劉港帥，李泓利，田慧琴，傅達(dá)奇

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 果實(shí)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室 北京100083）

角質(zhì)層是水生植物向陸生植物的進(jìn)化過程中，為適應(yīng)陸地相對(duì)干燥、溫度波動(dòng)范圍大、紫外輻射強(qiáng)烈等環(huán)境特點(diǎn)，由植物氣生器官表皮細(xì)胞合成并覆蓋于其表面的一層疏水性結(jié)構(gòu)。它可將植物的氣生器官與外界脅迫因素相對(duì)隔離，從而保護(hù)植株正常的生長(zhǎng)發(fā)育[1]。由于研究方法的缺乏，在過去很長(zhǎng)一段時(shí)間，植物角質(zhì)層的重要性被忽視。目前，植物角質(zhì)層的研究受到廣泛關(guān)注，但大多數(shù)的研究集中于模式植物擬南芥、番茄等的營(yíng)養(yǎng)器官，對(duì)于果實(shí)角質(zhì)層的研究不夠深入、全面，而果實(shí)角質(zhì)層對(duì)果實(shí)的生理狀態(tài)和品質(zhì)形成具有重要的調(diào)節(jié)作用，例如可有效抵御外界病蟲害，平衡果實(shí)內(nèi)部膨壓，減緩果實(shí)采后失水[2]，因此研究果實(shí)角質(zhì)層可為提高果實(shí)采前品質(zhì)和采后貯藏性能提供重要的理論基礎(chǔ)。本文整理近年來(lái)的文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)果實(shí)角質(zhì)層的組成、功能、生物合成、調(diào)控及研究方法5 個(gè)方面進(jìn)行綜述，為未來(lái)果實(shí)角質(zhì)層的深入研究提供研究思路。

1 果實(shí)角質(zhì)層的組成

果實(shí)角質(zhì)層主要由角質(zhì)基質(zhì)和覆蓋并嵌入其中的蠟質(zhì)兩部分組成[3-4]。角質(zhì)是由羥基化或環(huán)氧羥基化的脂肪酸（C16和C18，其中C16主要是9，16-二羥基棕櫚酸和10，16-二羥基棕櫚酸，C18主要是9，10，18-三羥基硬脂酸和9，10-環(huán)氧，18-羥基硬脂酸）共價(jià)連接而形成的聚酯[5-6]。蠟質(zhì)是由長(zhǎng)鏈和超長(zhǎng)鏈脂肪酸及其烴類、醇類、醛類、酮類、酯類、三萜類、甾醇類化合物等各類衍生物所組成的混合物[3]。此外，角質(zhì)層還含有一定數(shù)量的酚類化合物和來(lái)源并定位于表皮細(xì)胞細(xì)胞壁，整合在角質(zhì)基質(zhì)中的多糖[7-8]。一些果實(shí)的角質(zhì)層中還可能含有無(wú)法水解的膠膜，這是一類由脂肪族化合物通過醚鍵連接形成的非酯網(wǎng)狀核心基質(zhì)[9]。在植物的不同物種之間和相同植物的不同器官之間，角質(zhì)和蠟質(zhì)的含量及其組成成分都存在差異[1]。不同種類果實(shí)角質(zhì)層中的角質(zhì)主要單體和蠟質(zhì)主要成分在之前的研究中已被先后分析闡明，并在Lara 等[3]的綜述中進(jìn)行了詳細(xì)匯總。

2 果實(shí)角質(zhì)層的功能

2.1 抵御非生物和生物脅迫

果實(shí)角質(zhì)層的主要功能之一是抵御內(nèi)部和外界非生物和生物脅迫，在果實(shí)的發(fā)育和成熟階段，果實(shí)角質(zhì)層通過調(diào)整自身結(jié)構(gòu)和成分以承受果實(shí)不斷膨大和細(xì)胞壁降解所帶來(lái)的內(nèi)部膨壓，以保持果實(shí)的完整性[2]。此外，果實(shí)角質(zhì)層作為一種天然屏障將果實(shí)與外界環(huán)境相對(duì)隔離，其中，角質(zhì)、多糖、酚類物質(zhì)分別為角質(zhì)層提供延展性、剛度、硬度等機(jī)械性能。同時(shí)，蠟質(zhì)（主要為其中的烷烴）和多糖可以增加果實(shí)的持水能力。蠟質(zhì)和酚類物質(zhì)可以過濾紫外線。而角質(zhì)和蠟質(zhì)又可作為一種溫度調(diào)節(jié)器，維持植物體自身的溫度穩(wěn)定[3，10]。因此果實(shí)角質(zhì)層有利于避免或減輕例如干旱、紫外線輻射、溫度波動(dòng)、各類病蟲害、機(jī)械擠壓和碰撞等外界脅迫對(duì)果實(shí)本身造成的傷害，這種保護(hù)作用可能還與角質(zhì)層對(duì)外界信號(hào)的敏感性相關(guān)，角質(zhì)層通過接收外界信號(hào)并轉(zhuǎn)導(dǎo)至植物體內(nèi)以激活植物體內(nèi)的生理應(yīng)答，進(jìn)而增強(qiáng)植物體對(duì)各類外界脅迫的抗性[11-13]。

2.2 減緩果實(shí)采后失水

另一方面，近年的研究表明，果實(shí)角質(zhì)層對(duì)于調(diào)控果實(shí)的采后品質(zhì)也具有重要的作用[2]。在果實(shí)的采后貯藏過程中，失水是導(dǎo)致其品質(zhì)劣變的重要因素，而果實(shí)水分損失程度的主要決定因素之一是覆蓋于果實(shí)外表皮的角質(zhì)層[14-15]?！癲elayed fruit deterioration（dfd）”基因型的番茄果實(shí)由于其果實(shí)角質(zhì)層的組成和性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致角質(zhì)層透性降低，果實(shí)的持水能力增強(qiáng)，從而延緩了采后果實(shí)的軟化和品質(zhì)劣變[14]。Romero 等[16]發(fā)現(xiàn)，水分脅迫條件誘導(dǎo)“Ailsa Craig（AC）”和“M82”番茄果實(shí)上調(diào)了角質(zhì)層生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致角質(zhì)層含量增加，并降低了角質(zhì)層的透性，因此降低了采后果實(shí)的蒸騰速率，進(jìn)而延緩了果實(shí)的軟化，在一定程度上延長(zhǎng)了“AC”和“M82”番茄果實(shí)的貨架期。柑橘果實(shí)表皮的角質(zhì)層可防止水分流失、抵御外界微生物侵入、調(diào)節(jié)生理代謝，從而有效保護(hù)柑橘果實(shí)的采后貯藏品質(zhì)[17]。在生產(chǎn)中，也經(jīng)常通過在果實(shí)表面打蠟以減少果實(shí)采后的水分損失，從而延長(zhǎng)果實(shí)的采后貯藏期[18]。一些轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用也證實(shí)果實(shí)角質(zhì)層與果實(shí)采后失水密切相關(guān)。羅志丹[19]利用RNAi（RNA interference，RNAi）技術(shù)沉默“中蔬6 號(hào)”番茄中一個(gè)非特異性脂轉(zhuǎn)移蛋白（nsLTP），發(fā)現(xiàn)nsLTP沉默會(huì)影響角質(zhì)層生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因CYP86和MS2的表達(dá)模式，并與參與角質(zhì)層形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子CD2 互作來(lái)調(diào)控番茄果實(shí)蠟質(zhì)的合成與沉積，nsLTP沉默株系番茄果實(shí)角質(zhì)層蠟增厚，蠟質(zhì)組分與野生型相比存在明顯差異，且在采后貯藏階段失水率較低，表現(xiàn)出良好的持水性。轉(zhuǎn)錄因子FUL1 和FUL2 屬于MADS-box 家族，參與番茄果實(shí)成熟調(diào)控且功能冗余，利用RNAi 技術(shù)共沉默“Micro-Tom”番茄果實(shí)中的FUL1和FUL2，通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系番茄果實(shí)的角質(zhì)層代謝發(fā)生改變，且與野生型果實(shí)相比，轉(zhuǎn)基因株系果實(shí)的采后失水率增加[20]。同時(shí)，最近的研究發(fā)現(xiàn)，果實(shí)角質(zhì)層的組成、結(jié)構(gòu)和特性在果實(shí)采后處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過程，不同果實(shí)種類及同一種類不同品種之間，角質(zhì)層的動(dòng)態(tài)變化過程都存在明顯差異，并顯著影響果實(shí)采后的貯藏性能[21-25]。

3 果實(shí)角質(zhì)層的生物合成

3.1 脂肪酸的生物合成

脂肪酸是角質(zhì)和蠟質(zhì)生物合成的共同前體，通過從頭合成途徑在質(zhì)體中合成，其中，脂肪酸合酶系統(tǒng)（FAS，一種多酶復(fù)合體，包括1 種?；d體蛋白（ACP）和6 種酶：乙酰CoA：ACP 酰基轉(zhuǎn)移酶（AT）、丙二酸單酰CoA：ACP 轉(zhuǎn)移酶（MT）、β-酮脂酰-ACP 合酶（KS）、β-酮脂酰-ACP 還原酶（KR）、β-羥脂酰-ACP 脫水酶（HD）、烯酯酰-ACP還原酶（ER））為該生物合成途徑的主要催化工具。下面對(duì)脂肪酸前體的生物合成途徑作簡(jiǎn)要概述（圖1）。

圖1 脂肪酸前體的生物合成途徑[26-29]Fig.1 Biosynthetic pathway of fatty acid precursors[26-29]

首先，乙酰CoA 在乙酰CoA 羧化酶的作用下生成丙二酸單酰CoA，然后在FAS 作用下，乙酰CoA 轉(zhuǎn)化為乙酰-ACP（AT 催化），丙二酸單酰CoA 轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰-ACP（MT 催化）。此后先后經(jīng)歷乙酰-ACP 和丙二酸單酰-ACP 的縮合（KS催化）、乙酰乙酰-ACP 的還原（KR 催化）、D-3-羥基丁酰-ACP 的脫水（HD 催化）、烯酯酰-ACP 的還原（ER 催化）這四個(gè)過程生成丁酰-ACP。丁酰-ACP 重復(fù)經(jīng)歷上述縮合、還原、脫水、還原這四個(gè)循環(huán)過程而不斷獲得丙二酸單酰-ACP 的二碳單位，進(jìn)而形成C16和C18等長(zhǎng)鏈脂肪酸。其中飽和的C16和C18脂肪酸為蠟質(zhì)生物合成的主要前體，C16：0和C18：x羥基脂肪酸為角質(zhì)生物合成的主要單體[26-29]。

3.2 角質(zhì)的生物合成

角質(zhì)單體的生物合成在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行，首先C16和C18前體通過?；?ACP 硫酯酶去除ACP，再通過長(zhǎng)鏈酰基-CoA 合成酶（LACS）連接CoA 進(jìn)行活化[27-28，30]。角質(zhì)生物合成的前體長(zhǎng)鏈脂肪酸向角質(zhì)單體轉(zhuǎn)化的過程中，細(xì)胞色素P450 酶家族催化了轉(zhuǎn)化過程中羥基化和環(huán)氧化過程，其中CYP77A，CYP86A 和CYP94B 亞家族負(fù)責(zé)鏈中和鏈末端的羥基化過程[31-35]。甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶如GPAT6 負(fù)責(zé)角質(zhì)單體向單脂酰甘油轉(zhuǎn)化[36]，而單脂酰甘油通過ABCG 運(yùn)載體如ABCG36 和ABCG42 被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外（未酯化的ω-羥基十六烷酸和十六烷二酸也可作為潛在的角質(zhì)前體被轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外）[37]，隨后在定位于胞外的?；D(zhuǎn)移酶如CD1/GDSL1/CUS1 的作用下連接到已有角質(zhì)聚合體游離的ω-羥基上，形成酯鍵，這個(gè)過程需要消耗ATP。而角質(zhì)聚合單鏈中的鏈中羥基則參與酯鏈間的交叉連接從而形成最終的復(fù)雜網(wǎng)狀聚合物結(jié)構(gòu)[6，38-41]。主要存在于質(zhì)膜附近和外層表皮細(xì)胞壁的角質(zhì)小體也被發(fā)現(xiàn)參與角質(zhì)的生物合成，角質(zhì)小體是由酯化的角質(zhì)單體形成的自組裝粒子，主要在果實(shí)發(fā)育前期的細(xì)胞分裂階段參與角質(zhì)的形成，并為細(xì)胞膨大階段依賴于?；D(zhuǎn)移酶的進(jìn)一步角質(zhì)聚合提供模板[41]。同時(shí)，近期研究發(fā)現(xiàn)，聚合角質(zhì)可在角質(zhì)：角質(zhì)脂肪酸內(nèi)轉(zhuǎn)酰酶（CCT）的作用下發(fā)生裂解與重組[42]，在角質(zhì)：木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶（CXT）的作用下與表皮細(xì)胞壁多糖形成共價(jià)連接[43]（圖2）。

3.3 蠟質(zhì)的生物合成

在蠟質(zhì)的生物合成過程中，C16和C18前體同樣需要通過酰基-ACP 硫酯酶和LACS 活化為脂酰CoA 的形式，才能進(jìn)一步在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)延長(zhǎng)為超長(zhǎng)鏈脂肪酸[27-28，30]。脂肪酸延長(zhǎng)酶（FAE，一種多酶復(fù)合物，主要包括β-酮脂酰-CoA 合成酶（KCS）、β-酮脂酰-CoA 還原酶（KCR）、β-羥脂酰-CoA 脫水酶（HCD）、烯脂酰-CoA 還原酶（ECR）)為脂肪酸前體進(jìn)一步延長(zhǎng)的主要工具?；罨蟮闹oA 在ATP 存在的情況下，先后經(jīng)歷與丙二酸單酰CoA縮合（KCS 催化）、還原（KCR 催化）、脫水（HCD 催化）、還原（ECR 催化）這四個(gè)類似于脂肪酸從頭合成途徑的循環(huán)過程，從而不斷獲得丙二酸單酰CoA 的二碳單位以形成長(zhǎng)鏈及超長(zhǎng)鏈脂肪酸。而超長(zhǎng)鏈脂肪酸可以通過脫羰基途徑和?；€原途徑形成醛、烴、醇、酮、酯、三萜、甾醇等各類衍生物，即蠟質(zhì)的主要成分[44-46]。目前，SlCER6[47-48]和StKCS6[49]被報(bào)道分別參與番茄果實(shí)和馬鈴薯塊莖表皮蠟質(zhì)的生物合成，其編碼一個(gè)蠟質(zhì)生物合成過程中的KCS，優(yōu)先負(fù)責(zé)C28以上脂肪酸鏈的延長(zhǎng)。而CsCER1和CsWAX2/CER3可能參與脫羰基途徑，在黃瓜果實(shí)角質(zhì)層尤其是超長(zhǎng)鏈烷烴的生物合成中起到重要作用[50-51]。SlTTS1和SlTTS2被報(bào)道編碼番茄中兩個(gè)氧鯊烯環(huán)化酶（oxidosqualene cyclases，OSCs），其負(fù)責(zé)三萜生物合成的第一步，催化環(huán)氧角鯊烯環(huán)化成各種三萜醇異構(gòu)體。酵母表達(dá)系統(tǒng)和番茄的過表達(dá)系統(tǒng)分析表明，SlTTS1 是一種產(chǎn)物特異性的β-amyrin 合成酶，而SlTTS2 是一種多功能的OSC，其主要產(chǎn)物為δamyrin[52]（圖2）。蘋果中鑒定出的MdOSC1、MdOSC4、MdOSC5和CYP716A175參與蘋果果實(shí)三萜類物質(zhì)的生物合成并控制三萜類產(chǎn)物的相對(duì)比例，其中MdOSC1、MdOSC2、MdOSC3 均為多功能的OSC，而CYP716A175 是一個(gè)多功能的三萜C-28 氧化酶，負(fù)責(zé)將三萜氧化為各類三萜酸[53]。

圖2 角質(zhì)和蠟質(zhì)的生物合成途徑[6，27-28，30-53]Fig.2 Biosynthetic pathway of cutin and wax[6，27-28，30-53]

3.4 果實(shí)角質(zhì)層形成的候選基因

果實(shí)角質(zhì)層生物合成途徑除上述已經(jīng)闡明的部分，目前通過生物信息學(xué)比對(duì)、多組學(xué)聯(lián)合、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）等多種分析技術(shù)，獲得了許多參與果實(shí)角質(zhì)層形成的候選基因，例如黃瓜中的CsCER4[54]，甜櫻桃中的PaWINA、PaWINB、PaLipase、PaLTPG1、PaATT1、PaLCR、PaGPAT4/8、PaLACS1、PaLACS2、PaCER1[55]，越桔中的CER26-like、FAR2、CER3-like、LTP、MIXTA、BAS[56]，棗中的BCCP2[57]，蘋果中的CER1、CER2、CER4、CER10、LACS2、KCS7/2、LCR、FDH、PAS2、WBC11、LTPG1、WIN1、SHINE2、MYB30[58-64]，柑橘中的KCS6、CER3、CER1-1、MYB96、GL1-like[65-66]，芒果中的MiSHN1、MiCD2、MiCER1、MiCER2、MiCER3、MiKCS2、MiKCS6、MiWBC11、MiLTP1、MiLTP2、MiLTP3、MiLTPG1、MiCUS1、MiCUS2、MiPEL1[24]，番茄中的SlSHN1、LIN5[67-68]，這些基因被預(yù)測(cè)在果實(shí)角質(zhì)層生物合成中發(fā)揮重要作用，但仍需通過轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)手段進(jìn)一步驗(yàn)證其功能。

4 果實(shí)角質(zhì)層的調(diào)控

直接參與果實(shí)角質(zhì)層生物合成過程的關(guān)鍵基因在前述內(nèi)容已經(jīng)進(jìn)行介紹，本節(jié)主要綜述近年來(lái)報(bào)道的轉(zhuǎn)錄因子及植物激素層面對(duì)果實(shí)角質(zhì)層形成的調(diào)控作用。

4.1 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控

在果實(shí)發(fā)育和成熟的進(jìn)程中，果實(shí)角質(zhì)層的成分和結(jié)構(gòu)處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的變化過程，這是果實(shí)角質(zhì)層代謝相關(guān)基因時(shí)空特異性表達(dá)的綜合結(jié)果，而這種基因的時(shí)空特異性表達(dá)很大程度上取決于轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，因此，對(duì)角質(zhì)層代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的挖掘及其靶基因的鑒定是未來(lái)果實(shí)角質(zhì)層研究中的重點(diǎn)內(nèi)容。隨著近年基因編輯、角質(zhì)層分析等生物技術(shù)的快速發(fā)展，在角質(zhì)層代謝的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究上也取得了一定進(jìn)展。例如，HDZip IV 家族中的CD2 是第一個(gè)在番茄果實(shí)中通過圖位克隆鑒定的參與角質(zhì)層代謝的轉(zhuǎn)錄因子，其可能通過對(duì)角質(zhì)裝配過程中關(guān)鍵基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控從而參與角質(zhì)層代謝?！癱d2”突變體番茄果實(shí)角質(zhì)層的角質(zhì)含量降低了95%～98%[69-71]。同時(shí)在番茄果實(shí)中，AP2 家族的轉(zhuǎn)錄因子SHN3 也被證明通過調(diào)控角質(zhì)層代謝和表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的一系列相關(guān)基因參與果實(shí)角質(zhì)層的發(fā)育，SHN3 在綠熟期番茄果實(shí)的外果皮表達(dá)活躍，沉默SHN3 會(huì)導(dǎo)致番茄果實(shí)角質(zhì)層中角質(zhì)和蠟質(zhì)含量顯著降低[72-73]。此外，Giménez 等[74]通過RNAi 技術(shù)大幅降低MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子TAGL1 在番茄果實(shí)中的豐度，發(fā)現(xiàn)TAGL1 沉默顯著影響番茄果實(shí)的角質(zhì)層發(fā)育，沉默株系果實(shí)角質(zhì)層的厚度、剛度及角質(zhì)層主要組分（角質(zhì)、蠟質(zhì)、多糖、酚類化合物）含量顯著降低，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TAGL1 通過調(diào)控番茄果實(shí)中CD2、CER6、SHN1、SHN3等角質(zhì)層合成中關(guān)鍵基因的表達(dá)以參與番茄果實(shí)角質(zhì)層的發(fā)育。此外，MIXTA-like 被發(fā)現(xiàn)是番茄果實(shí)角質(zhì)層形成的一個(gè)正調(diào)控因子，相較于野生型果實(shí)，MIXTA-like-RNAi 果實(shí)角質(zhì)層厚度顯著降低，果實(shí)的采后失重率顯著升高，抗病能力下降，表皮細(xì)胞模式出現(xiàn)缺陷，進(jìn)一步研究表明，MIXTA-like作用于SHN3 的下游，并通過調(diào)控CYP77A和CYP86A亞家族、LACS2、GPAT4、ATP-BINDING CASSETTE11的表達(dá)水平促進(jìn)番茄果實(shí)的角質(zhì)層形成[75]。將近年來(lái)報(bào)道的對(duì)不同果實(shí)角質(zhì)層形成有調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子及其功能、靶基因和間接調(diào)控的基因匯總為表1。

表1 果實(shí)角質(zhì)層形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Table 1 Transcription factors related to cuticle formation in fruits

4.2 植物激素調(diào)控

在果實(shí)發(fā)育和成熟的過程中，果實(shí)內(nèi)部植物激素的水平也在不斷變化，果實(shí)角質(zhì)層的發(fā)育除了受到一系列轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，在一定程度上也受到植物激素的調(diào)控，下面對(duì)近年來(lái)所發(fā)現(xiàn)的可能調(diào)控果實(shí)角質(zhì)層發(fā)育的植物激素進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。

4.2.1 脫落酸 水分脅迫會(huì)誘導(dǎo)植物體脫落酸的積累，而脫落酸信號(hào)則會(huì)激活一系列生理響應(yīng)，例

如促進(jìn)蠟質(zhì)的積累來(lái)增強(qiáng)植物的持水能力以降低干旱條件對(duì)植物體的傷害[85]。而Martin 等[86]的研究表明脫落酸對(duì)番茄植株角質(zhì)層形成的調(diào)控作用不單單是干旱誘導(dǎo)的結(jié)果，同時(shí)也是與器官自然發(fā)育進(jìn)程密切相關(guān)的，并不依賴于干旱脅迫的誘導(dǎo)，且發(fā)現(xiàn)脫落酸對(duì)番茄葉片的調(diào)控作用較果實(shí)而言更為顯著。近期，Romero 等[87]發(fā)現(xiàn)，ABA 可通過調(diào)控角質(zhì)層代謝基因的表達(dá)模式影響蠟質(zhì)代謝，ABA 缺乏會(huì)導(dǎo)致甜橙果實(shí)成熟過程中蠟質(zhì)組成發(fā)生改變，同時(shí)角質(zhì)層透性增加。然而，目前脫落酸對(duì)果實(shí)角質(zhì)層的具體調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步闡明。

4.2.2 赤霉素 目前赤霉素廣泛應(yīng)用于預(yù)防由于角質(zhì)層破損或形成不當(dāng)誘發(fā)的蘋果銹果病[88]。研究發(fā)現(xiàn)，外源赤霉素處理可有效促進(jìn)番茄果實(shí)和蘋果果實(shí)表面角質(zhì)層的沉積[88-89]，Li 等[90]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)IS1 編碼一個(gè)GA2 氧化酶，該位點(diǎn)的突變將提高番茄果實(shí)的活性赤霉素含量，進(jìn)而誘導(dǎo)提高了一系列角質(zhì)層形成相關(guān)基因的表達(dá)水平，從而促進(jìn)番茄果實(shí)角質(zhì)和蠟質(zhì)的沉積，但目前赤霉素促進(jìn)角質(zhì)層生物合成的具體機(jī)制尚不明確。

4.2.3 乙烯 乙烯是呼吸躍變型果實(shí)成熟進(jìn)程中最重要的內(nèi)源植物激素之一，乙烯信號(hào)通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)元件傳導(dǎo)至細(xì)胞核區(qū)，最終啟動(dòng)大量成熟相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)果實(shí)成熟[91]。Kosma 等[92]發(fā)現(xiàn)乙烯合成受阻的 “ripening inhibitor（rin）”、“non-ripening（nor）”及一種延遲成熟的地方品種“Alcoba?a”3 種突變體番茄果實(shí)的角質(zhì)層組分尤其是蠟質(zhì)組分相較于“AC”番茄果實(shí)存在明顯差異，且這種差異貫穿于整個(gè)果實(shí)發(fā)育及成熟進(jìn)程。Giménez 等[74，93]在番茄中利用RNAi 技術(shù)沉默TAGL1，番茄果實(shí)乙烯合成受阻，果實(shí)無(wú)法正常成熟，且沉默株系的果實(shí)角質(zhì)層發(fā)育異常。以上研究結(jié)果提示，果實(shí)角質(zhì)層的發(fā)育是果實(shí)成熟進(jìn)程的一部分，而乙烯可能通過調(diào)控果實(shí)成熟相關(guān)基因控制果實(shí)成熟，進(jìn)而調(diào)控果實(shí)角質(zhì)層的發(fā)育。然而目前尚未有研究直接證明乙烯和果實(shí)角質(zhì)層發(fā)育之間的相關(guān)性。

5 果實(shí)角質(zhì)層的研究方法

5.1 果實(shí)角質(zhì)層研究的材料選擇

在早年有關(guān)于角質(zhì)層的組成、結(jié)構(gòu)、生物合成與調(diào)控的研究發(fā)現(xiàn)大都是基于擬南芥模型，但是擬南芥的角質(zhì)層存在過薄、易碎、含有氣孔的特點(diǎn)，這并不利于角質(zhì)層的生物學(xué)研究[94]。而番茄果實(shí)的角質(zhì)層較厚、表面連續(xù)、不含氣孔、易于分離，且對(duì)番茄果實(shí)角質(zhì)層的研究將有助于推動(dòng)理解角質(zhì)層對(duì)肉質(zhì)果實(shí)生理和品質(zhì)的作用機(jī)制，因此對(duì)于果實(shí)角質(zhì)層的研究來(lái)說，番茄是一種更加合適的模式植物[1，47]。

5.2 果實(shí)角質(zhì)層研究的試驗(yàn)技術(shù)

5.2.1 果實(shí)角質(zhì)層的分離 果實(shí)角質(zhì)層的分離是研究果實(shí)角質(zhì)層的基礎(chǔ)。目前在果實(shí)角質(zhì)層分離上運(yùn)用最廣泛的方法是酶分離法，通常利用不同濃度的酶解液獲得果實(shí)的角質(zhì)層，例如果膠酶和纖維素酶的混合酶解液。角質(zhì)層分離速度主要受到酶濃度、酶解溫度和酶解液pH 值的影響，提高酶濃度或溫度會(huì)加速角質(zhì)層的分離，而角質(zhì)層分離速度與酶解液pH 值呈負(fù)相關(guān)性[11]。此外，角質(zhì)和蠟質(zhì)的單獨(dú)分離技術(shù)也在不斷改良與創(chuàng)新，目前表面覆蓋蠟通常用黏合劑等機(jī)械方式剝離，嵌入蠟在表面覆蓋蠟剝離后用氯仿等有機(jī)溶劑浸提，而角質(zhì)的提取則在脫蠟果實(shí)的基礎(chǔ)上用酶解法結(jié)合有機(jī)溶劑萃取法分離[17，28，86]。

5.2.2 果實(shí)角質(zhì)層的分析 目前已趨于成熟的測(cè)試分析技術(shù)例如氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）、氣液色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GLCMS）、甲苯胺藍(lán)染色法、蘇丹III 染色法、蘇丹IV染色法、金胺O 熒光染色法、光學(xué)顯微鏡、掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）、原子力顯微鏡（AFM）等都可用于角質(zhì)層組分的定性、定量分析和角質(zhì)層結(jié)構(gòu)勘測(cè)，而一些新興的高精度技術(shù)如二維GC、串聯(lián)色譜分析技術(shù)、高溫GC（HTGC）、高溫GC-MS 聯(lián)用技術(shù)（HTGC-MS）、紅外和Raman 顯微光譜分析將成為有價(jià)值的補(bǔ)充工具進(jìn)而實(shí)現(xiàn)更精確的果實(shí)角質(zhì)層多樣性分析[3，74]。而目前成熟的各種分子生物學(xué)手段如RT-qPCR與各類高效率的生物技術(shù)服務(wù)則為闡明果實(shí)角質(zhì)層生物合成與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了有力支持。此外，一系列計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)也在果實(shí)角質(zhì)層的研究中發(fā)揮重要的作用。

5.3 果實(shí)角質(zhì)層的研究思路

果實(shí)角質(zhì)層中的角質(zhì)和蠟質(zhì)使得果實(shí)表面具有明顯的光澤。通過果實(shí)表皮亮度改變的表型來(lái)識(shí)別角質(zhì)層的突變體，以發(fā)現(xiàn)調(diào)控果實(shí)角質(zhì)層形成的候選基因[95]。

利用組學(xué)技術(shù)對(duì)果實(shí)角質(zhì)層發(fā)生改變的突變體與野生型進(jìn)行全面分析與比較，找到控制突變的候選關(guān)鍵基因及相關(guān)代謝途徑[3]。目前大量研究結(jié)果提示果實(shí)角質(zhì)層的形成是果實(shí)成熟進(jìn)程中的一部分，因此，可以嘗試通過一些基因工程技術(shù)例如病毒誘導(dǎo)基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)篩選出一些能夠調(diào)控果實(shí)角質(zhì)層形成的成熟相關(guān)基因，可能的思路如下：

（1）角質(zhì)層的組學(xué)分析，包括利用轉(zhuǎn)錄組、代謝組和蛋白組篩選可能參與果實(shí)角質(zhì)層形成的候選基因；（2）通過VIGS 技術(shù)高通量篩選候選基因；（3）通過果實(shí)貯藏失水和表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察等試驗(yàn)分析角質(zhì)層變化；（4）確定候選基因在果實(shí)角質(zhì)層形成網(wǎng)絡(luò)中的作用。

對(duì)擬南芥中已報(bào)道的角質(zhì)層代謝相關(guān)基因和番茄果實(shí)中已鑒定出的角質(zhì)層數(shù)量性狀位點(diǎn)[96]進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證，通過CRISPR/Cas9、RNAi、過表達(dá)等轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得該基因位點(diǎn)的突變體，并對(duì)突變體果實(shí)的角質(zhì)層組成、結(jié)構(gòu)，表皮代謝模式進(jìn)行系統(tǒng)分析，以解析該基因在果實(shí)角質(zhì)層形成中的功能。

6 展望

果實(shí)是植物體上極具食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的繁殖器官，角質(zhì)層對(duì)于保護(hù)果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育和維持其采后貯藏品質(zhì)具有重要的作用，然而目前對(duì)于角質(zhì)層的研究主要還是集中在擬南芥和番茄等模式植物的葉片等營(yíng)養(yǎng)器官上，對(duì)非模式植物及果實(shí)角質(zhì)層的研究尚不充分。

果實(shí)角質(zhì)層復(fù)雜的生物合成和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)至今尚不完全清晰，其中涉及的相關(guān)分子機(jī)制應(yīng)是今后研究需要重點(diǎn)關(guān)注的領(lǐng)域。目前大量研究提示角質(zhì)層的形成是果實(shí)成熟進(jìn)程的一部分，因此控制果實(shí)成熟的相關(guān)基因有望成為接下來(lái)果實(shí)角質(zhì)層生物合成與調(diào)控分子機(jī)制的研究方向。

當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)果實(shí)角質(zhì)層組分、結(jié)構(gòu)、特性在采后的變化對(duì)于果實(shí)的采后貯藏性能具有顯著的影響，因此明確重要經(jīng)濟(jì)作物果實(shí)角質(zhì)層的采后變化規(guī)律對(duì)于指導(dǎo)果實(shí)采后處理，更好地維持其采后貯藏品質(zhì)具有重要的意義。

近年來(lái)對(duì)于果實(shí)角質(zhì)層的組分、結(jié)構(gòu)、功能特性及生物合成與調(diào)控的研究雖然取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但其中還是存在很大的知識(shí)空缺，在深入研究的同時(shí)應(yīng)該與果蔬產(chǎn)業(yè)鏈的各個(gè)環(huán)節(jié)相結(jié)合，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為食用健康價(jià)值和社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。