張宗源，潘夢(mèng)詩(shī)，郭文陽(yáng)，岳丹丹，張英濤，亓蘭達(dá)

(河南省科學(xué)院 生物研究所,鄭州 450008)

真菌物種豐富，被認(rèn)為是陸地和水生生物中最大的生物多樣性資源之一。真菌在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成了可以產(chǎn)生多類(lèi)型、多功能的次級(jí)代謝物代謝機(jī)制，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物有利于真菌爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可抵御惡劣的生存環(huán)境，實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)[1]，完成細(xì)胞增殖、分化和整個(gè)生命周期，并可作為與環(huán)境中生物交流的信號(hào)分子[2]。不僅如此，豐富的真菌次級(jí)代謝物結(jié)構(gòu)新穎，骨架豐富，活性獨(dú)特，是現(xiàn)代新藥研發(fā)的重要來(lái)源，在疾病治療中發(fā)揮巨大作用[3]。目前在臨床上有重要應(yīng)用價(jià)值的抗生素、免疫調(diào)節(jié)劑、降血脂、膽固醇等藥物多數(shù)源于真菌的次級(jí)代謝物[4]。由于真菌次級(jí)代謝物具有重要應(yīng)用價(jià)值，所以次級(jí)代謝研究一直是研究熱點(diǎn)。

環(huán)境因素對(duì)真菌次級(jí)代謝生物合成起著重要的作用。光是最重要的環(huán)境因素之一，它對(duì)生物體的生理和行為產(chǎn)生決定性影響，真菌也不例外。在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，真菌形成精細(xì)且復(fù)雜的光感應(yīng)系統(tǒng)，它們通過(guò)光敏蛋白和特異的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)傳導(dǎo)途徑將感受到的光信號(hào)(有光或無(wú)光、光的方向、光質(zhì)、光強(qiáng)等)轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)和生物信號(hào)，并做出反應(yīng)以更好地適應(yīng)環(huán)境[5]。本文對(duì)近年真菌光生物學(xué)研究進(jìn)行概述，介紹光對(duì)真菌天然活性次級(jí)代謝物合成的影響及其分子調(diào)控機(jī)制的研究。

1 真菌的光生物學(xué)研究

光以一種被稱為光子的粒子形式存在，具有波粒二象性，根據(jù)不同的波長(zhǎng)將其分為紫外輻射區(qū)(<380 nm)、可見(jiàn)光(380～780 nm)、紅外輻射區(qū)(>780 nm)[6]。光為真菌提供重要的環(huán)境信息，真菌的光反應(yīng)接近于人類(lèi)視覺(jué)，即從藍(lán)/近紫外區(qū)(450 nm)到近紅外區(qū)(700 nm)。在紅曲霉(Monascus)光生物學(xué)研究中，黑暗條件促進(jìn)其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，且分生孢子數(shù)量以及閉囊殼的數(shù)量明顯大于光照條件[7]。光質(zhì)對(duì)真菌也有不同程度的影響，藍(lán)光和(或)紅光會(huì)抑制構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)[8]、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)[9]、禾柄銹菌(Pucciniagraminis)[10]等真菌孢子的萌發(fā)，除了藍(lán)光和紅光之外，最近的研究表明，綠光可以抑制灰葡萄孢(Botrytiscinerea)的孢子萌發(fā)，并在該反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)功能未知的視蛋白[11]。在靈芝菌絲體培養(yǎng)過(guò)程中，藍(lán)光促進(jìn)靈芝菌絲體生長(zhǎng)，綠光生長(zhǎng)的最慢，同時(shí)不同光質(zhì)對(duì)靈芝菌絲體生長(zhǎng)形態(tài)也有顯著影響，藍(lán)光處理菌絲體生長(zhǎng)密實(shí)，紅光和黃光處理菌絲體生長(zhǎng)蓬松，綠光處理菌絲體生長(zhǎng)則為前期較稀薄，后期密實(shí)[12]。

光在大型真菌由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L(zhǎng)階段的發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。在人工栽培食藥用菌中，光照對(duì)香菇菌棒的轉(zhuǎn)色起到重要作用，相比黑暗環(huán)境，光照條件下香菇菌絲體轉(zhuǎn)色正常[13]。光作為環(huán)境因子之一，對(duì)食藥用菌生長(zhǎng)具有調(diào)控作用，錢(qián)磊等[14]的文章中詳細(xì)闡述了光質(zhì)、光強(qiáng)、光周期對(duì)菌絲體生長(zhǎng)、原基形成和子實(shí)體形態(tài)的影響。

2 光對(duì)真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的影響

真菌次級(jí)代謝物種類(lèi)豐富，是天然藥物的重要來(lái)源之一，絲狀真菌例如半知菌類(lèi)曲霉科青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)和頭孢菌屬(Cephalosporium)等菌株產(chǎn)生的次級(jí)代謝物廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥生產(chǎn)中。大型真菌如靈芝、香菇、蟲(chóng)草等被稱為食藥用真菌，也是重要的天然活性物質(zhì)來(lái)源[15]。真菌天然活性產(chǎn)物按照其合成途徑歸類(lèi)為萜類(lèi)，如靈芝酸、β-胡蘿卜素等；多糖，如靈芝胞外多糖等；非核糖體多肽，如青霉素等；聚酮類(lèi)，如紅曲素、美伐他汀、竹紅菌甲素等；生物堿，如蟲(chóng)草素等(圖1)。

圖1 真菌中具有代表性天然產(chǎn)物Figure 1 Representatives of fungal natural products

2.1 光對(duì)萜類(lèi)化合物生物合成的影響

萜類(lèi)化合物(萜烯類(lèi)或者類(lèi)異戊二烯)大多具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等功效。蛇孢菌素(ophiobolin A)是玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)產(chǎn)生的具有抗腫瘤活性的二倍半萜類(lèi)化合物，白光處理可以促進(jìn)其生物合成，藍(lán)光、綠光、紅光、黃光則起到抑制作用[16]。類(lèi)胡蘿卜素是一類(lèi)基本結(jié)構(gòu)單位為異戊二烯的天然產(chǎn)物。藍(lán)光能誘導(dǎo)蛹蟲(chóng)草菌絲體以及子實(shí)體類(lèi)胡蘿卜素的積累，失活蛹蟲(chóng)草中藍(lán)光受體基因(Cmwc-1)導(dǎo)致類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量降低[17]。通過(guò)控制光照和(或)黑暗能夠獲得四萜類(lèi)化合物β-類(lèi)胡蘿卜素高產(chǎn)菌(MucorcircinelloidesMU218)[18]。藍(lán)光對(duì)促進(jìn)靈芝菌絲體三萜類(lèi)化合物靈芝酸的積累優(yōu)于其他光質(zhì)，綠光和藍(lán)光處理對(duì)提高靈芝酸種類(lèi)有明顯優(yōu)勢(shì)[12]?？梢?jiàn)不同光質(zhì)對(duì)同種萜類(lèi)化合物有不同的影響，藍(lán)光在誘導(dǎo)類(lèi)胡蘿卜素、蟲(chóng)草素和靈芝三萜類(lèi)化合物具有促進(jìn)作用。

2.2 光對(duì)多糖生物合成的影響

靈芝出菇實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同光質(zhì)影響不同時(shí)期靈芝多糖含量：現(xiàn)蕾期黃、藍(lán)光有利于靈芝多糖含量積累；開(kāi)傘期藍(lán)光有利于靈芝多糖含量積累；彈孢后期綠光、藍(lán)光、紅光均能促進(jìn)靈芝多糖積累[19]，而紅、藍(lán)光照射后有利于液體發(fā)酵靈芝胞內(nèi)多糖的積累[20]。液體發(fā)酵條件下，藍(lán)光抑制胞內(nèi)多糖積累[21]，但是促進(jìn)胞外多糖積累[22]。光不僅影響真菌多糖的積累，還影響多糖中單糖組分的含量。Puchkova 等[23]發(fā)現(xiàn)紅、藍(lán)光照射蛹蟲(chóng)草菌絲體后液體發(fā)酵，胞內(nèi)多糖中葡萄糖組分百分含量增加，甘露糖組分和半乳糖組分含量降低；紅、藍(lán)光照射后，靈芝液體發(fā)酵中胞內(nèi)多糖中甘露糖百分含量升高，葡萄糖含量降低[20]。由此可見(jiàn)，在不同生長(zhǎng)時(shí)期，光對(duì)真菌多糖合成具有不同影響。此外，光質(zhì)還影響真菌多糖單糖組分比例。

2.3 光對(duì)非核糖體多肽類(lèi)化合物生物合成的影響

真菌可通過(guò)非核糖體途徑合成一系列低分子量多肽類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物，這種多肽類(lèi)化合物統(tǒng)稱為非核糖體肽(non-ribosomal peptides，NRPs)，其通常具有抗菌、抗病毒、抗癌等生物活性。常見(jiàn)的非核糖體多肽有青霉素G、環(huán)孢菌素A和博來(lái)霉素。Spr?te等[24]證明了光調(diào)控蛋白VeA的缺失會(huì)抑制青霉素的生物合成。Wang等通過(guò)構(gòu)建△CsVosA(VeA組件)禾旋孢腔菌(Cochliobolussativus)突變株，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)非核糖體多肽合成酶(NRPs)基因表達(dá)下調(diào)[25]。

2.4 光對(duì)聚酮類(lèi)化合物生物合成的影響

光質(zhì)對(duì)聚酮類(lèi)活性物質(zhì)合成的影響與種屬有關(guān)，光照強(qiáng)度對(duì)聚酮類(lèi)化合物一定影響。Zhang等[26]研究表明紅光、藍(lán)光、綠光處理Haloroselliniasp.(No.1403)1403R和1403C產(chǎn)量增加76%。紅曲色素是由Monascus產(chǎn)生的聚酮類(lèi)色素，其生物合成與光照(藍(lán)光)強(qiáng)度和時(shí)間有關(guān)[27-28]。發(fā)酵前期光處理會(huì)抑制橘青霉(Penicilliumcitrinum)產(chǎn)聚酮類(lèi)化合物美伐他汀(Mevastatin)[29]。竹紅菌素(hypocrellin)是竹黃菌(ShiraiabambusicolaP.Hennigs)主要有效成分，是一種苝醌類(lèi)色素，屬聚酮類(lèi)化合物，紅光可促進(jìn)竹紅菌素合成，藍(lán)光則會(huì)抑制[30]。

2.5 光對(duì)生物堿類(lèi)化合物生物合成的影響

蛇足石杉中的石杉?jí)A，是吡啶酮類(lèi)生物堿，研究表明黑暗處理比光照更有利于蛇足石杉內(nèi)生菌石衫堿的積累[31]。蟲(chóng)草素屬嘌呤類(lèi)生物堿，具有抑制微生物、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功效，液體發(fā)酵蛹蟲(chóng)草，藍(lán)光處理蛹蟲(chóng)草產(chǎn)量最高[32]，通過(guò)失活蛹蟲(chóng)草中藍(lán)光受體基因(Cmwc-1)，蟲(chóng)草素產(chǎn)量降低[17]。

2.6 光對(duì)其他活性物質(zhì)生物合成的影響

二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)是具有促進(jìn)腦部發(fā)育和抗動(dòng)脈粥樣化功效的不飽和脂肪酸。粉核油球藻(Pinguiococcuspyrenoidosus)在光照強(qiáng)度為100 μmol /(m2·s)時(shí)產(chǎn)生的EPA比例最高[33]。霉酚酸(mycophenolic acid，MPA)是從短密青霉(Penicilliumbrevicompactum)發(fā)酵液中分離的一種具有多種活性的酶抑制劑。光照強(qiáng)度以及光質(zhì)對(duì)其合成有不同影響，光強(qiáng)為1 400 Lx時(shí)MPA濃度最高，紅光對(duì)MPA的合成有促進(jìn)作用，藍(lán)光產(chǎn)生抑制[34]。在A.nidulans中，白光可以促進(jìn)亞鐵血紅素的合成，可能跟VeA互作蛋白(VipA)有關(guān)[35]。

3 光調(diào)控真菌次級(jí)代謝分子機(jī)制研究

在光響應(yīng)研究中首要任務(wù)是要了解真菌如何感受到光。真菌感知光的能力與感光蛋白有關(guān)，不同的光受體蛋白能感應(yīng)特定波段的光質(zhì)。光受體蛋白的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)有了較為全面的研究[5]，光調(diào)控真菌次級(jí)代謝及其分子機(jī)制研究也越來(lái)越深入(表1)。真菌次級(jí)代謝的分子調(diào)控是在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯以及表觀遺傳等多個(gè)層次上，有大量蛋白參與的復(fù)雜過(guò)程，其中不乏光作為重要的環(huán)境因子通過(guò)影響表觀遺傳因子(DNA甲基化酶Dnmt，組蛋白乙?；窰DA等)、全局調(diào)控因子(LaeA，VeA，VelB等)和途徑特異性調(diào)控因子調(diào)控真菌次級(jí)代謝(圖2)。

表1 幾種主要活性物質(zhì)及光調(diào)控分子機(jī)制Table1 Several main bioactive compounds and molecular mechanisms of light regulation

圖2 光調(diào)控真菌次級(jí)代謝的分子機(jī)制Figure 2 Molecular mechanism of light regulation of fungal secondary metabolism

表觀遺傳對(duì)真菌次級(jí)代謝物合成具有調(diào)控作用，其主要研究?jī)?nèi)容為DNA甲基化和組蛋白乙酰化。DNA甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基基團(tuán)，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化作用下，將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到DNA分子的堿基中，在真菌中，DNA甲基化發(fā)生在胞嘧啶上，而形成5-甲基胞嘧啶主要是在CpG二核苷酸上，DNA甲基化通過(guò)改變DNA穩(wěn)定性、DNA構(gòu)象、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等控制基因的表達(dá)，其中甲基化抑制基因表達(dá)，去甲基化促進(jìn)基因的活化和表達(dá)。光照可誘導(dǎo)生物體基因組的甲基化和去甲基化[38]；肖冬來(lái)等[39]研究表明光照可誘導(dǎo)廣葉繡球菌(Sparassislatifolia)菌絲去甲基化，表明在光照條件下其更多基因表達(dá)。組蛋白乙?；墙M蛋白的乙酰化水平，是通過(guò)組蛋白乙?；?HAT)和組蛋白去乙酰化酶(HDAC)來(lái)調(diào)控，根據(jù)組蛋白乙?；c去乙?；嗷マD(zhuǎn)變，就猶如基因的開(kāi)關(guān)，可以控制基因的表達(dá)與沉默。組蛋白乙?；梢杂绊懻婢渭?jí)代謝物的生物合成。Osorio-concepción等[40]的研究中發(fā)現(xiàn)深綠木霉(Trichodermaatroviride)的組蛋白去乙?；窰DA-2是由光誘導(dǎo)的。以上結(jié)果均表明光可通過(guò)表觀遺傳調(diào)控真菌次級(jí)代謝。

全局性調(diào)控是指由全局性調(diào)控因子參與并對(duì)多個(gè)次級(jí)代謝物生物合成以及形態(tài)分化進(jìn)行的調(diào)控。全局調(diào)控因子在真菌次級(jí)代謝調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。其主要研究?jī)?nèi)容為Velvet蛋白和LaeA全局調(diào)控因子，而這兩種蛋白都直接或間接受到光的調(diào)節(jié)。Velvet家族主要包含有VeA、VelB、VosA和VelC，其中VeA蛋白是光依賴性的無(wú)性/有性發(fā)育和次級(jí)代謝的全局調(diào)控因子，研究表明它與VelB、LaeA(loss of aflR expression A)形成異源三聚體系統(tǒng)調(diào)控構(gòu)巢曲霉的生長(zhǎng)發(fā)育和次級(jí)代謝[41]。光可以影響VeA蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的分布，從而影響其功能的發(fā)揮。在真菌體內(nèi)，VeA為橋梁與其家族成員或LaeA及其家族成員形成復(fù)合物，直接或間接調(diào)控真菌有性、無(wú)性發(fā)育和次級(jí)代謝物的合成[42]。同時(shí)VeA蛋白還能夠與紅光受體蛋白相互作用，在構(gòu)巢曲霉中其與紅光受體蛋白FphA的組氨酸激酶結(jié)構(gòu)域相互作用，且與LreA/LreB二聚體形成VeA-FphA-LreA-LreB光復(fù)合物[43]，但目前還不清楚該復(fù)合物是如何調(diào)控真菌光依賴性的生長(zhǎng)發(fā)育和次級(jí)代謝。

相對(duì)于全局性調(diào)控，光對(duì)真菌次級(jí)代謝還存在途徑特異性調(diào)控，目前該方面研究較少。以光誘導(dǎo)類(lèi)胡蘿卜素合成為例，crgA基因是在研究絲狀真菌光誘導(dǎo)類(lèi)胡蘿卜素生物合成過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，其對(duì)類(lèi)胡蘿卜素結(jié)構(gòu)基因及相關(guān)合成基因發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。該基因受光的調(diào)控，其表達(dá)產(chǎn)物具有泛素連接酶活性，通過(guò)催化類(lèi)胡蘿卜素合成過(guò)程中其他蛋白泛素化來(lái)調(diào)控類(lèi)胡蘿卜素的合成[44]。由此推測(cè)在光的影響下，途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)受到調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)次級(jí)代謝基因簇的表達(dá)。

4 總結(jié)與展望

真菌因能生產(chǎn)有價(jià)值的天然化合物而受到高度重視，其次級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎，骨架豐富，活性獨(dú)特，通常具有抗菌、抗腫瘤和抗氧化等特性，是現(xiàn)代新藥研發(fā)的重要來(lái)源。然而這類(lèi)化合物產(chǎn)率很低，不足以大規(guī)模提取與純化。為了解決這一限制，通常通過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、基因水平修飾和外源刺激等方法策略來(lái)提高該類(lèi)化合物的生物合成。而光作為一種重要的環(huán)境信號(hào)，顯然是一種有效、環(huán)保、清潔的能源和低成本的方法來(lái)調(diào)節(jié)真菌次級(jí)代謝物的生產(chǎn)。目前以LED為理想的光環(huán)境調(diào)控設(shè)施已經(jīng)應(yīng)用到食藥用菌生產(chǎn)[45-46]。今后可以在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中加強(qiáng)LED的應(yīng)用以提高藥源真菌的活性成分。

隨著光生物學(xué)研究的深入，越來(lái)越多的真菌光受體蛋白被發(fā)現(xiàn)，從光信號(hào)向生物信號(hào)轉(zhuǎn)化出現(xiàn)了意想不到的復(fù)雜性。以目前的研究還不足以呈現(xiàn)出完整的真菌光響應(yīng)信號(hào)通路圖。雖然大多真菌有類(lèi)似的光響應(yīng)現(xiàn)象，但在不同的真菌種屬間其調(diào)控機(jī)制存在差異。目前研究較為深入的為模式真菌N.crassa中的WCC蛋白復(fù)合體及其如何感知并傳遞光信號(hào)。然而為什么真菌可以感知不同的光色？推測(cè)其原因跟大自然環(huán)境競(jìng)爭(zhēng)有很大關(guān)系。如在森林冠層環(huán)境中，綠光占主要優(yōu)勢(shì)[47]，同樣的已有研究表明紅光比藍(lán)光更容易穿透土壤[48]。同時(shí)，真菌對(duì)不同的光照強(qiáng)度做出不同反應(yīng)，然而其影響機(jī)理需進(jìn)一步研究。

真菌光響應(yīng)被廣泛研究，包括光生物學(xué)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和差異基因表達(dá)研究等方面也取得新進(jìn)展。真菌次級(jí)代謝調(diào)控研究主要包括表觀遺傳調(diào)控、全局性調(diào)控、途徑特異性調(diào)控。光在真菌發(fā)育和次級(jí)代謝過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，但其作用機(jī)制還不清楚。在模式真菌構(gòu)巢曲霉中發(fā)現(xiàn)的光依賴全局調(diào)控因子Vet為我們提供了研究思路，光照抑制VeA-VelB復(fù)合蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而影響真菌的發(fā)育和次級(jí)代謝。而隨后VelB-VeA-LaeA三聚復(fù)合物的發(fā)現(xiàn)更是將光信號(hào)調(diào)控真菌發(fā)育和次級(jí)代謝物生物合成與染色質(zhì)的表觀遺傳修飾建立了橋梁。光照可以影響真菌DNA甲基化水平，推測(cè)可能跟具有甲基化功能的LaeA有關(guān)。真菌生物合成途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子主要包含Zn2Cys6和Cys2His2兩種類(lèi)型，研究表明60%的真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇內(nèi)含有途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子基因[49]，真菌光響應(yīng)與這兩類(lèi)調(diào)控因子的關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。