于 平，胡淳玉，黃星星，劉 航，楊柳貞，賀 敏，馬 健

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州310018）

肌醇，又名肌糖、環(huán)己六醇，是一種具有生物活性的環(huán)化醇[1-2]，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的組織細(xì)胞、高等植物、真菌和一些細(xì)菌中，是組織培養(yǎng)中許多細(xì)胞不可缺少的一種生長(zhǎng)因子[3]。肌醇具有降血脂、降膽固醇、抗衰老、抗焦慮和抗抑郁等多種功效[4-5]。它的代謝也與神經(jīng)管缺陷、唐氏綜合征、阿爾茨海默病和糖尿病腎小球病變等許多臨床疾病息息相關(guān)，其在食品、飼料、醫(yī)學(xué)和醫(yī)藥等方面有著廣泛的應(yīng)用。目前肌醇的制備方法主要有水解法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。水解法和化學(xué)合成法生產(chǎn)肌醇，制備工藝繁瑣，生產(chǎn)成本高，嚴(yán)重制約了其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)肌醇，具有高效率和低成本等優(yōu)點(diǎn)，成為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)肌醇的新趨勢(shì)。目前用于發(fā)酵生產(chǎn)肌醇的菌株主要有釀酒酵母[6]、假絲酵母[7]和黑曲霉[8]等，未見(jiàn)利用植物乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)肌醇的報(bào)道。

植物乳桿菌是一類革蘭氏陽(yáng)性厭氧細(xì)菌，呈無(wú)芽孢的球狀或桿狀[9-10]，主要存在于人類和動(dòng)物的黏膜、植物、發(fā)酵食品、污水和飼料中，大多數(shù)是促進(jìn)健康的有益菌[11-12]。植物乳桿菌因具有獨(dú)特的益生特性而引起社會(huì)各界的密切關(guān)注。目前的研究表明，植物乳桿菌具有提高食物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，抑制病原菌的生長(zhǎng)，抗氧化，降膽固醇，增強(qiáng)免疫力和預(yù)防癌癥等多種益生特性[13-14]。植物乳桿菌定植于動(dòng)物腸道內(nèi)，能產(chǎn)生一些消化酶類，將食物中的蛋白質(zhì)和糖類等物質(zhì)分解成易于機(jī)體吸收的小分子物質(zhì)，促進(jìn)食物的消化吸收[15]。植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的有機(jī)酸和醛類等物質(zhì)能改善食品風(fēng)味，產(chǎn)生的葉酸和維生素B12等能增強(qiáng)食物的營(yíng)養(yǎng)性。Molina 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，利用產(chǎn)維生素B12的植物乳桿菌發(fā)酵大豆，制備出含維生素B12的豆乳食品，可用于預(yù)防維生素缺乏癥，是一種有效的替代療法。Bhavsar 等[17]將篩選到的兩株高產(chǎn)植酸酶活性的戊糖片球菌KTU05-8 和KTU05-9 用于制作全麥面包，結(jié)果發(fā)現(xiàn)全麥面包中鈣、鐵和鋅的含量平均增加了30%。

菌粉因具有運(yùn)輸方便、保藏性和安全性高等優(yōu)點(diǎn)而在食品工業(yè)中備受青睞，是目前工業(yè)上保藏菌種的方式之一。菌粉制備工藝主要是通過(guò)干燥工藝將高濃度菌液進(jìn)行固化處理，將菌體以活菌形態(tài)保存下來(lái)的工藝[18]。真空冷凍干燥是一種常用的菌粉干燥技術(shù)，主要包括3 個(gè)步驟：冷凍、真空干燥和復(fù)水[19-20]。冷凍干燥不會(huì)使菌體過(guò)度收縮，可以得到完全可溶的菌粉，很容易再水化[21]。微生物細(xì)胞在真空干燥過(guò)程中的存活取決于許多因素，包括初始微生物濃度、保護(hù)介質(zhì)和復(fù)水條件等[22-23]。保護(hù)性添加劑在生物活性保護(hù)中起著重要的作用。適合的保護(hù)劑在冷凍過(guò)程中為細(xì)胞提供低溫保護(hù)，易于干燥，并提供良好的基質(zhì)，使細(xì)胞穩(wěn)定，易復(fù)水。

隨著益生菌在食品、藥品和保健品等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，菌粉在益生菌市場(chǎng)的占有比例也越來(lái)越大[24-25]，開(kāi)發(fā)高品質(zhì)、高活力和高貯藏性的菌粉是工業(yè)生產(chǎn)者的目標(biāo)。不同的菌粉制備方法對(duì)益生菌的大量存活和功能表達(dá)均有影響。盡管冷凍干燥是制備益生菌粉的最溫和的脫水技術(shù)[25]，但它還會(huì)將益生菌暴露在不利的條件下，如極低的溫度和干燥引起的細(xì)胞損傷以及凍干過(guò)程中冰晶的形成等。在制備菌粉的過(guò)程中，必須建立生產(chǎn)和維護(hù)技術(shù)，最大限度地提高細(xì)菌細(xì)胞的儲(chǔ)存穩(wěn)定性、活力和活性[26]。

前期研究中，項(xiàng)目組成員從泡菜中篩選了1株能夠高產(chǎn)肌醇的植物乳桿菌ZJ2868[27]。本文主要研究其菌粉制備工藝。首先研究菌粉制備過(guò)程中的離心條件和保護(hù)劑配方，然后對(duì)菌粉的復(fù)溶條件和貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行研究，以期得到高存活率、高品質(zhì)的植物乳桿菌ZJ2868 凍干菌粉。

1 材料與方法

1.1 菌株

植物乳桿菌ZJ2868，由項(xiàng)目組成員從泡菜中分離得到，該菌能夠發(fā)酵生產(chǎn)肌醇，為功能性益生菌[27]。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

MRS 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，檸檬酸三銨2 g/L，乙酸鈉5 g/L，吐溫-80 1 mL/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，葡萄糖20 g/L（單獨(dú)分裝滅菌），pH 6.5，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖36.56 g/L，酵母粉35.21 g/L，乙酸鈉5.80 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫-80 1 mL/L。

脫脂乳保護(hù)劑：稱取一定量的脫脂乳粉溶解于盛有50 mL 蒸餾水的錐形瓶中，108 ℃滅菌15 min。

海藻糖保護(hù)劑：稱取一定量的海藻糖溶解于盛有50 mL 蒸餾水的錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。

谷氨酸鈉保護(hù)劑：稱取一定量的谷氨酸鈉溶解于盛有50 mL 蒸餾水的錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。

葡萄糖、檸檬酸三銨、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80、乙酸鈉、谷氨酸鈉、海藻糖和無(wú)水硫酸鈉等試劑，上海生工生物工程有限公司。脫脂乳粉，購(gòu)于杭州永輝超市。

1.3 主要儀器

ME204 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；YXQ-LS-5011 壓力蒸汽滅菌器，上海博迅有限公司；LRH 系列生化培養(yǎng)箱，上海一恒有限公司；2K15 型高速低溫離心機(jī)，SIGMA 公司；-80 ℃超低溫冰箱，THERMO 公司；SCIENTZ-10Z 冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物有限公司；SW-CJ-1FD 潔凈工作臺(tái)，蘇州金凈凈化有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 菌株ZJ2868 凍干菌粉的制備工藝 菌株ZJ2868 凍干菌粉的制備工藝流程：

菌種復(fù)蘇→菌株ZJ2868 在培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)→離心收集菌體→菌體與保護(hù)劑融合液的制備→預(yù)凍→真空冷凍干燥→菌株ZJ2868 凍干菌粉。

1.4.2 離心收集最佳條件的選擇 收集培養(yǎng)48 h 的5 mL 菌液4 份，分別裝入無(wú)菌的10 mL 離心管中離心，離心條件為4 000 r/min、10 min、4 ℃，4 000 r/min、20 min、4 ℃，6 000 r/min、10 min、4 ℃，6000 r/min、20 min、4 ℃。收集離心的發(fā)酵上清液，對(duì)剩余菌體添加5 mL 滅菌的生理鹽水渦旋混勻，分別取樣稀釋，梯度涂平板，計(jì)算其活菌數(shù)。根據(jù)下述公式計(jì)算離心損失率、離心存活率以及離心收獲率。

1.4.3 凍干菌懸液的制備 收集離心的菌體，加入配制好的保護(hù)劑（體積為離心前培養(yǎng)液的1/5），渦旋混勻，得到凍干菌懸液，室溫放置1 h，使保護(hù)劑和菌體充分融合。

1.4.4 菌懸液的真空冷凍干燥 將凍干菌懸液置于-80 ℃冰箱預(yù)凍2 h，取出后立即放入冷凍干燥機(jī)中，避免因溫度突然上升而致菌體受損。將樣品置于冷凍干燥機(jī)中持續(xù)凍干24 h（冷凍干燥機(jī)要預(yù)先開(kāi)啟，使冷阱溫度降至-55 ℃，工作時(shí)真空度降至1 Pa）。

1.4.5 凍干保護(hù)劑的優(yōu)化 真空冷凍干燥雖然是目前最常見(jiàn)的菌粉制備方法，但是其會(huì)對(duì)菌體造成很多不利的影響。產(chǎn)生的冰晶會(huì)破壞某些酶蛋白，從而影響益生菌的活性[28]。為在脫水過(guò)程中保護(hù)益生菌的生存能力，糖類物質(zhì)、蛋白質(zhì)類物質(zhì)和氨基酸類物質(zhì)等常被用作低溫保護(hù)劑。確定合適的保護(hù)劑是提高細(xì)胞存活率的關(guān)鍵。單一的保護(hù)劑往往不能使凍干的菌粉活力達(dá)到最佳值，一般需要使用多種保護(hù)劑組合。通過(guò)查閱文獻(xiàn)并結(jié)合試驗(yàn)成本，選擇3 種常用的對(duì)植物乳桿菌保護(hù)效果較優(yōu)的保護(hù)劑，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定各保護(hù)劑的最佳濃度范圍，然后以菌株ZJ2868 凍干存活率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)確定最佳復(fù)合保護(hù)劑配方。

1.4.5.1 谷氨酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)菌株ZJ2868 凍干存活率的影響 收集離心的菌泥5 份，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，5%，8%，11%和14%的谷氨酸鈉保護(hù)劑1 mL，平衡1 h，預(yù)凍2 h，真空冷凍干燥24 h，加入生理鹽水復(fù)溶30 min，計(jì)算活菌數(shù)及存活率。

1.4.5.2 脫脂乳質(zhì)量濃度對(duì)菌株ZJ2868 凍干存活率的影響 收集離心后的菌泥5 份，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，6%，10%，14%和18%的脫脂乳保護(hù)劑1 mL，平衡1 h，預(yù)凍2 h，真空冷凍干燥24 h，加入生理鹽水復(fù)溶30 min，計(jì)算活菌數(shù)及存活率。

1.4.5.3 海藻糖質(zhì)量濃度對(duì)菌株ZJ2868 凍干存活率的影響 收集離心的菌泥5 份，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，6%，9%，12%和15%的海藻糖保護(hù)劑1 mL，平衡1 h，預(yù)凍2 h，真空冷凍干燥24 h，加入生理鹽水復(fù)溶30 min，計(jì)算活菌數(shù)及存活率。

1.4.5.4 保護(hù)劑正交試驗(yàn) 依據(jù)上述單因素試驗(yàn)確定的谷氨酸鈉、脫脂乳、海藻糖的最佳濃度取值范圍，用SPSS 17.0 軟件設(shè)計(jì)四因素三水平共9個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的正交試驗(yàn)。以谷氨酸鈉（A）、脫脂乳（B）、海藻糖（C）作為正交設(shè)計(jì)的自變量，以菌株ZJ2868 凍干菌粉存活率作為因變量，每個(gè)因素的3 個(gè)水平分別以（1，2，3）編碼，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)做3 次平行試驗(yàn)來(lái)減小試驗(yàn)誤差。正交試驗(yàn)因素與水平的設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.4.6 菌粉復(fù)水溶劑及時(shí)間的確定 取冷凍干燥的菌粉若干管，加入與凍干前相同體積培養(yǎng)液的復(fù)水溶劑（無(wú)菌水、0.85%生理鹽水和原保護(hù)劑），于室溫下復(fù)水0，30 min 和60 min，分別取樣，按照10-1，10-2和10-3進(jìn)行梯度稀釋后涂平板，計(jì)算活菌數(shù)，比較不同復(fù)水溶劑與復(fù)水時(shí)間對(duì)凍干菌粉存活率的影響。

1.4.7 菌粉貯藏穩(wěn)定性的研究 將制備好的菌粉封口，分別置室溫和4 ℃條件下貯藏，于貯藏的第6，12，18，24 天和30 天分別取樣，加入原保護(hù)劑介質(zhì)，復(fù)水30 min 后計(jì)算活菌數(shù)，與貯藏前的活菌數(shù)比較，研究貯藏時(shí)間和溫度對(duì)菌粉存活率的影響。

1.4.8 分析方法

1.4.8.1 菌粉活菌計(jì)數(shù) 菌粉活菌計(jì)數(shù)采用稀釋梯度平板計(jì)數(shù)法[29]。

1.4.8.2 凍干后菌體存活率的計(jì)算

式中，N——凍干菌粉復(fù)溶后的活菌數(shù)，CFU/mL；N0——凍干前菌懸液的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.4.8.3 凍干后菌粉水分含量的測(cè)定 根據(jù)GB 5009.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》[30]方法測(cè)定菌株ZJ2868 凍干菌粉的水分含量。

1.4.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 重復(fù)試驗(yàn)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0 軟件，數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 8.5 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 離心收集最佳條件

表3 顯示離心條件對(duì)菌株ZJ2868 損失率、存活率和收獲率的影響。可以看出菌株ZJ2868 離心存活率最高時(shí)的離心條件為4 000 r/min、10 min，離心存活率達(dá)90.75%。隨著轉(zhuǎn)速提高和離心時(shí)間延長(zhǎng)，菌株ZJ2868 損失率逐漸減小，這可能是由于轉(zhuǎn)速提高和離心時(shí)間延長(zhǎng)使得更多的菌體與發(fā)酵液分離，上清液中菌體殘留量變少，從而降低了損失率。離心收獲率是離心效果的表征，離心收獲率越高，離心效果越好。菌株ZJ2868 離心收獲率與存活率變化趨勢(shì)一致，在4 000 r/min 條件下離心10 min 最高，為90.68%，因此菌株ZJ2868 離心分離的最佳條件為4 000 r/min、10 min。

表2 離心條件對(duì)菌株ZJ2868 損失率、存活率和收獲率的影響Table 2 Effect of the centrifugation condition on the loss rate，survival rate and yield of strain ZJ2868

2.2 谷氨酸鈉濃度對(duì)凍干菌粉存活率的影響

谷氨酸鈉是一種小分子保護(hù)劑，親水性極強(qiáng)，其與菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成的氫鍵代替了周圍的水分子，在蛋白質(zhì)表面形成保護(hù)膜，避免氫鍵聯(lián)結(jié)位置暴露于周圍環(huán)境中，在凍干過(guò)程中保護(hù)菌體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的完整性[31-32]。此外谷氨酸鈉還能防止三?；视偷难趸磻?yīng)和自由基的形成，避免細(xì)胞遭受氧化損傷[33]，因此可以提高菌粉存活率。由圖1 可看出，隨著谷氨酸鈉濃度的增大，菌株ZJ2868 凍干菌粉存活率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在谷氨酸鈉含量為8%時(shí)存活率最高，為64.15%。

圖1 谷氨酸鈉濃度對(duì)凍干菌粉存活率的影響Fig.1 Effect of the monosodium glutamate concentration on the survival rate of freeze-dried strain powder

2.3 脫脂乳濃度對(duì)凍干菌粉存活率的影響

脫脂乳具有良好的低溫保護(hù)作用，是一種應(yīng)用較廣泛、保護(hù)效果較好的冷凍或凍干發(fā)酵劑懸浮液。脫脂乳具有穩(wěn)定的細(xì)胞膜成分和在凍干菌體中形成多孔結(jié)構(gòu)的能力，使凍干的菌粉更易復(fù)水[34]。由圖2 可知，隨著脫脂乳濃度的增加，菌株ZJ2868 凍干菌粉的存活率變化幅度較大。在脫脂乳粉含量為10%時(shí)，對(duì)菌體的保護(hù)效果最佳，使凍干菌粉的存活率達(dá)到最高值51.70%。這是因?yàn)槊撝榉凼怯扇榍宓鞍住⑷樘呛途S生素等組成的混合物，其中的乳清蛋白能夠包裹在細(xì)胞表面形成蛋白保護(hù)膜[35-36]，乳糖能夠抑制細(xì)胞表面形成自由基[19]。這些物質(zhì)均能防止菌體細(xì)胞受到損傷，保證菌體ZJ2868 在凍干過(guò)程中有較高的存活率。

圖2 脫脂乳濃度對(duì)凍干菌粉存活率的影響Fig.2 Effect of the skimmed milk concentration on the survival rate of freeze-dried strain powder

2.4 海藻糖濃度對(duì)凍干菌粉存活率的影響

海藻糖濃度對(duì)菌株ZJ2868 凍干菌粉存活率的影響如圖3所示。在一定的濃度范圍，菌株ZJ2868凍干菌粉存活率隨著海藻糖濃度的增加而明顯提高。在海藻糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%時(shí)，存活率達(dá)到最高值65.5%，這可能是由于海藻糖能夠快速進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)取代水分子來(lái)防止脫水過(guò)程對(duì)生物分子的損傷，同時(shí)它還形成一個(gè)薄的玻璃狀的層，包裹著生物結(jié)構(gòu)，限制了蛋白質(zhì)分子內(nèi)流動(dòng)性，保持了它們的功能[37]，使菌體保持較高的存活率。然而，繼續(xù)提高海藻糖濃度反而不利于菌體的存活，可能是因?yàn)檫^(guò)高濃度的海藻糖會(huì)導(dǎo)致玻璃化結(jié)構(gòu)過(guò)強(qiáng)[38]，影響菌體自身的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其存活率降低。另外，過(guò)高濃度的海藻糖使得成本提高。海藻糖最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。

圖3 海藻糖濃度對(duì)凍干菌粉存活率的影響Fig.3 Effect of the trehalose concentration on the survival rate of freeze-dried strain powder

2.5 凍干保護(hù)劑正交試驗(yàn)結(jié)果

不同組合凍干保護(hù)劑對(duì)菌株ZJ2868 凍干存活率的影響如表3所示，存活率最高的組合為A1B3C3，即5%谷氨酸鈉、14%脫脂乳、15%海藻糖，此條件下凍干存活率為84.11%。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of the orthogonal experiment

對(duì)上述正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析并繪制各因素與指標(biāo)的趨勢(shì)圖，結(jié)果如表4 及圖4所示。

表4 正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment

由表4 可知，脫脂乳對(duì)菌株ZJ2868 凍干存活率的影響最顯著，為主要因素，而谷氨酸鈉和海藻糖對(duì)菌株ZJ2868 凍干存活率的影響不顯著，為次要因素，三者的影響程度排序?yàn)槊撝椋竟劝彼徕c＞海藻糖。

由圖4 可知，凍干保護(hù)劑的最佳組合為A3B3C1，即谷氨酸鈉11%、脫脂乳14%和海藻糖9%，此組合不包含于9 組正交試驗(yàn)內(nèi)。對(duì)組合A3B3C1與組合A1B3C3做驗(yàn)證試驗(yàn)。組合A3B3C1凍干存活率為85.14%，組合A1B3C3凍干存活率為83.24%，組合A3B3C1的保護(hù)效果優(yōu)于A1B3C3，確定菌株ZJ2868 凍干保護(hù)劑的最佳組合為A3B3C1。此條件下菌株ZJ2868 凍干存活率為85.14%。

圖4 因素與指標(biāo)趨勢(shì)圖Fig.4 Trend chart of factors and indicators

2.6 凍干菌粉的水分含量

在上述確定的離心及凍干保護(hù)劑組合條件下，制備菌株ZJ2868 凍干菌粉，測(cè)得其水分含量為3.7%。

2.7 復(fù)水溶劑及時(shí)間對(duì)菌粉存活率的影響

復(fù)水是微生物恢復(fù)活力的關(guān)鍵步驟，受凍干損傷的細(xì)胞如在不適當(dāng)?shù)臈l件下再水化，可能無(wú)法修復(fù)已發(fā)生的損傷[39]。本研究探究3 種復(fù)水溶劑及復(fù)溶時(shí)間對(duì)菌株ZJ2868 凍干菌粉存活率的影響，結(jié)果如圖5所示。復(fù)溶時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)均不利于菌株恢復(fù)活力，菌株復(fù)溶30 min 時(shí)能恢復(fù)最大活力。復(fù)溶時(shí)間過(guò)短，菌體未完全復(fù)蘇；復(fù)溶時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌體雖復(fù)蘇完全但營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏而導(dǎo)致部分菌體衰亡。菌株ZJ2868 在不同復(fù)水溶劑中的復(fù)蘇能力也不同，在原保護(hù)介質(zhì)中的復(fù)蘇能力最強(qiáng)。Lee 等[34]也發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌JH287 在原保護(hù)介質(zhì)中的復(fù)活能力最強(qiáng)。菌株ZJ2868 凍干菌粉在原保護(hù)介質(zhì)中復(fù)溶30 min 后的活菌數(shù)為2.90×109CFU/mL，存活率達(dá)最大值85.4%。

圖5 復(fù)水溶劑及時(shí)間對(duì)凍干菌粉存活率的影響Fig.5 Effect of rehydration solvent and time on the survival rate of freeze-dried strain powder

2.8 貯藏時(shí)間和溫度對(duì)菌粉存活率的影響

貯藏時(shí)間和溫度對(duì)菌株ZJ2868 凍干存活率的影響如圖6所示。菌株ZJ2868 凍干菌粉的存活率隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。在常溫條件下貯藏的菌粉的活力下降更快。在常溫和4 ℃條件下貯藏1 個(gè)月后，菌株ZJ2868 凍干菌粉的存活率分別為49.78%和63.95%。4 ℃條件貯藏的菌粉穩(wěn)定性較優(yōu)。Amine 等[37]發(fā)現(xiàn)微生物在較低的溫度下更易存活。Capela 等[38]發(fā)現(xiàn)凍干后微生物細(xì)胞的活力主要取決于貯藏溫度，低溫有利于保持菌體活力。常溫保藏的菌粉細(xì)胞內(nèi)的水活躍，遷移頻繁，易導(dǎo)致生存能力的喪失[39]。綜上，菌株ZJ2868 凍干菌粉在4 ℃條件下具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

圖6 貯藏時(shí)間和溫度對(duì)凍干菌粉存活率的影響Fig.6 Effect of storage time and temperature on the survival rate of freeze-dried strain powder

3 結(jié)論

本文對(duì)植物乳桿菌ZJ2868 菌粉制備的離心條件、保護(hù)劑配方、菌粉復(fù)溶條件以及菌粉貯藏穩(wěn)定性進(jìn)行研究，確定了菌體收集的最佳離心條件為4 000 r/min、10 min，最佳凍干保護(hù)劑配方為谷氨酸鈉11%、脫脂乳14%、海藻糖9.0%，最佳復(fù)溶條件為在原保護(hù)介質(zhì)中復(fù)溶30 min，最佳貯藏溫度4 ℃。制得的植物乳桿菌ZJ2868 凍干菌粉的活菌數(shù)為2.90×109CFU/mL，存活率達(dá)85.40%，水分含量為3.7%。