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        生姜提取物對魷魚肌原纖維蛋白氧化的影響

        2021-10-19 08:13:40劉鑫鑫陳徐歡王瑩瑩霍健聰繆文華
        中國食品學(xué)報(bào) 2021年9期
        關(guān)鍵詞:肌原纖維羰基巰基

        劉鑫鑫,陳 彧,陳徐歡,王瑩瑩,霍健聰,繆文華

        (浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院 浙江舟山316022)

        近年來,隨著遠(yuǎn)洋魷釣的發(fā)展,魷魚產(chǎn)量在遠(yuǎn)洋捕撈中所占的比重越來越大?!?018 中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》 數(shù)據(jù)顯示我國魷魚捕獲量達(dá)57.43 萬t,占全部遠(yuǎn)洋捕撈產(chǎn)量的25.44%。然而,由于魷魚含水量高(70%~85%)、不飽和脂肪酸含量高、組織脆弱等原因,在生產(chǎn)加工過程中,其肌原纖維蛋白(Myofibrillar protein,MFP)容易被氧化。大量研究表明氧化會引起MFP 結(jié)構(gòu)特性的改變,進(jìn)而降低其功能特性[1-3]。針對氧化帶來的不利影響,常通過添加抗氧化劑以控制氧化反應(yīng)。目前的抗氧化劑以合成抗氧化劑為主,因安全性問題而導(dǎo)致其使用一直備受質(zhì)疑[4]。

        利用天然多酚物質(zhì)作為抗氧化劑以抑制蛋白質(zhì)的氧化成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。大量研究發(fā)現(xiàn)多酚物質(zhì)與蛋白質(zhì)之間存在相互作用,在有些方面這種相互作用被認(rèn)為是有利的,如多酚通過與MFP 相互作用提高了MFP 膜抗張強(qiáng)度[5-6]。然而,多酚物質(zhì)與MFP 的相互作用對其抗氧化性的發(fā)揮是否有利,有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。Sisse[7]在研究白葡萄提取物對氣調(diào)包裝下蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn),白葡萄提取物的添加加速了MFP 巰基的損失,并降低了肌球蛋白間的相互交聯(lián)。賈娜等[8]將不同濃度的沒食子酸添加到含MFP 的Fenton 氧化體系中,發(fā)現(xiàn)沒食子酸造成MFP 羰基、巰基和溶解度降低,對MFP 的二級結(jié)構(gòu)也造成了影響。有研究者認(rèn)為多酚物質(zhì)的濃度決定其在對MFP的氧化過程中所扮演的是抗氧化還是促氧化角色[9]。

        生姜提取物(GE)中含有多種酚類物質(zhì),其具有優(yōu)良的抗氧化特性[10]。本課題以從魷魚胴體中提取的MFP 為研究對象,按一定比例添加GE,然后利用Fenton 氧化體系,對MFP 進(jìn)行不同程度氧化,分析羰基含量、總巰基含量、Ca2+-ATPase 活性、表面疏水性等指標(biāo)的變化,并進(jìn)行SDS-PAGE電泳,研究GE 對MFP 氧化的控制作用。這對于控制水產(chǎn)品生產(chǎn)加工過程中因蛋白質(zhì)氧化而造成的功能特性下降具有重要意義。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        試驗(yàn)原料:試驗(yàn)所用秘魯魷魚購于舟山國際水產(chǎn)城。

        試驗(yàn)試劑:乙二胺四乙酸、2,4-二硝基苯肼、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)等均為AR 級,購于國藥化學(xué)試劑有限公司。SDS-PAGE 凝膠電泳試劑盒,購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;彩虹180 廣譜蛋白Marker(11-180KD),購于北京索萊寶科技有限公司;超微量Ca2+-ATPase 活性檢測試劑盒,購于南京建成生物工程研究所。

        1.2 主要儀器與設(shè)備

        751UVGD 型紫外-可見光分光光度計(jì),上海第三分析儀器廠;DYY-8C 型電泳儀,北京市六一儀器廠;FJ200-SH 型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī),上海標(biāo)本模型廠;CF-16RN 高速冷凍多用途離心機(jī),日本日立公司;WD-9405B 型水平搖床,北京市六一儀器廠。

        1.3 試驗(yàn)方法

        1.3.1 GE 的制備及其總酚含量的測定 取生姜洗凈,切成片狀于60 ℃烘干。烘干后的生姜用組織搗碎機(jī)磨成粉,過60 目篩得生姜粉。準(zhǔn)確稱取生姜粉10 g 于250 mL 三角瓶中,按料液比1∶15(g∶mL)加入95%乙醇,25 ℃下超聲波(100 W)萃取15 min 后過濾。旋蒸除去濾液中的乙醇,剩余黃棕色浸膏狀物質(zhì)即為GE。取GE 稀釋液0.5 mL,加入福林酚試劑1.0 mL,再加入5%碳酸鈉溶液15.0 mL,轉(zhuǎn)移至100 mL 棕色容量瓶,加水稀釋至刻度,搖勻后靜置2 h,在波長760 nm 處測定吸光度。同時(shí)以沒食子酸繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線y=104.828x+0.04286,R=0.9993,經(jīng)測定樣品中總酚含量為10.97 mg/mL。

        1.3.2 肌原纖維蛋白的提取 參照Bertram 等[11]的方法進(jìn)行肌原纖維蛋白的提取。取經(jīng)過預(yù)處理的魷魚胴體肉,加3 倍體積A 液(0.1 mol/L KCl,0.02 mol/L Tris-HCl,pH 7.5)和1 倍體積B 液(1% TritonX-100,0.1 mol/L KCl,0.02 mol/L Tris-HCl,pH 7.5),勻漿(8 000 r/min)90 s 后冷凍離心(10 000 r/min,15 min,4 ℃),取沉淀。重復(fù)以上步驟3 次。最后加入用4 倍體積A 液浸提,冷凍離心(10 000 r/min,15 min,4 ℃),最后取得的沉淀即為肌原纖維蛋白,考馬斯亮藍(lán)法測定其蛋白含量。

        1.3.3 肌原纖維蛋白的氧化方法和GE 的添加設(shè)計(jì) 試驗(yàn)A(MFP 氧化方法):固定體系中FeCl3和抗壞血酸鈉濃度,改變H2O2濃度,即0.1 mmol/L FeCl3和0.1 mmol/L 抗壞血酸,H2O2濃度分別選擇0,0.1,1,5,10 和20 mmol/L。將提取的肌原纖維蛋白溶于以上氧化體系中,使得蛋白質(zhì)的最終質(zhì)量濃度為20 mg/mL。試驗(yàn)組分別添加1 mL 總酚質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的GE 溶液,而對照組則添加等量蒸餾水。然后將樣品在4 ℃下放置3 h,使肌原纖維蛋白發(fā)生不同程度的氧化,通過添加1 mL乙二胺四乙酸二鈉(1 mmol/L)來中止氧化反應(yīng)。

        試驗(yàn)B(GE 添加設(shè)計(jì)):固定體系中含0.1 mmol/L FeCl3和0.1 mmol/L 抗壞血酸,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為20 mg/mL,H2O2濃度為50 mmol/L,各組添加1 mL 總酚質(zhì)量濃度分別為0,0.1,0.2,0.5,1 mg/mL 的GE 溶液,對照組未添加H2O2和GE 溶液,其它操作同試驗(yàn)A。

        1.4 分析方法

        1.4.1 羰基含量測定方法 參考Levine 等[12]的方法并做適當(dāng)修改。取1 mL 蛋白溶液放入塑料離心管并加入1 mL 2,4-二硝基苯肼(DNPH)溶液(10 mol/L 含2 mol/L HCl),室溫條件下避光靜置1 h(每15 min 振蕩1 次),添加3 mL 20%的三氯乙酸(TCA)后10 000 r/min 離心5 min,棄上清液,用乙酸乙酯-乙醇(體積比1∶1)清洗沉淀至澄清,加入6 mol/L 鹽酸胍溶液0.5 mL,室溫下放置15 min 使沉淀溶解,然后10 000 r/min 離心3 min 去除不溶物。所得溶液于370 nm 波長下測定吸光度。使用分子吸光系數(shù)22 000 L/(mol·cm)計(jì)算每mg 蛋白中羰基含量。

        1.4.2 總巰基含量的測定 參考Youngsawatdigul等[13]的方法并做適當(dāng)修改。取1 mL 蛋白溶液于試管中并添加9 mL、50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(含0.6 mol/L NaCl,10mmol/L EDTA,8 mol/L 尿素,pH 7.0)。取5 mL 上述混合液加入0.5 mL 0.2 mmol/L 的DTNB 試劑(溶解在 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液中,pH 7.0),25 ℃保溫25 min,于412 nm波長下測定吸光度。使用分子吸光系數(shù)13 600 L/(mol·cm)計(jì)算每mg 蛋白中總巰基的含量(nmol)。

        1.4.3 Ca2+-ATPase 活性測定 取1 mL 蛋白溶液,經(jīng)10 000 r/min 離心5 min 后,倒去上清液并加入1 mL 0.6 mol/L 的KCl 溶液旋渦振蕩溶解。然后利用南京建成生物工程研究所的超微量Ca2+-ATPase 活性檢測試劑盒進(jìn)行測定。

        1.4.4 表面疏水性的測定 參考李艷青[14]的方法并做適當(dāng)修改。取1 mL 蛋白溶液,經(jīng)10 000 r/min 離心5 min 后,倒去上清液并加入1 mL 20 mmol/L pH 6.0 的磷酸鹽溶液中,80 μL 的溴酚藍(lán)(BPB,1 mg/mL),混勻,室溫下攪拌10 min,然后10 000 r/min 離心15 min,取上清液(適當(dāng)稀釋后)在595 nm 下測定吸收值A(chǔ)1。溴酚藍(lán)空白樣是用1 mL pH 6.0,20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液加入200 μL BPB,然后相同條件下測定吸光度A0,按下列公式計(jì)算表面疏水性:

        1.4.5 SDS-PAGE 電泳 參考Laemmli[15]的方法并做適當(dāng)修改。選用分離膠體積分?jǐn)?shù)12%(含12%丙烯酰胺,SDS,1.5 mol/L pH 8.8 Tris-HCl,過硫酸銨,TEMED),濃縮膠體積分?jǐn)?shù)3.75%(含3.75%丙烯酰胺,SDS,1.5 mol/L pH 6.8 Tris-HCl,過硫酸銨,TEMED),1L 電極緩沖含Tris 3.02 g,甘氨酸18.8 g,10% SDS 10 mL。電泳采用1 mm 凝膠板;上樣量為10 μL;開始電泳時(shí)電壓為80 V,待樣品進(jìn)入分離膠后改為120 V;電泳結(jié)束后,取出膠片用考馬斯亮藍(lán)染色1 h(100 mL 染色液含有0.25 g 考馬斯亮藍(lán)R250,甲醇45 mL,冰醋酸10 mL),然后用甲醇/冰醋酸脫色液脫至透明(脫色液中含有5%的甲醇和7.5%的冰醋酸)。

        1.5 統(tǒng)計(jì)分析

        所得數(shù)據(jù)均為3 次平行的平均值,結(jié)果表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”。利用Microsoft Excel 軟件處理數(shù)據(jù),OriginPro 8 軟件作圖以及SPSS Statistics 22 中的單因素方差分析進(jìn)行顯著性分析,以P<0.05 表示差異顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 GE 對MFP 氧化時(shí)羰基含量的影響

        羰基的形成(醛基和酮基)是蛋白質(zhì)氧化后的一個顯著變化,被廣泛用于測量蛋白質(zhì)的氧化程度[16]。如圖1a所示,與未氧化的蛋白相比,氧化的蛋白質(zhì)羰基含量顯著增加,尤其是未添加GE 的組別。H2O2濃度為20 mmol/L 的組別與0 mmol/L的組別相比,其羰基含量增加了90.35%(P<0.05),而GE 在一定程度上抑制了MFP 羰基的形成,當(dāng)H2O2濃度為20 mmol/L 時(shí),添加GE 后,其羰基含量顯著下降了19.19%(P<0.05)。如圖1b所示,GE抑制羰基含量效果與濃度呈正相關(guān),GE 添加量越大,則羰基含量越低。分別添加0.1,0.2,0.5,1 mg/mL 的GE 溶液后,其羰基含量分別降低了3.95%,9.21%,23.25%,30.26%(P<0.01),這可能與姜酚類物質(zhì)所具備的酚羥基結(jié)構(gòu)有關(guān),通常認(rèn)為酚類物質(zhì)通過接收羥基自由基的方式[10],避免了蛋白質(zhì)側(cè)鏈被氧化修飾,從而抑制了蛋白羰基含量的增加。

        圖1 GE 對MFP 羰基含量的影響Fig.1 The effect of GE on carbonyl content of MFP

        2.2 GE 對MFP 氧化時(shí)總巰基含量的影響

        MFP 的巰基極易與多酚物質(zhì)發(fā)生交聯(lián)作用導(dǎo)致總巰基含量的降低[7-8],因此通過MFP 總巰基含量的變化可直觀地了解氧化條件下GE 與MFP 的交聯(lián)程度。如圖2a所示,添加或未添加GE 的組別經(jīng)氧化后,MFP 均發(fā)生了顯著降低(P<0.05)。當(dāng)H2O2濃度為0 mmol/L 時(shí),添加GE 后蛋白總巰基降低了3.92%(P<0.05),Prodpran 等[5]在研究酚類物質(zhì)對肌原纖維蛋白交聯(lián)性影響中發(fā)現(xiàn)了同樣的情況。而在氧化環(huán)境下,GE 進(jìn)一步促進(jìn)了蛋白總巰基含量的下降。當(dāng)H2O2濃度分別為1,5,10,20 mmol/L 時(shí),添加GE 后蛋白質(zhì)總巰基含量分別降低了16.72%,23.87%,26.13%,14.81%(P<0.05)。類似的情況同樣在圖2b 中被觀察到,分別添加0.1,0.2,0.5,1 mg/mL 的GE 溶液后,與未添加GE的組別相比,其總巰基含量分別降低了2.36%,5.91%,26.63%,32.54%(P<0.01)。以上數(shù)據(jù)充分說明,GE 促進(jìn)了總巰基含量的降低,且促進(jìn)效果與GE 濃度呈正相關(guān),即GE 濃度越高總巰基含量越低。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)多酚化合物與巰基之間存在相互作用,即在氧化條件下多酚化合物被氧化為相應(yīng)的醌類物質(zhì),進(jìn)而與巰基反應(yīng)生成巰基-醌化合物[17-19]。Jongberg 等[20]認(rèn)為巰基-醌化合物的生成不僅避免了巰基被氧化為二硫鍵,還提高了多酚物質(zhì)的抗氧化活性。

        圖2 GE 對MFP 總巰基含量的影響Fig.2 The effect of GE on total sulfhydryl content of MFP

        2.3 GE 對MFP 氧化時(shí)Ca2+-ATPase 酶活性的影響

        肌球蛋白頭部催化中心具有兩個活性巰基(-SH1和-SH2),其中-SH1負(fù)責(zé)Ca2+-ATPase 酶活性[21]。羥基自由基對這些基團(tuán)的氧化修飾會導(dǎo)致肌球蛋白構(gòu)象的改變,影響其與底物的相互作用,進(jìn)而影響Ca2+-ATPase 酶活性[22]。通過Peason 相關(guān)性分析可知,兩者之間(圖2b,圖3b)相關(guān)系數(shù)為0.911,P=0.000,因此Ca2+-ATPase 酶活性變化與總巰基含量的變化之間有著極高的相關(guān)性。

        如圖3a所示,各組MFP 的Ca2+-ATPase 的活性隨H2O2濃度的增加均發(fā)生了顯著下降(P<0.05)。未氧化MFP 的Ca2+-ATPase 的活性為2.45 U/mg,經(jīng)氧化后分別下降了34.73%(0.1 mmol/L),72.36%(1 mmol/L),90.18%(5 mmol/L),91.32%(10 mmol/L),95.64%(20 mmol/L)。當(dāng)H2O2濃度為0.1 mmol/L 時(shí),與未添加GE 的組別相比,添加GE 的MFP Ca2+-ATPase 活性相對下降了72.89%(P<0.05)。陳洪生等[23]在研究中同樣發(fā)現(xiàn)多酚類物質(zhì)在氧化條件下加速Ca2+-ATPase 活性下降的情況。通過圖3b 我們可發(fā)現(xiàn),在氧化條件下,高質(zhì)量濃度GE(0.2,0.5,1 mg/mL)的添加抑制了Ca2+-ATPase 活性(P<0.05),而低質(zhì)量濃度GE 的添加(0.1 mg/mL)未對酶活性造成顯著性影響(P>0.05)。巰基-醌化合物的生成雖然避免了巰基被氧化為二硫鍵,但仍然對肌球蛋白的Ca2+-ATPase 活性造成了顯著影響。

        圖3 GE 對氧化MFP Ca2+-ATPase 活性的影響Fig.3 The effect of GE on Ca2+-ATPase activity of MFP

        2.4 GE 對MFP 氧化時(shí)表面疏水性的影響

        氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,一些疏水基團(tuán)從蛋白質(zhì)內(nèi)部暴露,致使表面疏水性的增加[11,16]。如圖4a所示,所有MFP 樣品的表面疏水性均隨H2O2濃度的增加而顯著增加。當(dāng)H2O2濃度分別為10,20 mmol/L 時(shí),添加GE 后其表面疏水性分別降低了7.18%,16.41%(P<0.05)。如圖4b所示,GE 抑制表面疏水性效果與GE 濃度呈正相關(guān),即GE 添加量越大,則MFP 的表面疏水性越低。分別添加0.1,0.2,0.5,1 mg/mL 的GE 溶液后,其表面疏水性分別降低了8.29%,15.43%,25.49%和26.54%,以上數(shù)據(jù)說明GE 具有抑制氧化MFP表面疏水性增加的效果,且濃度越高抑制效果越好。GE 抑制MFP 表面疏水性的增加可能存在多種途徑:1)GE 通過清除羥基自由基,維持了MFP正常的空間構(gòu)象;2)酚類物質(zhì)與MFP 相結(jié)合,使得蛋白質(zhì)分子表面極性增強(qiáng)[24];3)GE 的添加造成蛋白的聚集從而抑制表面疏水性的增加[25]。

        圖4 GE 對氧化MFP 表面疏水性影響Fig.4 The effect of GE on surface hydrophobicity of MFP

        2.5 SDS-PAGE 電泳

        不同分子質(zhì)量條帶對應(yīng)的蛋白質(zhì)分別為:肌球蛋白重鏈(MHC,約200 ku),副肌球蛋白(PM,100~135 ku),肌動蛋白(Actin,35~48 ku),以及肌球蛋白輕鏈(MLC,11~17 ku)。蛋白質(zhì)氧化的一個主要結(jié)果是通過共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的方式形成蛋白質(zhì)聚合物[26-27],導(dǎo)致一些蛋白分子堆積在分離膠頂部,甚至可能存在于濃縮膠中。如圖5a所示,MFP 經(jīng)20 mmol/L 的H2O2氧化3 h 后,產(chǎn)生部分分子質(zhì)量大于200 ku 的蛋白聚合物(I),相同的情況可在圖5c 中觀察到(Ⅱ)。在添加GE 后,如圖5b、5c所示,氧化前后蛋白條帶并未發(fā)現(xiàn)顯著變化,同時(shí)添加不同濃度的GE 也未能對蛋白條帶產(chǎn)生顯著性影響(Ⅱ)。因此認(rèn)為,蛋白與多酚類物質(zhì)交聯(lián)形成的聚合物是可被還原的[8]。

        圖5 GE 對氧化MFP SDS-PAGE 電泳圖譜影響Fig.5 The effect of GE on SDS-PAGE pattern of oxidized MFP

        3 結(jié)論

        GE 的添加具有抑制蛋白氧化的效果,表現(xiàn)在其抑制了羰基和表面疏水性的增加。同時(shí),GE 與MFP 的活性巰基相互作用生成巰基-醌加成物,這極大地促進(jìn)了總巰基含量的降低,但卻避免了活性巰基被氧化為二硫鍵。然而,巰基-醌化合物的生成不可避免地造成肌球蛋白Ca2+-ATPase 活性的下降。通過SDS-PAGE 電泳圖譜可知,GE 與MFP 之間的交聯(lián)是可被還原的。今后還需要深入研究酚類氧化產(chǎn)物與MFP 側(cè)鏈氨基酸交聯(lián)的具體位點(diǎn)與方式,同時(shí)不同的多酚物質(zhì)對蛋白結(jié)構(gòu)和功能性影響也有待進(jìn)一步探索。

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