孟 琳，陳良標

(1.海洋生物科學國際聯(lián)合研究中心(上海海洋大學)中國科學技術部，上海201306；2.水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室(上海海洋大學)，上海201306；3.水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海201306)

血紅蛋白是一種由多肽鏈或4個附屬單元組成的大分子蛋白質(zhì)，在某些低等動物中以游離狀態(tài)存在，在人類中存在于紅細胞中，是血液不可缺少的成分，最重要的功能是將氧氣運送到全身各處[1-2]。血紅蛋白異常會引起多種血紅蛋白分子病，如鐮形細胞貧血癥和地中海貧血癥等[3-4]，且糖化血紅蛋白與糖尿病和心血管疾病有密切關系[5-6]。血紅蛋白水平下降會造成生物體心力衰竭，嚴重損壞機體[7]。但是經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，南極水域中的一種生物體-冰魚Chionodracohamatus體內(nèi)完全不含有血紅蛋白，只靠鰓和皮膚吸收水中的溶解氧，卻可以在水中正常生活[8-10]。這種自然突變體生物的存在，為實驗室構(gòu)建血紅蛋白缺失突變體提供了可行性。

與ZFN和TALEN基因編輯手段相比，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)更高效[11-12]，幾乎可以準確編輯基因組中任何一個位點，被廣泛應用于動植物等模式生物中[13-15]。斑馬魚(Daniorerio)是一種常見的小型淡水魚，具有許多得天獨厚的優(yōu)點：如體積小，便于飼養(yǎng)；進行體外受精，易于得到受精卵；產(chǎn)卵多，一次可多達幾百顆；受精卵透明度清晰可見，便于觀察發(fā)育情況；達到性成熟時間短等，是一種適合研究基因功能的理想模式生物[16-17]。

目前NCBI上有14個已知的斑馬魚血紅蛋白基因，可分為α亞型和β亞型兩種類型，分布在3號和12號染色體上，這些基因有些調(diào)控斑馬魚胚胎期血紅蛋白的生成，有些調(diào)控斑馬魚成熟期血紅蛋白的生成。hbae1.1基因(GenBank號：NM_182940)是斑馬魚血紅蛋白基因家族中的一員，是血紅蛋白α鏈上的一個基因，且是位于3號染色體上的第一個調(diào)控胚胎期血紅蛋白的生成，在血紅蛋白基因家族中居于重要位置。此外，將斑馬魚的hbae1.1所編碼的蛋白進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)斑馬魚的hbae1.1蛋白與人HBA1蛋白兩者之間具有同源性，而HBA1基因突變在人類中會引起多種異常血紅蛋白病和α地中海貧血癥。然而關于hbae1.1基因在斑馬魚中的具體功能和作用尚無研究報道，hbae1.1基因本身缺失造成的影響也未見報道。本研究利用CRISPR/Cas9技術敲除hbae1.1基因，研究hbae1.1基因?qū)Π唏R魚血紅蛋白生成的影響，以期為研究魚類血紅蛋白的發(fā)生發(fā)育提供一定基礎，同時也為與血紅蛋白相關的人類疾病的探究提供一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 斑馬魚

AB品系野生斑馬魚購自中科院遺傳與發(fā)育生物學研究所，斑馬魚飼養(yǎng)環(huán)境均相同，養(yǎng)殖在上海海圣循環(huán)系統(tǒng)中，本實驗室斑馬魚房飼養(yǎng)環(huán)境非常適宜斑馬魚的生長和繁殖。

1.1.2 主要試劑

PremixTaq酶(RR901)購自TaKaRa公司；gRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒MAXIscriptTMT7 invitroTranscription Kit (AM1314 )購自Ambion公司；Cas9蛋白GenCrispr NLS-Cas9-NLS Nuclease(Z03389-100)購自金斯瑞公司；T7E1內(nèi)切酶T7 Endonuclease I(M0302S)購自NEB公司；DNA產(chǎn)物純化試劑盒TIANquick Midi Purification Kit(DP204-02)和基因組DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA kit(DP304-03)購自天根公司；o-Dianisidine粉末購自Sigma公司；4% PFA購自Lab Top公司。

1.1.3 主要儀器

Eppendorf顯微注射儀和ZEISS高端立體顯微鏡購自德國;常規(guī)PCR儀、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 敲除靶點及檢測引物的設計

從Ensembl(http://asia.ensembl.org/index.html)網(wǎng)站上查找到hbae1.1基因序列，在ZiFiT(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)網(wǎng)站上設計敲除的靶點，并將靶點在http://asia.ensembl.org/Danio_rerio /Tools /Blast?db =core網(wǎng)站上進行blast，檢測靶點的特異性。設計的靶點位于反義鏈上，靶點名稱是T-hbae1.1，靶點序列是GGAAAGCATGGAGCTCACTG。

根據(jù)靶點的位置，設計檢測引物，由于利用T7E1酶(一種可以識別并切割錯配DNA Holliday結(jié)構(gòu)的酶)檢測突變體，故設計引物有以下幾個原則：(1)正反向引物各自距靶點位置不少于100 bp，且正反向引物距靶點的距離差距不少于50 bp；(2)PCR擴增片段要適中，大小為300～500 bp；(3)PCR條帶要單一，無雜帶。在NCBI網(wǎng)站上設計出檢測引物，并在生工公司進行合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence of hbae1.1

1.2.2 體外轉(zhuǎn)錄gRNA

gRNA模板的制備：用PremixTaq酶進行PCR擴增，反應條件為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min；4 ℃，∞。再用DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。純化后的gRNA模板按照體外轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟體外轉(zhuǎn)錄成RNA，并用氯化鋰沉淀法純化RNA。純化后的RNA用NanoDrop測定濃度，凝膠電泳檢測質(zhì)量及大小，并保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 顯微注射敲除的檢測

gRNA和cas9蛋白按照100 ng/μL∶800 ng/μL的比例混合制成混合液，將混合液注射到斑馬魚受精卵一細胞期的動物極，注射量為1 nL。受精卵注射后，放在28 ℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。隨機取多條注射72 h后的小魚于EP管中，每條小魚置一個EP管，用基因組DNA提取試劑盒提取小魚的DNA，并用表1中的檢測引物進行PCR，反應體系為PremixTaq酶，12.5 μL；hbae1.1-F，0.7 μL；hbae1.1-R，0.7 μL；DNA，1.5 μL；ddH2O，9.6 μL。反應條件為95 ℃預變性3 min；95 ℃變性45 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；4 ℃，∞。PCR產(chǎn)物用T7E1酶進行酶切，將成功酶切出條帶的PCR產(chǎn)物送到生工公司測序，若敲除成功，峰圖會從靶點位置出現(xiàn)套峰。

1.2.4 可遺傳的F0代斑馬魚的檢測

將敲除成功的小魚養(yǎng)至成魚即為F0代，同時留一部分同一批未注射的WT受精卵作為對照組，與F0代小魚一起飼養(yǎng)。性成熟的成魚F0代與對照組WT交配，所產(chǎn)受精卵培養(yǎng)48 h后，每10顆卵為一管，提取其基因組DNA，并進行測序，檢測F0代斑馬魚是否可將突變成功遺傳至后代，若F0代能夠遺傳，并將有突變的F1受精卵飼養(yǎng)起來。

1.2.5 F1代雜合子的篩選

F1飼養(yǎng)2個月，通過剪尾提取DNA，PCR反應體系和反應條件同1.2.3，PCR產(chǎn)物送測，確定F1代的突變類型。并大量篩選F1代斑馬魚，篩選出具有相同突變類型的雌雄斑馬魚。

1.2.6 F2代純合子的篩選

將相同突變類型的性成熟的成魚F1代進行內(nèi)交，將所產(chǎn)胚胎進行培養(yǎng)，并在孵化期間，每隔2 h觀察F2代胚胎的發(fā)育情況，查看是否有異常死亡。所產(chǎn)后代飼養(yǎng)2個月，提取基因組DNA，T7E1酶切PCR產(chǎn)物，未酶切出條帶的個體為WT或純合子，再通過測序及序列比對，篩選出F2代純合子。

1.2.7 固藍(o-Dianisidine)染色

血紅蛋白有類似過氧化物酶的活性，可以催化過氧化氫釋放出氧，使o-Dianisidine發(fā)生顏色變化，最終呈現(xiàn)出鐵銹色的顏色，從而觀察斑馬魚胚胎血紅蛋白的合成情況。其具體實驗步驟如下：(1)將純合子雌雄魚和WT雌雄魚分別進行交配，同時產(chǎn)卵，收集各自所產(chǎn)受精卵置于不同培養(yǎng)皿中，并放在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，進行o-Dianisidine染色，觀察胚胎血紅蛋白的合成情況。(2)配置o-Dianisidine染液：全程避光，現(xiàn)用現(xiàn)配。取6 mgo-Dianisidine粉末置于1 mL ddH2O中，配成濃度為6 mg/mL的o-Dianisidine溶液，取60 μL現(xiàn)配的o-Dianisidine溶液置于新的EP管中，加入質(zhì)量分數(shù)為30%的雙氧水13 μL，pH 4.5、3 mol/L的醋酸鈉2 μL，無水乙醇240 μL，再加入ddH2O定容到600 μL，配置成o-Dianisidine染液。(3)分別收集純合子和WT胚胎置于EP管中，向EP管中加入600 μL固藍染液，放在搖床上避光染色15 min，去除染液，PBST漂洗3次，每次3 min。(4)向EP管中加入質(zhì)量分數(shù)為4%的PFA固定6 h，去除4% PFA，PBST漂洗3次，每次3 min。(5)顯微鏡觀察染色情況并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶點gRNA的鑒定

將靶點設計在hbae1.1基因的2號外顯子上(圖1)，并將靶點gRNA進行體外轉(zhuǎn)錄，體外轉(zhuǎn)錄后的濃度用NanoDrop測定為960 ng/μL，質(zhì)量分數(shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示(圖2)，條帶大小為136 bp，條帶大小正確，且質(zhì)量良好、無降解，成功制備出gRNA。

圖1 gRNA在hbae1.1基因上的位置Figure 1 The location of gRNA on hbae1.1 gene

圖2 gRNA體外轉(zhuǎn)錄電泳圖Figure 2 In vitro transcription electrophoresis of gRNA

2.2 F0代基因敲除的檢測

為了檢測敲除情況，用T7E1酶進行酶切，酶切結(jié)果顯示：T7E1酶共酶切13個PCR產(chǎn)物，其中WT為2個，其余注射的PCR產(chǎn)物為1～11號，注射的11條小魚中，有9條被酶切出2條帶，其片段大小分別為289 bp和168 bp，而WT未被酶切出條帶，只有一條目的條帶，說明敲除靶點有效，且敲除效率很高。將切除條帶的PCR產(chǎn)物送測，測序峰圖顯示靶點位置及以后全部出現(xiàn)套峰，表明敲除hbae1.1基因成功(圖3)。

圖3 F0基因敲除T7E1酶切結(jié)果和測序峰圖Figure 3 T7E1 assay and sequencing analysis of F0 knock-out after injection

2.3 F1代雜合子的篩選

將F0代與WT進行交配，所產(chǎn)后代通過測序，篩選出突變類型為-11 bp和-4 bp兩種類型的F1代雜合子。從圖4可以看出，2種突變體類型均發(fā)生移碼突變，所編碼的氨基酸序列發(fā)生改變。

2.4 F2代純合子的篩選

F1代雜合子內(nèi)交，所產(chǎn)F2代胚胎通過觀察，與WT斑馬魚發(fā)育相比，無明顯異常。通過測序，成功篩選出-11 bp和-4 bp的F2代純合子(圖5)。

圖5 2種突變類型的純合子的篩選Figure 5 Screening of homozygotes of two mutation types

2.5 固藍染色

同時對48 h后的純合子和WT胚胎進行固藍染色，結(jié)果顯示：與野生型斑馬魚WT相比，hbae1.1基因缺失的純合子突變體的血紅蛋白含量明顯減少。表明hbae1.1基因的缺失會影響斑馬魚血紅蛋白的生成(圖6)。

圖6 固藍染色結(jié)果Figure 6 Result of o-Dianisidine

3 討論

血紅蛋白在人類和大部分脊椎動物中起著多種功能，不僅有儲存氧氣，并將氧氣從肺、鰓或其他呼吸器官運送到需要氧氣進行高效新陳代謝的周圍組織的功能，而且有維持血液酸堿穩(wěn)定的功能[18-20]。此外，還有使血管擴張、維持血壓以及抗菌等功能。所以人類和大部分脊椎動物缺失血紅蛋白會無法正常呼吸進而導致死亡，但是完全無血紅蛋白的冰魚卻依然能夠呼吸，正常生存，因此，冰魚可作為人類相關血液疾病的自然突變模型[21]。

斑馬魚和人類同為脊椎動物，兩者之間血紅蛋白具有同源性，利用同源性的特點，通過構(gòu)建斑馬魚血紅蛋白基因缺失的突變體模型，獲得相應病理學知識，為人類血液疾病的治療及預防提供有價值的參考[22]。研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，通過顯微注射技術注射Cas9蛋白-gRNA的混合物，同時同一批未注射的WT受精卵作為對照，敲除斑馬魚血紅蛋白基因hbae1.1，且通過篩選成功得到F2代純合突變體，成功建立了hbae1.1基因缺失的斑馬魚突變體模型。并通過固藍染色表明，與WT相比，hbae1.1基因缺失的純合突變體的血紅蛋白含量明顯下降，證明了hbae1.1基因的缺失會對斑馬魚血紅蛋白的生成有明顯的影響。

研究利用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)是從產(chǎn)膿鏈球菌的免疫防御系統(tǒng)改造得到的，該系統(tǒng)以構(gòu)建簡單，成本低廉，效率高效等明顯的優(yōu)勢脫穎而出，成為目前應用廣泛的基因編輯技術[23]。斑馬魚的基因組已經(jīng)被全部測序出來，且基因組與人類基因組高度同源，同源性大于70%[24]。所以本研究利用CRISPR/Cas9技術構(gòu)建斑馬魚hbae1.1基因缺失的突變體的可行性被大幅度提高。

4 結(jié)論

研究成功獲得了hbae1.1基因缺失的F2代純合子，并通過固藍染色結(jié)果，表明hbae1.1基因的缺失會嚴重影響到斑馬魚血紅蛋白的生成，也說明hbae1.1基因在斑馬魚血紅蛋白基因家族中有重要作用，為研究魚類血紅蛋白的發(fā)生發(fā)育提供一定基礎，同時也為與血紅蛋白基因突變所引起的人類疾病探究提供一定的研究基礎。