劉鑫鑫，陳 彧，陳徐歡，王瑩瑩，霍健聰，繆文華

（浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院 浙江舟山316022）

近年來，隨著遠(yuǎn)洋魷釣的發(fā)展，魷魚產(chǎn)量在遠(yuǎn)洋捕撈中所占的比重越來越大?！?018 中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》 數(shù)據(jù)顯示我國魷魚捕獲量達(dá)57.43 萬t，占全部遠(yuǎn)洋捕撈產(chǎn)量的25.44%。然而，由于魷魚含水量高（70%～85%）、不飽和脂肪酸含量高、組織脆弱等原因，在生產(chǎn)加工過程中，其肌原纖維蛋白（Myofibrillar protein，MFP）容易被氧化。大量研究表明氧化會引起MFP 結(jié)構(gòu)特性的改變，進(jìn)而降低其功能特性[1-3]。針對氧化帶來的不利影響，常通過添加抗氧化劑以控制氧化反應(yīng)。目前的抗氧化劑以合成抗氧化劑為主，因安全性問題而導(dǎo)致其使用一直備受質(zhì)疑[4]。

利用天然多酚物質(zhì)作為抗氧化劑以抑制蛋白質(zhì)的氧化成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。大量研究發(fā)現(xiàn)多酚物質(zhì)與蛋白質(zhì)之間存在相互作用，在有些方面這種相互作用被認(rèn)為是有利的，如多酚通過與MFP 相互作用提高了MFP 膜抗張強(qiáng)度[5-6]。然而，多酚物質(zhì)與MFP 的相互作用對其抗氧化性的發(fā)揮是否有利，有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。Sisse[7]在研究白葡萄提取物對氣調(diào)包裝下蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，白葡萄提取物的添加加速了MFP 巰基的損失，并降低了肌球蛋白間的相互交聯(lián)。賈娜等[8]將不同濃度的沒食子酸添加到含MFP 的Fenton 氧化體系中，發(fā)現(xiàn)沒食子酸造成MFP 羰基、巰基和溶解度降低，對MFP 的二級結(jié)構(gòu)也造成了影響。有研究者認(rèn)為多酚物質(zhì)的濃度決定其在對MFP的氧化過程中所扮演的是抗氧化還是促氧化角色[9]。

生姜提取物（GE）中含有多種酚類物質(zhì)，其具有優(yōu)良的抗氧化特性[10]。本課題以從魷魚胴體中提取的MFP 為研究對象，按一定比例添加GE，然后利用Fenton 氧化體系，對MFP 進(jìn)行不同程度氧化，分析羰基含量、總巰基含量、Ca2+-ATPase 活性、表面疏水性等指標(biāo)的變化，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，研究GE 對MFP 氧化的控制作用。這對于控制水產(chǎn)品生產(chǎn)加工過程中因蛋白質(zhì)氧化而造成的功能特性下降具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)原料：試驗(yàn)所用秘魯魷魚購于舟山國際水產(chǎn)城。

試驗(yàn)試劑：乙二胺四乙酸、2，4-二硝基苯肼、5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）等均為AR 級，購于國藥化學(xué)試劑有限公司。SDS-PAGE 凝膠電泳試劑盒，購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；彩虹180 廣譜蛋白Marker（11-180KD），購于北京索萊寶科技有限公司；超微量Ca2+-ATPase 活性檢測試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器與設(shè)備

751UVGD 型紫外-可見光分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；DYY-8C 型電泳儀，北京市六一儀器廠；FJ200-SH 型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；CF-16RN 高速冷凍多用途離心機(jī)，日本日立公司；WD-9405B 型水平搖床，北京市六一儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 GE 的制備及其總酚含量的測定 取生姜洗凈，切成片狀于60 ℃烘干。烘干后的生姜用組織搗碎機(jī)磨成粉，過60 目篩得生姜粉。準(zhǔn)確稱取生姜粉10 g 于250 mL 三角瓶中，按料液比1∶15（g∶mL）加入95%乙醇，25 ℃下超聲波（100 W）萃取15 min 后過濾。旋蒸除去濾液中的乙醇，剩余黃棕色浸膏狀物質(zhì)即為GE。取GE 稀釋液0.5 mL，加入福林酚試劑1.0 mL，再加入5%碳酸鈉溶液15.0 mL，轉(zhuǎn)移至100 mL 棕色容量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻后靜置2 h，在波長760 nm 處測定吸光度。同時(shí)以沒食子酸繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線y=104.828x+0.04286，R=0.9993，經(jīng)測定樣品中總酚含量為10.97 mg/mL。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取 參照Bertram 等[11]的方法進(jìn)行肌原纖維蛋白的提取。取經(jīng)過預(yù)處理的魷魚胴體肉，加3 倍體積A 液（0.1 mol/L KCl，0.02 mol/L Tris-HCl，pH 7.5）和1 倍體積B 液（1% TritonX-100，0.1 mol/L KCl，0.02 mol/L Tris-HCl，pH 7.5），勻漿（8 000 r/min）90 s 后冷凍離心（10 000 r/min，15 min，4 ℃），取沉淀。重復(fù)以上步驟3 次。最后加入用4 倍體積A 液浸提，冷凍離心（10 000 r/min，15 min，4 ℃），最后取得的沉淀即為肌原纖維蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測定其蛋白含量。

1.3.3 肌原纖維蛋白的氧化方法和GE 的添加設(shè)計(jì) 試驗(yàn)A（MFP 氧化方法）：固定體系中FeCl3和抗壞血酸鈉濃度，改變H2O2濃度，即0.1 mmol/L FeCl3和0.1 mmol/L 抗壞血酸，H2O2濃度分別選擇0，0.1，1，5，10 和20 mmol/L。將提取的肌原纖維蛋白溶于以上氧化體系中，使得蛋白質(zhì)的最終質(zhì)量濃度為20 mg/mL。試驗(yàn)組分別添加1 mL 總酚質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的GE 溶液，而對照組則添加等量蒸餾水。然后將樣品在4 ℃下放置3 h，使肌原纖維蛋白發(fā)生不同程度的氧化，通過添加1 mL乙二胺四乙酸二鈉（1 mmol/L）來中止氧化反應(yīng)。

試驗(yàn)B（GE 添加設(shè)計(jì)）：固定體系中含0.1 mmol/L FeCl3和0.1 mmol/L 抗壞血酸，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為20 mg/mL，H2O2濃度為50 mmol/L，各組添加1 mL 總酚質(zhì)量濃度分別為0，0.1，0.2，0.5，1 mg/mL 的GE 溶液，對照組未添加H2O2和GE 溶液，其它操作同試驗(yàn)A。

1.4 分析方法

1.4.1 羰基含量測定方法 參考Levine 等[12]的方法并做適當(dāng)修改。取1 mL 蛋白溶液放入塑料離心管并加入1 mL 2，4-二硝基苯肼（DNPH）溶液（10 mol/L 含2 mol/L HCl），室溫條件下避光靜置1 h（每15 min 振蕩1 次），添加3 mL 20%的三氯乙酸（TCA）后10 000 r/min 離心5 min，棄上清液，用乙酸乙酯-乙醇（體積比1∶1）清洗沉淀至澄清，加入6 mol/L 鹽酸胍溶液0.5 mL，室溫下放置15 min 使沉淀溶解，然后10 000 r/min 離心3 min 去除不溶物。所得溶液于370 nm 波長下測定吸光度。使用分子吸光系數(shù)22 000 L/（mol·cm）計(jì)算每mg 蛋白中羰基含量。

1.4.2 總巰基含量的測定 參考Youngsawatdigul等[13]的方法并做適當(dāng)修改。取1 mL 蛋白溶液于試管中并添加9 mL、50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，10mmol/L EDTA，8 mol/L 尿素，pH 7.0）。取5 mL 上述混合液加入0.5 mL 0.2 mmol/L 的DTNB 試劑（溶解在 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液中，pH 7.0），25 ℃保溫25 min，于412 nm波長下測定吸光度。使用分子吸光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計(jì)算每mg 蛋白中總巰基的含量（nmol）。

1.4.3 Ca2+-ATPase 活性測定 取1 mL 蛋白溶液，經(jīng)10 000 r/min 離心5 min 后，倒去上清液并加入1 mL 0.6 mol/L 的KCl 溶液旋渦振蕩溶解。然后利用南京建成生物工程研究所的超微量Ca2+-ATPase 活性檢測試劑盒進(jìn)行測定。

1.4.4 表面疏水性的測定 參考李艷青[14]的方法并做適當(dāng)修改。取1 mL 蛋白溶液，經(jīng)10 000 r/min 離心5 min 后，倒去上清液并加入1 mL 20 mmol/L pH 6.0 的磷酸鹽溶液中，80 μL 的溴酚藍(lán)（BPB，1 mg/mL），混勻，室溫下攪拌10 min，然后10 000 r/min 離心15 min，取上清液（適當(dāng)稀釋后）在595 nm 下測定吸收值A(chǔ)1。溴酚藍(lán)空白樣是用1 mL pH 6.0，20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液加入200 μL BPB，然后相同條件下測定吸光度A0，按下列公式計(jì)算表面疏水性：

1.4.5 SDS-PAGE 電泳 參考Laemmli[15]的方法并做適當(dāng)修改。選用分離膠體積分?jǐn)?shù)12%（含12%丙烯酰胺，SDS，1.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl，過硫酸銨，TEMED），濃縮膠體積分?jǐn)?shù)3.75%（含3.75%丙烯酰胺，SDS，1.5 mol/L pH 6.8 Tris-HCl，過硫酸銨，TEMED），1L 電極緩沖含Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10 mL。電泳采用1 mm 凝膠板；上樣量為10 μL；開始電泳時(shí)電壓為80 V，待樣品進(jìn)入分離膠后改為120 V；電泳結(jié)束后，取出膠片用考馬斯亮藍(lán)染色1 h（100 mL 染色液含有0.25 g 考馬斯亮藍(lán)R250，甲醇45 mL，冰醋酸10 mL），然后用甲醇/冰醋酸脫色液脫至透明（脫色液中含有5%的甲醇和7.5%的冰醋酸）。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)均為3 次平行的平均值，結(jié)果表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”。利用Microsoft Excel 軟件處理數(shù)據(jù)，OriginPro 8 軟件作圖以及SPSS Statistics 22 中的單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析，以P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 GE 對MFP 氧化時(shí)羰基含量的影響

羰基的形成（醛基和酮基）是蛋白質(zhì)氧化后的一個顯著變化，被廣泛用于測量蛋白質(zhì)的氧化程度[16]。如圖1a所示，與未氧化的蛋白相比，氧化的蛋白質(zhì)羰基含量顯著增加，尤其是未添加GE 的組別。H2O2濃度為20 mmol/L 的組別與0 mmol/L的組別相比，其羰基含量增加了90.35%（P<0.05），而GE 在一定程度上抑制了MFP 羰基的形成，當(dāng)H2O2濃度為20 mmol/L 時(shí)，添加GE 后，其羰基含量顯著下降了19.19%（P<0.05）。如圖1b所示，GE抑制羰基含量效果與濃度呈正相關(guān)，GE 添加量越大，則羰基含量越低。分別添加0.1，0.2，0.5，1 mg/mL 的GE 溶液后，其羰基含量分別降低了3.95%，9.21%，23.25%，30.26%（P<0.01），這可能與姜酚類物質(zhì)所具備的酚羥基結(jié)構(gòu)有關(guān)，通常認(rèn)為酚類物質(zhì)通過接收羥基自由基的方式[10]，避免了蛋白質(zhì)側(cè)鏈被氧化修飾，從而抑制了蛋白羰基含量的增加。

圖1 GE 對MFP 羰基含量的影響Fig.1 The effect of GE on carbonyl content of MFP

2.2 GE 對MFP 氧化時(shí)總巰基含量的影響

MFP 的巰基極易與多酚物質(zhì)發(fā)生交聯(lián)作用導(dǎo)致總巰基含量的降低[7-8]，因此通過MFP 總巰基含量的變化可直觀地了解氧化條件下GE 與MFP 的交聯(lián)程度。如圖2a所示，添加或未添加GE 的組別經(jīng)氧化后，MFP 均發(fā)生了顯著降低（P<0.05）。當(dāng)H2O2濃度為0 mmol/L 時(shí)，添加GE 后蛋白總巰基降低了3.92%（P<0.05），Prodpran 等[5]在研究酚類物質(zhì)對肌原纖維蛋白交聯(lián)性影響中發(fā)現(xiàn)了同樣的情況。而在氧化環(huán)境下，GE 進(jìn)一步促進(jìn)了蛋白總巰基含量的下降。當(dāng)H2O2濃度分別為1，5，10，20 mmol/L 時(shí)，添加GE 后蛋白質(zhì)總巰基含量分別降低了16.72%，23.87%，26.13%，14.81%（P<0.05）。類似的情況同樣在圖2b 中被觀察到，分別添加0.1，0.2，0.5，1 mg/mL 的GE 溶液后，與未添加GE的組別相比，其總巰基含量分別降低了2.36%，5.91%，26.63%，32.54%（P<0.01）。以上數(shù)據(jù)充分說明，GE 促進(jìn)了總巰基含量的降低，且促進(jìn)效果與GE 濃度呈正相關(guān)，即GE 濃度越高總巰基含量越低。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)多酚化合物與巰基之間存在相互作用，即在氧化條件下多酚化合物被氧化為相應(yīng)的醌類物質(zhì)，進(jìn)而與巰基反應(yīng)生成巰基-醌化合物[17-19]。Jongberg 等[20]認(rèn)為巰基-醌化合物的生成不僅避免了巰基被氧化為二硫鍵，還提高了多酚物質(zhì)的抗氧化活性。

圖2 GE 對MFP 總巰基含量的影響Fig.2 The effect of GE on total sulfhydryl content of MFP

2.3 GE 對MFP 氧化時(shí)Ca2+-ATPase 酶活性的影響

肌球蛋白頭部催化中心具有兩個活性巰基（-SH1和-SH2），其中-SH1負(fù)責(zé)Ca2+-ATPase 酶活性[21]。羥基自由基對這些基團(tuán)的氧化修飾會導(dǎo)致肌球蛋白構(gòu)象的改變，影響其與底物的相互作用，進(jìn)而影響Ca2+-ATPase 酶活性[22]。通過Peason 相關(guān)性分析可知，兩者之間（圖2b，圖3b）相關(guān)系數(shù)為0.911，P=0.000，因此Ca2+-ATPase 酶活性變化與總巰基含量的變化之間有著極高的相關(guān)性。

如圖3a所示，各組MFP 的Ca2+-ATPase 的活性隨H2O2濃度的增加均發(fā)生了顯著下降（P<0.05）。未氧化MFP 的Ca2+-ATPase 的活性為2.45 U/mg，經(jīng)氧化后分別下降了34.73%（0.1 mmol/L），72.36%（1 mmol/L），90.18%（5 mmol/L），91.32%（10 mmol/L），95.64%（20 mmol/L）。當(dāng)H2O2濃度為0.1 mmol/L 時(shí)，與未添加GE 的組別相比，添加GE 的MFP Ca2+-ATPase 活性相對下降了72.89%（P<0.05）。陳洪生等[23]在研究中同樣發(fā)現(xiàn)多酚類物質(zhì)在氧化條件下加速Ca2+-ATPase 活性下降的情況。通過圖3b 我們可發(fā)現(xiàn)，在氧化條件下，高質(zhì)量濃度GE（0.2，0.5，1 mg/mL）的添加抑制了Ca2+-ATPase 活性（P<0.05），而低質(zhì)量濃度GE 的添加（0.1 mg/mL）未對酶活性造成顯著性影響（P>0.05）。巰基-醌化合物的生成雖然避免了巰基被氧化為二硫鍵，但仍然對肌球蛋白的Ca2+-ATPase 活性造成了顯著影響。

圖3 GE 對氧化MFP Ca2+-ATPase 活性的影響Fig.3 The effect of GE on Ca2+-ATPase activity of MFP

2.4 GE 對MFP 氧化時(shí)表面疏水性的影響

氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，一些疏水基團(tuán)從蛋白質(zhì)內(nèi)部暴露，致使表面疏水性的增加[11，16]。如圖4a所示，所有MFP 樣品的表面疏水性均隨H2O2濃度的增加而顯著增加。當(dāng)H2O2濃度分別為10，20 mmol/L 時(shí)，添加GE 后其表面疏水性分別降低了7.18%，16.41%（P<0.05）。如圖4b所示，GE 抑制表面疏水性效果與GE 濃度呈正相關(guān)，即GE 添加量越大，則MFP 的表面疏水性越低。分別添加0.1，0.2，0.5，1 mg/mL 的GE 溶液后，其表面疏水性分別降低了8.29%，15.43%，25.49%和26.54%，以上數(shù)據(jù)說明GE 具有抑制氧化MFP表面疏水性增加的效果，且濃度越高抑制效果越好。GE 抑制MFP 表面疏水性的增加可能存在多種途徑：1）GE 通過清除羥基自由基，維持了MFP正常的空間構(gòu)象；2）酚類物質(zhì)與MFP 相結(jié)合，使得蛋白質(zhì)分子表面極性增強(qiáng)[24]；3）GE 的添加造成蛋白的聚集從而抑制表面疏水性的增加[25]。

圖4 GE 對氧化MFP 表面疏水性影響Fig.4 The effect of GE on surface hydrophobicity of MFP

2.5 SDS-PAGE 電泳

不同分子質(zhì)量條帶對應(yīng)的蛋白質(zhì)分別為：肌球蛋白重鏈（MHC，約200 ku），副肌球蛋白（PM，100～135 ku），肌動蛋白（Actin，35～48 ku），以及肌球蛋白輕鏈（MLC，11～17 ku）。蛋白質(zhì)氧化的一個主要結(jié)果是通過共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的方式形成蛋白質(zhì)聚合物[26-27]，導(dǎo)致一些蛋白分子堆積在分離膠頂部，甚至可能存在于濃縮膠中。如圖5a所示，MFP 經(jīng)20 mmol/L 的H2O2氧化3 h 后，產(chǎn)生部分分子質(zhì)量大于200 ku 的蛋白聚合物（I），相同的情況可在圖5c 中觀察到（Ⅱ）。在添加GE 后，如圖5b、5c所示，氧化前后蛋白條帶并未發(fā)現(xiàn)顯著變化，同時(shí)添加不同濃度的GE 也未能對蛋白條帶產(chǎn)生顯著性影響（Ⅱ）。因此認(rèn)為，蛋白與多酚類物質(zhì)交聯(lián)形成的聚合物是可被還原的[8]。

圖5 GE 對氧化MFP SDS-PAGE 電泳圖譜影響Fig.5 The effect of GE on SDS-PAGE pattern of oxidized MFP

3 結(jié)論

GE 的添加具有抑制蛋白氧化的效果，表現(xiàn)在其抑制了羰基和表面疏水性的增加。同時(shí)，GE 與MFP 的活性巰基相互作用生成巰基-醌加成物，這極大地促進(jìn)了總巰基含量的降低，但卻避免了活性巰基被氧化為二硫鍵。然而，巰基-醌化合物的生成不可避免地造成肌球蛋白Ca2+-ATPase 活性的下降。通過SDS-PAGE 電泳圖譜可知，GE 與MFP 之間的交聯(lián)是可被還原的。今后還需要深入研究酚類氧化產(chǎn)物與MFP 側(cè)鏈氨基酸交聯(lián)的具體位點(diǎn)與方式，同時(shí)不同的多酚物質(zhì)對蛋白結(jié)構(gòu)和功能性影響也有待進(jìn)一步探索。