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        基于多元統(tǒng)計(jì)分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)延胡索醋制前后潛在質(zhì)量標(biāo)志物

        2021-10-26 12:56:28賈宇然余伯陽(yáng)李任時(shí)
        中成藥 2021年10期
        關(guān)鍵詞:紫堇罌粟堿乙素

        賈宇然, 余伯陽(yáng), 李任時(shí)

        (中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院中藥可追溯與標(biāo)準(zhǔn)化研究中心,江蘇 南京 211198)

        延胡索為罌粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖,始載于《雷公炮炙論》,有活血散瘀、利氣止痛的功能,主治心腹腰膝疼痛、跌打損傷、瘀血作痛、月經(jīng)不調(diào)等癥,是一味傳統(tǒng)的止痛中藥[1],其主要成分是生物堿,包括叔胺堿,季銨堿,堿性酚胺生物堿等,還含有少量樹(shù)脂、黏液質(zhì)、揮發(fā)油等[2-3]。目前,延胡索臨床應(yīng)用以醋制品為多,其所含游離生物堿與醋酸結(jié)合后生成易溶于水的醋酸鹽,同時(shí)炮制后飲片質(zhì)地變軟,提高了生物堿類成分的提取率?,F(xiàn)代研究表明,醋性味酸、苦、溫,具有引藥入肝、散瘀止痛活性,醋制后可增強(qiáng)舒肝止痛作用[4-5]。

        目前,關(guān)于生、醋延胡索質(zhì)量控制方法主要有2種,一是基于《中國(guó)藥典》延胡索質(zhì)控指標(biāo)——延胡索乙素,二是結(jié)合近紅外光譜[6]、HPLC指紋圖譜[7-9],但前者不能全面控制藥材質(zhì)量,后者并未系統(tǒng)研究藥材醋制前后化學(xué)成分與藥效、藥性改變的關(guān)聯(lián)?;谥兴庂|(zhì)量控制研究困境,劉昌孝院士提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-marker)的概念,結(jié)合天然化學(xué)、分析化學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)、藥理學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等學(xué)科,構(gòu)建更科學(xué)的質(zhì)量控制理論[10-12]。

        本研究將HPLC與多元統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合,篩選、鑒定延胡索醋制前后的特征差異性成分,預(yù)測(cè)潛在質(zhì)量標(biāo)志物,探究其變化規(guī)律。再通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析潛在質(zhì)量標(biāo)志物與鎮(zhèn)痛作用相關(guān)靶點(diǎn)和通路,從而驗(yàn)證其用于質(zhì)量控制合理性,以期為相關(guān)質(zhì)量控制研究提供理論依據(jù)。

        1 材料

        1.1 藥材與試劑 藥材信息見(jiàn)表1,經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)余伯陽(yáng)教授鑒定為罌粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥塊莖,標(biāo)本保存于中國(guó)藥科大學(xué)中藥可追溯與標(biāo)準(zhǔn)化中心。磷酸、三乙胺、甲酸銨、乙酸銨、甲酸、冰乙酸(色譜級(jí),上海阿拉丁生化科技股份有限公司);乙腈(色譜級(jí),德國(guó)默克公司);甲醇(色譜級(jí),上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?;氨水(分析級(jí),南京化學(xué)試劑股份有限公司);龍門(mén)米醋(食品級(jí),北京二商龍和食品有限公司)。對(duì)照品延胡索乙素(18050203,純度≥98%,成都普非德生物技術(shù)有限公司);延胡索甲素(19042601,純度≥98%,四川省維克奇生物科技有限公司);去氫紫堇堿(18111303,純度≥98%,成都普非德生物技術(shù)有限公司);海罌粟堿(19042412,純度≥98%,四川省維克奇生物科技有限公司)。醋延胡索均由生品經(jīng)醋制得到,編號(hào)CS1~CS21。

        表1 樣品信息

        1.2 儀器 Agilent InfinityⅡ Prime 1260儀、InfinityLab Poroshell 120 EC-C18柱(2.1 mm×150 mm,2.7 μm,美國(guó)安捷倫公司);JYH-B40Q1小型煎藥壺(小熊電器股份有限公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)密理博公司);TOKIT智能熱敏爐炒鍋(上海純米電子科技有限公司);BM-1200電子天平(啟東友銘衡器有限公司)。

        2 方法

        2.1 生、醋延胡索特征差異成分分析

        2.1.1 生、醋延胡索制備

        2.1.1.1 生延胡索 去除雜質(zhì),切片備用。

        2.1.1.2 醋延胡索 凈延胡索,加20%醋拌勻,悶透,置炒制容器內(nèi),炒干,取出,放涼,切片備用[13]。

        2.1.2 供試品溶液制備 稱取延胡索、醋延胡索飲片各100 g,加水700 mL,浸泡30 min,煮沸后繼續(xù)煎煮30 min,200目篩趁熱過(guò)濾;再加入600 mL水,煮沸后繼續(xù)煎煮20 min,同法過(guò)濾,合并濾液。濾液減壓濃縮(≤50 ℃)至500 mL,得水提液[14-15],搖勻,取水提液5 mL,精密加入濃氨試液-甲醇(1∶20)混合溶液5 mL,混勻后靜置30 min,水浴鍋蒸干,殘?jiān)?0%甲醇復(fù)溶,定容至5 mL,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

        2.1.3 對(duì)照品溶液 精密稱取延胡索乙素、去氫紫堇堿、海罌粟堿、延胡索甲素對(duì)照品適量,加甲醇溶解,制備成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液。

        2.1.4 色譜條件 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,2.7 μm);流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸(三乙胺調(diào)pH值至7.0),梯度洗脫,程序見(jiàn)表2;體積流量0.3 mL/min;柱溫35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;進(jìn)樣量5 μL。

        表2 梯度洗脫程序

        2.1.5 多元統(tǒng)計(jì)分析 本研究將HPLC數(shù)據(jù)經(jīng)Excel軟件預(yù)處理后,導(dǎo)入Simca-p13.0軟件進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis, OPLS-DA),OPLS-DA以變量載荷評(píng)價(jià)參數(shù)(Variable Importance for the Projection, VIP)來(lái)描述變量的貢獻(xiàn)程度,以VIP>1的變量作為特征變量,分析延胡索與醋延胡索水提液差異性,篩選出醋制前后特征差異成分。

        2.2 潛在質(zhì)量標(biāo)志物驗(yàn)證分析

        2.2.1 特征差異成分潛在作用靶點(diǎn)篩選 特征差異成分在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其化學(xué)結(jié)構(gòu)圖的sdf.格式以及Smiles化學(xué)式。登錄反向藥效團(tuán)匹配數(shù)據(jù)庫(kù)“PharmMapper”上傳sdf.格式文件,然后選擇Pharmacophore Models Whose Pkd ≥ 6.0,設(shè)置匹配的靶點(diǎn)數(shù)目為300,點(diǎn)擊submit,獲取每種化學(xué)成分對(duì)應(yīng)排名前300的靶點(diǎn)。將活性成分對(duì)應(yīng)的Smiles化學(xué)式輸入SEA與SIB數(shù)據(jù)庫(kù),得到作用靶點(diǎn),為提高作用靶點(diǎn)的準(zhǔn)確度,將這3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)得到的作用靶點(diǎn)取交集,作為化學(xué)標(biāo)記物潛在作用靶點(diǎn),即為成分靶點(diǎn)。運(yùn)用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(UniProt)中UniProtKB搜索功能,通過(guò)輸入靶點(diǎn)名稱并限定物種為人,將檢索得到的所有靶點(diǎn)校正為其官方名稱后,獲取與活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)和Unitprot編號(hào)。

        2.2.2 疾病潛在作用靶點(diǎn)篩選 利用在線文本挖掘服務(wù)器GeneCards、HOME-NCBI-GENE、人類孟德?tīng)栠z傳OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)輸入關(guān)鍵詞查找分析相關(guān)的人類基因。通過(guò)輸入關(guān)鍵詞“Analgesia”得到與鎮(zhèn)痛相關(guān)的作用靶點(diǎn),即疾病靶點(diǎn)。

        2.2.3 作用靶點(diǎn)富集分析及通路圖繪制 應(yīng)用ClueGO version 2.3.4軟件與其插件CluePedia分析工具,對(duì)特征差異成分作用靶點(diǎn)The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路作富集分析。利用DAVID Bioinformatics Resources 6.8數(shù)據(jù)庫(kù),輸入由ClueGO軟件得出的P<0.05的通路,整合繪制最終的通路圖。

        3 結(jié)果

        3.1 潛在質(zhì)量標(biāo)志物篩選

        3.1.1 指紋圖譜建立 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備21批供試品溶液,在“2.1.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析,將“AIA”文件導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版),建立圖譜,見(jiàn)圖1~3。結(jié)果表明,21批延胡索供試品溶液色譜峰數(shù)目無(wú)顯著差異,不同批次之間相同色譜峰峰面積有一定差異,表明不同產(chǎn)地延胡索成分種類無(wú)明顯差異,但是含量差異顯著;延胡索與醋延胡索供試品溶液色譜峰數(shù)目無(wú)顯著差異,醋制后部分色譜峰面積明顯增加,表明醋制提高了化學(xué)成分的溶出。

        圖1 21批延胡索指紋圖譜

        圖2 21批醋延胡索指紋圖譜

        注:A為延胡索供試品溶液,B為醋延胡索供試品溶液。

        3.1.2 OPLS-DA分析 結(jié)果見(jiàn)圖4~5,可知生、醋延胡索能得到較好的分離,模型驗(yàn)證結(jié)果(R2X=0.801,R2Y=0.918,Q2=0.844)證明其可靠程度較高。其中,26、23、21、17、10號(hào)峰VIP值大于1,可能為延胡索醋制前后的特征差異性成分。

        注:CR、VCR分別為延胡索、醋延胡索。

        結(jié)合對(duì)照品比對(duì),可知26號(hào)峰為延胡索甲素,10號(hào)峰未知,23號(hào)峰為延胡索乙素,17號(hào)峰為去氫紫堇堿,21號(hào)峰為海罌粟堿。大量研究表明,此類成分大多具有鎮(zhèn)痛活性,可能是生、醋延胡索藥效差異性的物質(zhì)基礎(chǔ),需進(jìn)一步通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證[16-18]。

        圖5 各樣品VIP得分圖

        3.2 方法學(xué)考察

        3.2.1 線性關(guān)系考察 取延胡索乙素、去氫紫堇堿、海罌粟堿、延胡索甲素對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成質(zhì)量濃度為250 μg/mL的貯備液,取適量稀釋,在“2.1.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸,結(jié)果見(jiàn)表3,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

        表3 各成分線性關(guān)系

        在S/N=3時(shí)計(jì)算檢測(cè)限,S/N=10時(shí)計(jì)算定量限,結(jié)果延胡索乙素、去氫紫堇堿、海罌粟堿、延胡索甲素檢測(cè)限分別為2.96、2.91、8.12、16.67 μg/mL,定量限分別為9.87、9.70、27.06、55.57 μg/mL。

        3.2.2 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液,在“2.1.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6次,測(cè)得延胡索乙素、去氫紫堇堿、海罌粟堿、延胡索甲素峰面積RSD分別為1.32%、1.38%、1.32%、1.30%,表明儀器精密度良好。

        3.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取飲片適量,按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,在“2.1.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,測(cè)得延胡索乙素、去氫紫堇堿、海罌粟堿、延胡索甲素峰面積RSD分別為1.61%、1.88%、1.43%、1.82%,表明該方法重復(fù)性良好。

        3.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液,于0、3、6、9、12、24 h,在“2.1.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,測(cè)得延胡索乙素、去氫紫堇堿、海罌粟堿、延胡索甲素峰面積RSD分別為0.82%、1.07%、1.10%、1.43%,表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        3.2.5 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的飲片,每份分別加入50%、100%、150%水平對(duì)照品溶液,按“2.1.”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表4。

        表4 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

        3.3 醋制前后潛在質(zhì)量標(biāo)志物含量變化規(guī)律 通過(guò)外標(biāo)曲線法測(cè)定各批次延胡索和醋延胡索水提液中延胡索乙素、去氫紫堇堿、海罌粟堿、延胡索甲素含量,結(jié)果見(jiàn)圖6。

        注:與延胡索水提液比較,** P<0.01。

        結(jié)果表明,不同批各成分含量差異較大,延胡索水提液中延胡索乙素、去氫紫堇堿、海罌粟堿、延胡索甲素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.029 0~0.064 6、0.060 4~0.114 9、0.039 3~0.111 7、0.023 2~0.054 7 mg/g,而醋延胡索水提液中分別為0.045 4~0.087 0、0.075 7~0.122 7、0.066 1~0.176 6、0.063 1~0.978 0 mg/g,表明延胡索醋制后,水提液中主要成分含量提高,其中延胡索乙素、海罌粟堿、延胡索甲素較明顯。上述3種成分均為叔胺堿,不易溶于水,而在醋制過(guò)程中與醋酸結(jié)合生成醋酸鹽,增加在水中的溶解度,從而含量大大提高;去氫紫堇堿為季銨堿,以離子形式溶解于水中,醋制過(guò)程對(duì)其溶出影響不大。

        3.4 潛在質(zhì)量標(biāo)志物作用靶標(biāo)及網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)證 將PharmMapper、SEA和SIA數(shù)據(jù)庫(kù)得到的所有靶點(diǎn)刪除重復(fù),并去除假陽(yáng)性,整合得到化學(xué)標(biāo)記物作用靶點(diǎn)53個(gè)。由GeneCards、HOME-NCBI-GENE-與OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索整合得到的鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)共312個(gè),成分作用靶點(diǎn)與鎮(zhèn)痛作用靶點(diǎn)取交集共得潛在作用靶點(diǎn)20個(gè),主要包括ATP結(jié)合和B亞家族成員1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、乙酰膽堿酯酶、α2 A腎上腺素能受體基因等,與中樞鎮(zhèn)痛相關(guān)的通路有2條,包括神經(jīng)活性配體受體相互作用通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)[19]、多巴胺神經(jīng)通路(Dopaminergic synapse)[20-21],信號(hào)相關(guān)通路有3條,包括cGMP-PKG信號(hào)通路(cGMP-PKG signaling pathway)[22]、cAMP信號(hào)通路(cAMP signaling pathway)[23-24]、鈣離子信號(hào)通路(Calcium signaling path-way)[25]。

        由此表明,特征差異性成分的作用靶點(diǎn)分布于不同的通路,多成分、多靶點(diǎn)相互調(diào)節(jié)是鎮(zhèn)痛的可能作用機(jī)制。通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件建立“成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,見(jiàn)圖7,可知上述靶點(diǎn)、通路與鎮(zhèn)痛作用密切相關(guān),故延胡索乙素、延胡索甲素、去氫紫堇堿、海罌粟堿可作為延胡索醋制前后潛在質(zhì)量標(biāo)志物。

        圖7 基于潛在質(zhì)量標(biāo)志物的“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

        4 討論

        本實(shí)驗(yàn)建立了生、醋延胡索水提液指紋圖譜,通過(guò)對(duì)比,發(fā)現(xiàn)延胡索醋制前后化學(xué)成分種類沒(méi)有變化,但經(jīng)醋制后,各成分的含量有所提高,隨后,采用正交偏最小二乘判別分析對(duì)指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,快速篩選、鑒定出生、醋延胡索的特征差異性成分,結(jié)果表明,延胡索醋制后,延胡索乙素、海罌粟堿、延胡索甲素含量增長(zhǎng)較為明顯,而醋制過(guò)程對(duì)去氫紫堇堿溶出影響不大,可能與相應(yīng)成分的結(jié)構(gòu)特性相關(guān)。最后,結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)特征差異性成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析,進(jìn)一步明確其與生、醋延胡索發(fā)揮鎮(zhèn)痛藥效相關(guān)。初步確定延胡索乙素、延胡索甲素、去氫紫堇堿、海罌粟堿可以作為延胡索潛在質(zhì)量標(biāo)志物,以期為延胡索質(zhì)量控制提供理論基礎(chǔ)。對(duì)于中藥炮制前后物質(zhì)基礎(chǔ)的變化及中藥飲片質(zhì)量控制研究等具有借鑒意義。

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