副作用明顯,因此,需要尋找高效低毒的替代藥物。有研究表明桂枝茯苓丸配合抗生素在慢性盆腔炎臨床治療中表現(xiàn)出顯著療效,但其作用機制尚未探明[8-9]。研究桂枝茯苓丸對慢性盆腔炎的治療效果及其機制,首先需要復制與臨床接近的慢性盆腔炎模型。本研究選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合液感染加機械損傷的方法建立大鼠慢性盆腔炎模型[10]可以較好模擬臨床病理過程。

        中醫(yī)認為,慢性盆腔炎由于瘀血阻滯,寒濕凝滯所致[11]。桂枝茯苓丸的主要成分有桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、芍藥,以桂枝、茯苓為君藥。桂枝可散寒止痛,溫通經(jīng)脈;茯苓可安神健脾,利尿除濕;牡丹皮可活血化瘀,清熱涼血;桃仁可潤腸通便,活血化瘀;芍藥可化瘀消腫,清熱止痛。五味藥聯(lián)合使用,具有溫養(yǎng)祛邪、活血化瘀、緩解消癥的功效[12-13]。因此,本研究使用桂枝茯苓丸治療慢性盆腔炎具有可行性。左氧氟沙星為廣譜類抗生素,對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等具有較好抗菌作用,是臨床治療慢性盆腔炎常用藥物,因此選用左氧氟沙星作為本研究的陽性對照具有可比性。

        IL-1β、IL-6和TNF-α均為細胞因子,均發(fā)揮促進炎癥反應,加劇組織炎性浸潤的作用[14]。IL-1β在正常組織中水平很低,當發(fā)生組織損傷或炎癥反應時,IL-1β會大量產(chǎn)生并進一步誘導下游促炎因子的釋放[15]。IL-6可與中性粒細胞結(jié)合,使中性粒細胞發(fā)生形態(tài)改變,進而激活機體炎癥反應,加劇組織病理損傷[16]。TNF-α既是促炎因子又是巨噬細胞活化因子,在炎癥反應中發(fā)揮著重要作用。TNF-α雖然有利于機體抗病原體感染,但過量可導致機體發(fā)生病變[17]。有研究表明,慢性盆腔炎患者血清中TNF-α水平與組織損傷成正比[18]。本研究中慢性盆腔炎大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平均升高,而經(jīng)過桂枝茯苓丸治療后,IL-1β、IL-6和TNF-α水平均降低。由此表明,桂枝茯苓丸可抑制炎癥反應。

        炎癥的抑制與消除的過程與細胞凋亡關(guān)系密切。本研究TUNEL結(jié)果表明,桂枝茯苓丸治療后大鼠子宮組織細胞凋亡率升高。由此可證,桂枝茯苓丸可促大鼠子宮組織細胞凋亡。當炎性反應發(fā)生時,促凋亡因子caspase-8可被蛋白酶剪切成為cleaved caspase-8,cleaved caspase-8可剪切caspase-3形成cleaved caspase-3,cleaved caspase-3可活化Bcl-2家族引起促炎細胞凋亡,從而抑制炎癥反應,有利于炎癥的吸收消散[19]。caspase-8可抑制炎性小體NLRP3和Ⅰ型干擾素信號通路,從而抑制如IL-1β、IL-6、TNFα等促炎因子的釋放,此外,caspase-8還可促進細胞增殖,有利于炎癥損傷組織修復[20]。有研究表明,caspase-3和caspase-8參與大鼠慢性盆腔炎消退的過程[21]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過桂枝茯苓丸治療后,大鼠子宮組織中caspase-3和caspase-8表達均升高。由此推測,桂枝茯苓丸治療慢性盆腔炎的作用機制可能與上調(diào)caspase-3和caspase-8表達有關(guān)。

        綜上所述。桂枝茯苓丸可抑制慢性盆腔炎大鼠炎癥反應,改善子宮組織病變,促進細胞凋亡,對慢性盆腔炎具有治療作用,推測其作用機制可能與上調(diào)caspase-3、caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8表達有關(guān)。但由于細胞凋亡誘導途徑較多,本研究僅對caspase-3和caspase-8表達進行研究,桂枝茯苓丸是否影響其他細胞凋亡途徑尚未可知,仍需進一步研究。

        猜你喜歡
        茯苓氧氟沙星盆腔炎
        Antihepatofibrotic effect of Guizhifuling pill (桂枝茯苓丸) on carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice
        健脾安神話茯苓
        茯苓健脾 孩子健康
        桂枝茯苓透皮貼劑的制備
        中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:17
        中西醫(yī)結(jié)合治療慢性盆腔炎的療效觀察
        左氧氟沙星致癲癇持續(xù)狀態(tài)1例
        鹽酸左氧氟沙星治療盆腔炎的療效觀察
        左氧氟沙星及莫西沙星引起神經(jīng)毒性1例
        中西醫(yī)結(jié)合治療慢性盆腔炎30例
        中西醫(yī)結(jié)合治療慢性盆腔炎48例
        久久无码av一区二区三区| 一区二区三区国产在线网站视频| 亚洲成AⅤ人在线观看无码| 中国精品视频一区二区三区| 日韩女优一区二区视频| 久久久免费精品国产色夜| 91久久精品国产综合另类专区| 乱人伦精品视频在线观看| 欧美一区二区三区久久综| 91在线精品老司机免费播放| 亚洲中文字幕无线乱码va| 女人被躁到高潮嗷嗷叫免| 摸进她的内裤里疯狂揉她动图视频| 十八岁以下禁止观看黄下载链接| 欧美在线Aⅴ性色| 国产黄片一区二区三区| 久久国产精品一国产精品金尊| 亚洲男同志网站| 精品国产一级毛片大全| 韩国无码精品人妻一区二| 国产三级精品三级在线| 日韩精品一区二区免费| 老师开裆丝袜喷水视频| 亚洲成av人片在线观看无码| 国产91精品成人不卡在线观看| 中文字幕乱码人妻无码久久久1| 亚洲视频在线免费观看一区二区| 国产成人高清在线观看视频| 日韩日韩日韩日韩日韩日韩| 国产乱子伦精品免费无码专区 | 日本一区二区三区激情视频| 91羞射短视频在线观看 | 精品一区二区三区不老少妇| 午夜少妇高潮在线观看视频| 人禽杂交18禁网站免费| 国产又爽又黄又刺激的视频| 亚洲AV无码精品蜜桃| 手机在线观看成年人视频| 欧美xxxxx在线观看| 国产成人综合久久精品免费| 99re国产电影精品|