孔桂萍，劉志峰，金 玉，鄭必霞，閆坤龍*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院消化科，2兒科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210008

Rubinstein?Taybi 綜合征（Rubinstein?Taybi syn?drome，RSTS）是一種非常罕見的常染色體顯性遺傳病，1963 年由Jack Rubinstein 和Hooting Taybi 首次報(bào)道［1］，發(fā)病率約為1∶125 000［2］。該病主要表現(xiàn)為智力低下、生長(zhǎng)發(fā)育落后，寬而扁的拇指及第一腳趾以及特殊面容，包括高眉弓、長(zhǎng)睫毛、眼裂下斜、鉤狀鼻、小下顎等［3］。本文對(duì)臨床上高度懷疑該綜合征的1例患兒采用二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行相關(guān)基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CREBBP基因突變后，用Sanger測(cè)序法驗(yàn)證患兒父母是否有該類型突變，并對(duì)臨床表現(xiàn)和基因型進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 病例資料

患兒，男，4月齡，2014年11月因“發(fā)熱4 d，咳嗽3 d”于我院就診?；純簽镚1P1，41周順產(chǎn)娩出，生時(shí)羊水清亮，新生兒Apgar評(píng)分9分，出生體重3.3 kg，身長(zhǎng)47 cm。出生即發(fā)現(xiàn)頭發(fā)、眉毛、睫毛黑而濃密，寬而扁的拇指。生后體重增長(zhǎng)慢，目前不能注視追人和與人眼神交流，不能抬頭，雙手不會(huì)主動(dòng)拿物。父母體健，非近親婚配。否認(rèn)家族中有類似疾病患者。既往因先天性隔疝、反復(fù)肺部感染多次住院治療，每次感染后血象均增高明顯［白細(xì)胞（19～35）×10-9/L］。

入院查體：體溫37.2 ℃，脈搏132 次/min，呼吸42次/min，體重7 kg，身高58 cm（低于正常同齡男童參考值第3百分位點(diǎn)），上部量36 cm，下部量22 cm，指間距49 cm，頭圍36.5 cm（低于正常同齡男童參考值第3百分位點(diǎn)），前囟平軟1.5 cm×1.5 cm。頭發(fā)濃密，發(fā)絲粗黑，質(zhì)硬，前后發(fā)際低，眉毛粗長(zhǎng)，色黑，高拱形眉弓；雙內(nèi)眥贅皮，雙眼裂下斜，鼻外形正常；口唇紅潤(rùn)，腭弓高，牙齒未萌出。耳位低。心肺檢查未見異常，腹部稍膨隆，肝臟肋下2 cm，質(zhì)軟，脾臟肋下未觸及。雙手無(wú)通貫掌，雙拇指及拇趾寬；陰莖發(fā)育正常，雙側(cè)睪丸觸及。肌力及肌張力偏低，胸骨、肋骨和脊柱正常，病理征未引出（圖1）。入院診斷為：支氣管肺炎、先天性隔疝、精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲滯。頭顱CT、MRI、體液免疫、細(xì)胞免疫、血氨基酸及尿有機(jī)酸代謝篩查均無(wú)明顯異常。

圖1 患兒臨床表現(xiàn)

5 月齡時(shí)（2014 年12 月）因先天性隔疝于我院胸外科行隔疝修補(bǔ)術(shù)。7月齡時(shí)行智能發(fā)育量表評(píng)分，智力發(fā)育指數(shù)（MDI）、運(yùn)動(dòng)發(fā)育指數(shù)（PDI）均<50，評(píng)價(jià)相當(dāng)于4.4月齡。

征得父母知情同意后，取患兒及其父母外周靜脈抗凝血2 mL，基因全外顯子測(cè)序由北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心協(xié)助完成。使用BloodGen Midi Kit（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）提取患者全基因組DNA，構(gòu)建文庫(kù)，應(yīng)用Illumina Hiseq XTen 平臺(tái)對(duì)全基因組進(jìn)行高通量測(cè)序，利用Illumina 官方basecall 分析軟件BclToFastq 得到原始數(shù)據(jù)（raw data）。測(cè)序數(shù)據(jù)運(yùn)用BWA 軟件與UCSC 數(shù)據(jù)庫(kù)提供的人類基因組hg19 參考序列進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)測(cè)序深度，突變質(zhì)量，對(duì)檢測(cè)得到的單核苷酸多態(tài)性（SNP），插入或缺失（InDel）進(jìn)行過濾篩選，得到高質(zhì)量可靠的突變。使用SIFT利用基于同源比對(duì)，蛋白結(jié)構(gòu)的保守性等的算法，預(yù)測(cè)篩選出的變異對(duì)蛋白質(zhì)的影響。對(duì)明確或可能與受檢者臨床表型相關(guān)的基因突變，采用一代測(cè)序（Sanger法）驗(yàn)證。

經(jīng)過測(cè)序，患兒存在CREBBP基因27號(hào)外顯子上的復(fù)雜移碼突變：c.4499至c.4493缺失TGCAGTC插入AAGCA（圖2）。該突變?cè)谇藬?shù)據(jù)庫(kù)、dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)及hapmap 數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有查到相關(guān)記載，缺失/插入突變的致病性明確，根據(jù)氨基酸的保守性、公共數(shù)據(jù)庫(kù)資料和患兒典型臨床表現(xiàn)，定義為致病突變，最終診斷為RSTS。其父母標(biāo)本檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)有該基因位點(diǎn)的突變，患兒為de novo變異。

圖2 基因測(cè)序圖

2 討論

作為多系統(tǒng)疾病，RSTS 的主要特征為3 類：顱面畸形、骨骼畸形以及生長(zhǎng)和精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲滯。此外，還可伴發(fā)其他表現(xiàn)，如眼瞼下垂、白內(nèi)障、青光眼，先天性心臟疾病，泌尿系統(tǒng)畸形、多毛、前額紅斑、瘢痕皮膚、惡性腫瘤等［3-4］。嬰兒期開始出現(xiàn)明顯生長(zhǎng)發(fā)育落后，通常低于同齡兒童參考值第15百分位水平。智商平均在35～50 分，但也有智商在正常低限的報(bào)道［5］。后期易出現(xiàn)注意力集中時(shí)間短、運(yùn)動(dòng)刻板印象、協(xié)調(diào)性差等行為異常［6］，青春期會(huì)有焦慮，情緒不穩(wěn)和攻擊性行為等［3］。超過90%的病例可以存活到成年［7］。本文所述病例存在生長(zhǎng)和精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后、寬而扁的拇指和第一腳趾、特殊面容、多毛等表現(xiàn)，與RSTS 高度相符。該患兒同時(shí)還存在先天性隔疝，為該病的首次發(fā)現(xiàn)。

目前認(rèn)為，55%～70%的RSTS 病例來(lái)源于CREBBP基因突變［8］，5%～8%源于EP300 基因突變［5］，其余病例原因尚未明確［9］。CREBBP 基因位于染色體16p13.3，其同源物EP300位于染色體22q13.2，兩者均由相等數(shù)量的外顯子（31）組成。RSTS 發(fā)病機(jī)制尚不明確，已知CREBBP廣泛表達(dá)，具有固有的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）活性，可作為支架通過染色質(zhì)重塑來(lái)穩(wěn)定與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的其他蛋白質(zhì)相互作用，從而調(diào)節(jié)許多影響細(xì)胞途徑的基因表達(dá)［10］。CREBBP 變異可能導(dǎo)致CREB 結(jié)合蛋白被截短或被氨基酸取代，HAT 結(jié)構(gòu)域中的致病變異會(huì)干擾組蛋白的乙?；?，這是轉(zhuǎn)錄激活的重要步驟。EP300 編碼p300 轉(zhuǎn)錄激活蛋白，該蛋白與CREBBP 在氨基酸水平上具有63%的同源性，起HAT 的作用，通過染色質(zhì)重塑調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，并在細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用。致病性變體導(dǎo)致P300 蛋白被截?cái)嗷虻任换虮磉_(dá)消失，這可能導(dǎo)致HAT 活性喪失［3-5］。本文所述病例發(fā)現(xiàn)CRBBP基因中一處新的移碼突變，為首次報(bào)道，推測(cè)患兒存在先天性膈疝可能與該新變異位點(diǎn)有關(guān)，但兩者關(guān)系仍有待進(jìn)一步深入研究探討。

CREBBP 的突變譜由點(diǎn)變異（30%～50%）和缺失（～10%）組成［9］，EP300 突變患者表型被認(rèn)為比CREBBP 突變的先證者要輕［5］。本例患兒為CREBBP基因復(fù)雜移碼突變，臨床表現(xiàn)典型，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。由于具有高度變異性，迄今為止，有關(guān)RSTS基因型與臨床表現(xiàn)的關(guān)系尚無(wú)定論。

大多數(shù)RSTS病例報(bào)道為新發(fā)突變引起，僅有少數(shù)影響同胞的相關(guān)報(bào)道，垂直傳輸亦極為罕見［3］。如果先證者的父母受到影響和/或已知在先證者中鑒定出CREBBP 或EP300 致病變異，則同胞的風(fēng)險(xiǎn)為50%［7］。一旦確定了引起RSTS 的致病變體，就可以進(jìn)行產(chǎn)前檢測(cè)，雖然該病再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)通常較低，但適當(dāng)?shù)倪z傳咨詢對(duì)于產(chǎn)前診斷還是必要的。

本例基因變異位點(diǎn)在國(guó)內(nèi)外屬首次發(fā)現(xiàn)，臨床表現(xiàn)伴有先天性隔疝亦屬首次報(bào)道。RSTS 作為一種極為罕見、復(fù)雜的疾病，雖然已經(jīng)明確了一些臨床特征，但目前仍然存在許多未解決的問題，仍需要進(jìn)行多中心研究，包括新生兒至成年階段，以擴(kuò)大對(duì)臨床表型的認(rèn)識(shí)，確定不同基因型與表型的相關(guān)性，從而有助于早期識(shí)別診斷，及時(shí)干預(yù)。