姚 雪，劉 爍，俞宛君，陶澤華，蔣雅斕，陳少聃，冉銀宏，夏 圣

江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，江蘇 鎮(zhèn)江 212013

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種好發(fā)于育齡期婦女的內(nèi)分泌紊亂疾?。?］。近年來的研究結(jié)果提示，PCOS 的發(fā)生發(fā)展與慢性炎癥也密切相關(guān)［2］。干擾素（interferon，IFN）?γ是一種炎性細(xì)胞因子，在卵泡發(fā)育過程中主要分布在顆粒細(xì)胞（granular cells，GC）和卵母細(xì)胞中。顆粒細(xì)胞的增殖、分化在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著十分重要的作用，而顆粒細(xì)胞的大量凋亡會(huì)影響卵泡細(xì)胞的正常發(fā)育、成熟，進(jìn)而導(dǎo)致疾病產(chǎn)生［3］。本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，IFN?γ作用48 h后可明顯抑制人卵巢顆粒細(xì)胞KGN 的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但具體機(jī)制尚未探明［4］。二甲雙胍（Metformin，Met）是一種胰島素增敏劑，臨床上主要用于治療2型糖尿?。?］。近年來的一些研究發(fā)現(xiàn)，除降低血糖外，Met還可通過降低促炎因子表達(dá)水平、激活腺苷酸活化蛋白激酶途徑、抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白合成通路、抑制氧化應(yīng)激等機(jī)制發(fā)揮抗炎作用［6］。但目前對(duì)于Met能否改善炎癥因子導(dǎo)致的卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)胞功能損傷尚不清楚。本研究旨在探討Met對(duì)IFN?γ誘導(dǎo)的KGN細(xì)胞功能損傷的潛在保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株人卵巢顆粒細(xì)胞KGN細(xì)胞（上海江林生物科技有限公司）；IFN?γ（上海達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）；Met（Sigma?Aldrich 公司，美國(guó)）；CCK?8檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物公司）；細(xì)胞周期試劑盒（上海前塵生物科技有限公司）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）；TRIzol RNA 提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑和Real Time PCR 試劑（TaKaRa公司，日本）；DMEM（上海源培生物公司）；胎牛血清（Nobimpex 公司，德國(guó)）；青霉素、鏈霉素和胰酶（Sig?ma?Aldrich 公司，美國(guó)）。細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo 公司，美國(guó)）；生物安全柜（青島海爾生物醫(yī)療公司）；倒置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；超高速低溫離心機(jī)（Beckman Coulter 公司，美國(guó)）；酶標(biāo)儀（Rayto 公司，美國(guó)）；流式細(xì)胞儀CytoFLEX（Beckman Coulter公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢顆粒細(xì)胞KGN 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，并加入終濃度為100 U/mL的青霉素和鏈霉素，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每48 h換1次新鮮培養(yǎng)液。

1.2.2 CCK?8法檢測(cè)KGN細(xì)胞活力

實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、IFN?γ處理組、Met 低/中/高濃度梯度組、IFN?γ與Met 低/中/高濃度梯度共處理組。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KGN 細(xì)胞，用胰酶常規(guī)消化，將KGN細(xì)胞按3×103個(gè)/孔，接種至96孔板，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱過夜預(yù)培養(yǎng)。第2天對(duì)照組常規(guī)換液，各處理組則根據(jù)分組要求，分別加入含IFN?γ（250 ng/mL）和Met（1、10、100 μmol/L）的細(xì)胞培養(yǎng)液。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱，分別培養(yǎng)24、48 和72 h 后，每孔加入10 μL CCK?8 反應(yīng)試劑，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱孵育1 h后，酶標(biāo)儀于450 nm檢測(cè)各孔吸光度。本實(shí)驗(yàn)中Met 的濃度梯度參考以往的文獻(xiàn)［7-8］設(shè)置。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期KGN 細(xì)胞，胰酶常規(guī)消化后以6×104個(gè)/孔培養(yǎng)于6 孔板內(nèi)，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，預(yù)培養(yǎng)1～2 d；各處理組中分別加入相應(yīng)濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液，處理KGN 細(xì)胞48 h 后，用不含EDTA 的胰酶消化收集細(xì)胞，并用預(yù)冷的PBS 洗滌2 遍。用標(biāo)記細(xì)胞凋亡的結(jié)合緩沖液調(diào)節(jié)KGN 細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL。在100 μL細(xì)胞懸液中加入1 μL Annexin V?APC和2 μL 7?AAD；混勻，室溫避光孵育15 min。用結(jié)合緩沖液洗去未結(jié)合抗體，再用200 μL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè)

各處理組中分別加入相應(yīng)濃度的細(xì)胞培養(yǎng)液處理KGN細(xì)胞72 h后，收集細(xì)胞并用預(yù)冷的PBS洗滌2 遍；加入2 mL 70%預(yù)冷乙醇固定細(xì)胞，輕輕混勻，4 ℃過夜；離心去除固定液，用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞2～3 次，離心，棄上清；按照細(xì)胞周期試劑盒說明書，分別加入100 μL 試劑A（胰蛋白酶等），輕輕混勻，室溫放置10 min；加入100 μL 試劑B（RNA酶、胰酶抑制劑等）輕輕混勻，室溫放置10 min；加入150 μL 試劑C（碘化丙啶等）輕輕混勻，室溫放置15 min。上機(jī)前用300 目尼龍篩網(wǎng)過濾細(xì)胞液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.5 q?PCR檢測(cè)細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白CDKN1A mRNA的表達(dá)

TRIzol法提取各處理組的KGN 細(xì)胞總RNA，按照日本TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-20 ℃保存。以β?actin 為內(nèi)參基因，qRT?PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：2×TB Green Master Mix 10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，無菌蒸餾水7.2 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)。RNA 引物由上海生工生物工程有限公司合成。β?actin：正義5′?TCTGGCACCA?CACCTTCTA?3′，反義5′?AGGCATACAGGGACAG?CAC?3′；CDKN1A：正義5′?CTCATCCCGTGTTC?TCCTTT?3′，反義5′?GTACCAC?CCAGCGGACAAGT?3′。通過公式2-ΔΔCT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果來自至少3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Met可提高IFN?γ誘導(dǎo)損傷的KGN細(xì)胞活力

CCK?8結(jié)果（圖1）顯示，與對(duì)照組相比，各處理組細(xì)胞在培養(yǎng)24 h 及72 h 后，除IFN?γ處理組細(xì)胞活力受到抑制（P<0.05）外，其他組未見明顯變化。而培養(yǎng)48 h后，IFN?γ處理組細(xì)胞活力受到明顯抑制（P<0.01，圖1）；低、中、高濃度的Met 單獨(dú)處理對(duì)KGN 活力均無明顯影響，但Met與IFN?γ共同作用可減緩IFN?γ對(duì)KGN 細(xì)胞活力的抑制。其中，以中濃度Met 處理組（10 μmol/L）的緩解效應(yīng)最為明顯（P<0.01，圖1），故后續(xù)試驗(yàn)均采用此藥物濃度和處理時(shí)間。

圖1 CCK?8檢測(cè)不同處理對(duì)KGN細(xì)胞活力的影響Figure 1 The effects of different treatments on KGN cells viability detected by CCK?8

2.2 Met可改善IFN?γ對(duì)KGN細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響

顯微鏡下觀察各處理細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)（圖2），可見IFN?γ作用48 h后可使細(xì)胞增殖的速度和密度明顯降低，且部分細(xì)胞皺縮、變圓。Met單獨(dú)處理對(duì)KGN細(xì)胞的增殖效應(yīng)無明顯影響；但Met與IFN?γ共同作用則在一定程度上改善了被IFN?γ抑制的細(xì)胞增殖。

圖2 不同處理對(duì)KGN細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響（×40）Figure 2 The effects of different treatments on the growth of KGN cells（×40）

2.3 Met可減輕IFN?γ對(duì)KGN細(xì)胞凋亡的損傷

各處理組對(duì)KGN細(xì)胞處理48 h后，流式分析結(jié)果顯示，對(duì)照組與Met 處理組的細(xì)胞凋亡比例統(tǒng)計(jì)分析無顯著差異（P>0.05）。而IFN?γ處理后，細(xì)胞凋亡比例與對(duì)照組相比差異明顯（P<0.01）。同時(shí)，Met+IFN?γ處理組細(xì)胞凋亡比例與單獨(dú)IFN?γ處理組相比明顯降低（P<0.05，圖3）。以上結(jié)果表明，Met可減輕IFN?γ對(duì)KGN 細(xì)胞凋亡的損傷。

圖3 流式檢測(cè)不同處理對(duì)KGN細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 The effects of different treatments on KGN cells apoptosis detected by flow cytometry

2.4 Met可緩解IFN?γ對(duì)KGN的細(xì)胞周期阻滯

流式分析時(shí)，先對(duì)KGN 細(xì)胞設(shè)門，去除細(xì)胞碎片；再對(duì)細(xì)胞周期分析的單細(xì)胞群體設(shè)門，去除黏連細(xì)胞，繼而分析單細(xì)胞中處于各細(xì)胞周期的細(xì)胞比例。結(jié)果顯示（圖4），與對(duì)照組G0?G1期（54.432±2.526）、S 期（31.732±1.965）、G2?M 期（13.637±1.816）相比，Met處理組的各周期細(xì)胞比例均無明顯變化；而與對(duì)照組相比，IFN?γ處理組G0?G1 期細(xì)胞比例（76.673±2.432）明顯增加（P<0.01），S 期比例（12.137±1.586）下降（P<0.05），G2?M 期比例（11.276±1.398）也稍有下降但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而與IFN?γ處理組相比，Met+IFN?γ處理組G0?G1 期細(xì)胞比例（71.152±1.861）下降，且S 期比例（19.572±1.615）升高，二者結(jié)果間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。以上結(jié)果提示Met可緩解IFN?γ對(duì)KGN細(xì)胞由G0?G1期進(jìn)入的S期阻滯效應(yīng)。

圖4 不同處理對(duì)KGN細(xì)胞周期分布的影響Figure 4 Effects of different treatments on the cell cycle distribution of KGN

2.5 Met對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控與CDKN1A下調(diào)有關(guān)

利用q?PCR法檢測(cè)各處理組CDKN1A mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，IFN?γ處理可使KGN細(xì)胞的CDKN1A的mRNA 表達(dá)上調(diào)約5 倍，說明IFN?γ誘導(dǎo)的KGN G0?G1 期阻滯可能與CDKN1A 異常上調(diào)有關(guān)。當(dāng)用Met 處理后，Met 可在一定程度上降低IFN?γ對(duì)CDKN1A 的誘導(dǎo)表達(dá)（P<0.05，圖5）。此結(jié)果提示，Met 可能是通過下調(diào)IFN?γ誘導(dǎo)的CDKN1A 異常表達(dá)，從而減輕了IFN?γ引起的KGN 細(xì)胞G0?G1 周期阻滯。

圖5 細(xì)胞周期復(fù)性調(diào)節(jié)蛋白CDKN1A mRNA的表達(dá)Figure 5 The mRNA expression of cell cycle refolding reg?ulatory protein CDKN1A

3 討論

PCOS 是一種與異常卵泡增生相關(guān)的內(nèi)分泌紊亂疾病，GC的增殖受抑被認(rèn)為是異常卵泡成熟的關(guān)鍵因素［9］。既往研究表明，IFN?γ是卵泡閉鎖的重要生理性調(diào)節(jié)因子，在卵泡發(fā)育早期未分化顆粒細(xì)胞Fas受體表達(dá)以及隨后的凋亡反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用［3］。此外，基于其細(xì)胞抑制、抗增殖和促凋亡效應(yīng)，IFN?γ被認(rèn)為可應(yīng)用于多種類型癌癥的輔助免疫治療［10-11］。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCOS患者外周血中IFN?γ的含量較健康人明顯增多，且IFN?γ體外作用于人卵巢顆粒細(xì)胞KGN 可明顯抑制其增殖并促進(jìn)凋亡；表明炎癥因子IFN?γ可能是PCOS中導(dǎo)致KGN細(xì)胞功能損傷的重要因素之一［4］。

Met是一種常規(guī)降糖藥，可作為胰島素增敏劑，降低高胰島素血癥并抑制女性卵巢中過多雄激素的產(chǎn)生［12］。此外，在PCOS 大鼠模型中，Met 已被證明可抑制卵泡膜細(xì)胞增殖、減少小卵泡和囊腫的數(shù)量，進(jìn)而提高排卵率［13］。最近有研究發(fā)現(xiàn)Met 可通過有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OCTs 誘導(dǎo)大鼠卵巢細(xì)胞AMPK 磷酸化并減少血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF 的產(chǎn)生［8］。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示Met單獨(dú)作用對(duì)KGN細(xì)胞增殖、凋亡等功能無明顯影響，原因可能是本實(shí)驗(yàn)使用的Met 的濃度較低，也可能是實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株與其他研究來源不同。但本研究發(fā)現(xiàn)Met 與IFN?γ共同作用可提高損傷的KGN的細(xì)胞活力，緩解IFN?γ引起的細(xì)胞凋亡及G0?G1 周期阻滯，提示Met 可減輕IFN?γ誘導(dǎo)的KGN 細(xì)胞功能損傷。但Met 能否改善人卵巢顆粒細(xì)胞KGN的其他生物學(xué)行為，如細(xì)胞代謝，激素分泌及凋亡相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等還需進(jìn)一步探究。

細(xì)胞功能紊亂常與細(xì)胞周期失調(diào)相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，Met可通過不同作用方式調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖［14-15］。其中，Met可通過下調(diào)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1的表達(dá)和端粒酶活性阻斷G0/G1細(xì)胞周期，抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長(zhǎng)［16］。因此猜測(cè)，Met 可能是通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞功能。P21 基因是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族中的重要成員，可通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物（cyclin?dependent kinases，CDKs）活性，協(xié)調(diào)細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制與修復(fù)之間的關(guān)系。其中，CDKN1A是細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子p21 的編碼基因，p21 的過度表達(dá)常提示細(xì)胞周期阻滯［17］。CDKN1A除了在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮作用外，還參與了細(xì)胞分化、凋亡、自噬和衰老等過程［18］。本研究結(jié)果顯示，IFN?γ處理將KGN的CDKN1A表達(dá)上調(diào)了約5 倍。Met與IFN?γ的聯(lián)合處理可降低CDKN1A 的異常表達(dá)且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CDKN1A 下調(diào)可能與Met一定程度上緩解了IFN?γ引起的KGN 細(xì)胞G0?G1周期阻滯相關(guān)，但其緩解周期阻滯的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究證實(shí)Met 可通過抑制細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白CDKN1A 表達(dá)的異常上調(diào)，緩解IFN?γ引起的KGN 細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮保護(hù)作用，可為指導(dǎo)PCOS 患者的臨床用藥提供新的視角。