胡穎超，楊 碩

南京醫(yī)科大學免疫學系，江蘇 南京 211166

1 前言

細胞死亡是一種包括動物、植物和真菌在內(nèi)的多細胞生物必不可少的生物學過程，有助于機體清除受損或多余的細胞，在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、幫助胚胎發(fā)育和提高宿主防御功能等方面具有重大意義。細胞焦亡作為一種程序性細胞死亡方式，其特征在于由Gasdermin 家族蛋白介導細胞孔洞形成，引起細胞腫脹破裂，釋放白介素（IL）?1β、IL?18、HMGB1 等炎癥介質(zhì)，促進炎癥反應。越來越多的報道證明細胞焦亡在多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，因此理解細胞焦亡的特征、分子機制及其與炎癥疾病的關系對于尋找靶向治療藥物具有重要意義。

2 細胞焦亡的發(fā)現(xiàn)和定義

1997 年，Hilbi等［1］發(fā)現(xiàn)志賀菌感染巨噬細胞引起的細胞死亡依賴Caspase?1 蛋白酶活性。2000年，Brennan 等［2］發(fā)現(xiàn)沙門氏菌感染宿主細胞也能引發(fā)Caspase?1依賴的細胞死亡，這種細胞死亡方式與細胞凋亡的特征不同，過程不伴有Caspase?3 的活化，但有胞膜的破壞。2001 年，邁阿密大學醫(yī)學院教授Boise等［3］采用希臘語“Pyroptosis”命名這種Caspase?1依賴的細胞死亡方式，“Pyro”意為“火”，表明細胞焦亡能夠引發(fā)炎癥反應，“ptosis”是落下的意思，表明細胞程序性死亡的本質(zhì)。之后很長一段時間內(nèi)，細胞焦亡被認為是只依賴Caspase?1 活性的細胞死亡方式，直到2011 年，有研究發(fā)現(xiàn)小鼠Caspase?11 能夠以不依賴Caspase?1的方式感知病原菌感染，進而引起細胞焦亡［4］。2014 年，邵峰等［5］報道胞質(zhì)內(nèi)Caspase?4/5/11 能夠作為感受器直接結合革蘭陰性菌表面LPS，介導非經(jīng)典途徑的細胞焦亡。2015年，有研究發(fā)現(xiàn)Caspase?1/11 的底物GSDMD 是介導細胞焦亡的關鍵執(zhí)行分子［6?8］。2017年，Wang等［9］發(fā)現(xiàn)Caspase?3能夠識別切割Gasdermin家族的另一成員GSDME分子，形成的N端片段也能夠介導細胞焦亡發(fā)生。2018 年，Egil Lien 團隊在Science發(fā)文報道了耶爾森菌感染能夠引起宿主細胞Caspase?8 活性依賴的細胞焦亡［10］。2018 年，Kambara 等［11］發(fā)現(xiàn)中性粒細胞絲氨酸蛋白酶ELANE能夠以不依賴Caspase?1/11 的方式切割GSDMD，引發(fā)中性粒細胞焦亡。因此，這些研究成果表明細胞焦亡發(fā)生并不由Caspase 酶決定，而是由其識別水解的底物Gasder?min 家族蛋白決定。至此，細胞焦亡的定義由之前的“Caspase?1/11 切割Gasdermin 家族蛋白引起焦亡”逐漸完善成“一種依賴于Gasdermin 家族蛋白成孔毒性的細胞死亡，經(jīng)常但不總因Caspase 的活化而完成”［12］。

3 細胞凋亡、細胞壞死和細胞焦亡

細胞凋亡、細胞壞死和細胞焦亡3 大程序性死亡方式具有特定的形態(tài)變化和激活機制，并且相互之間的信號轉(zhuǎn)導也具有一定的聯(lián)系。

3.1 細胞凋亡

細胞凋亡在生理病理情況下都能發(fā)生，過程不伴有炎癥介質(zhì)釋放，因而不能引發(fā)炎癥反應。凋亡細胞不斷皺縮，細胞核在核膜處斷裂，形成核碎片，然后整個細胞通過發(fā)芽、起泡等方式形成凋亡小體。Caspase蛋白酶是引發(fā)細胞凋亡的關鍵蛋白，參與凋亡的蛋白酶包括Caspase?2/3/6/7/8/9/10 等，在細胞凋亡發(fā)生時，凋亡Caspase 通過內(nèi)源性凋亡途徑和外源性凋亡途徑介導凋亡信號。

3.2 細胞壞死

細胞壞死是細胞腫脹破裂的死亡形式之一，壞死細胞的細胞核和線粒體等細胞器變形腫脹，膜通透性增高，最后質(zhì)膜破裂，胞內(nèi)容物釋放到胞外。細胞內(nèi)容物中含有各種促炎分子，因此細胞壞死能夠引發(fā)炎癥反應。細胞壞死受到級聯(lián)信號分子的調(diào)控，在壞死發(fā)生時，受體相互作用蛋白激酶1/3（receptor interacting protein kinase 1，RIPK1/3）磷酸化激活混合系激酶區(qū)域樣蛋白（mixed lineage ki?nase domain like protein，MLKL），后者插入質(zhì)膜，形成孔洞，導致細胞內(nèi)容物釋放。

3.3 細胞焦亡

細胞焦亡在形態(tài)學上兼具凋亡和壞死的部分特點。細胞焦亡發(fā)生后細胞核的特征變化與凋亡類似，如核皺縮，染色質(zhì)DNA 斷裂降解。在焦亡早期，細胞膜上出現(xiàn)眾多孔洞，引起細胞滲透性腫脹，焦亡后期，腫脹的細胞最終崩解，釋放出大量細胞炎性內(nèi)容物，快速激發(fā)機體炎癥反應。細胞焦亡是由Gasdermin 家族蛋白激活后釋放的N端片段通過寡聚并易位插入胞膜形成孔洞介導發(fā)生。

3.4 三者相互關系

焦亡和凋亡信號通路存在交叉影響。凋亡執(zhí)行蛋白Caspase?3 能夠在87 位天冬氨酸切割GSD?MD，形成的短N 端片段沒有孔洞形成能力，阻止了細胞焦亡的發(fā)生，而在GSDMD 缺失情況下，焦亡的信號刺激能夠使細胞發(fā)生Caspase?1 介導的細胞凋亡［13-14］?；熕幬锬軌蚣せ钅承┠[瘤細胞的Cas?pase?3，繼而活化GSDME，引發(fā)細胞焦亡［9］。活化的Caspase?8 能夠抑制RIPK3 介導的細胞壞死途徑從而促進細胞凋亡的發(fā)生，而Caspase?8的酶活性受到抑制時，RIPK1、RIPK3 和MLKL 發(fā)生級聯(lián)反應執(zhí)行了不依賴Caspase的細胞壞死［15］。另外，活化的Cas?pase?8能夠剪切激活GSDMD，誘發(fā)細胞焦亡［10］。因而，Caspase?8在細胞凋亡、細胞壞死和細胞焦亡3種死亡方式中起到了分子開關作用。

4 Gasdermin家族蛋白

Gasdermin 家族蛋白是細胞焦亡的關鍵執(zhí)行者。根據(jù)序列同源性目前已鑒定的人源Gasdermin家族成員包括GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME（DFNA5）和PJVK（DFNB59）。鼠源Gasder?min家族成員缺乏GSDMB，另外GSDMA具有3種同系物（GSDMA1～3），GSDMC 具有4 種同系物（GSD?MC1～4）。

4.1 GSDMA

人源GSDMA 的表達范圍較為廣泛，在皮膚、食道、胃、乳腺和臍帶的上皮細胞中均有表達，而鼠源GSDMA 3個亞類的表達分布也略有區(qū)別，其中GSDMA1 主要表達在毛囊和胃；GSDMA2 主要表達在胃；GSDMA3主要表達在皮膚。

已發(fā)現(xiàn)鼠源GSDMA3共有9個自發(fā)突變與小鼠嚴重的皮膚炎癥和皮膚干細胞耗竭相關［6］。另有報道，GSDMA3 突變小鼠的乳腺發(fā)育也存在缺陷［16］。在人類中，GSDMA的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與哮喘有關，但GSDMA促成哮喘的機制仍不清楚［17］。

4.2 GSDMB

GSDMB在食道、皮膚、胃、肝臟和結腸上皮中都有表達。研究表明，GSDMB 與克羅恩病、潰瘍性結腸炎和哮喘的發(fā)病存在相關性［18］。GSDMB 在多種人類腫瘤組織中高表達，包括乳腺癌、胃癌、肝癌、結腸癌、子宮癌、食道癌、胃癌和宮頸癌以及衍生的腫瘤細胞系等，提示GSDMB 在腫瘤發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［19］。

4.3 GSDMC

人源GSDMC 主要表達在食道、胃、腸、氣管、脾臟、膀胱和皮膚等組織器官，鼠源GSDMC 主要在皮膚、食道、腸道、胃、膀胱等部位分布。

研究顯示皮膚角質(zhì)形成細胞中GSDMC 的表達在紫外線照射引起的皮膚損傷過程發(fā)揮重要作用［20］。另外，GSDMC 上調(diào)表達也是預測肺腺癌預后不良的重要指標［21］。然而，最近Hou 等［22］報道抗生素類化療藥物能夠促進GSDMC 的剪切激活進而誘導腫瘤細胞焦亡發(fā)生。

4.4 GSDMD

GSDMD 在人和哺乳動物的不同組織和細胞中廣譜表達，其中人源GSDMD 在免疫細胞表達豐度最高，鼠源GSDMD 主要分布在免疫細胞和腸道上皮細胞。GSDMD 介導的細胞焦亡有助于機體清除病原，促進損傷修復，維持穩(wěn)態(tài)，但另一方面，不受控制的細胞焦亡能夠造成組織病理損傷，與多種疾病，如膿毒血癥、炎癥性腸病、動脈粥樣硬化以及自身炎癥性疾病等的發(fā)生密切相關。

GSDMD與膿毒血癥：病原微生物感染能夠激活炎性Caspase?1/4/5/11，啟動GSDMD 依賴的經(jīng)典和非經(jīng)典途徑細胞焦亡，促使炎癥介質(zhì)的釋放，進而擴大炎癥反應。研究表明GSDMD 基因敲除小鼠能夠明顯抵抗病原菌感染引起的炎癥因子風暴，延長生存時間［7］。

GSDMD 與炎癥性腸?。河醒芯匡@示，腸道上皮細胞發(fā)生GSDMD 激活介導的細胞焦亡，阻礙了病原菌對腸道的侵襲，并通過釋放IL?18 促進上皮細胞修復、腸道黏膜免疫和抗菌肽的形成，進而起到保護腸道的作用［23］。也有報道，結腸巨噬細胞中的GS?DMD可抑制cGAS?STING信號通路激活介導的炎癥反應，從而緩解DSS誘導的小鼠結腸炎癥狀［24］。

GSDMD與動脈粥樣硬化：血脂異常和炎性環(huán)境中的炎癥介質(zhì)能夠觸發(fā)內(nèi)皮細胞Caspase?1 依賴的炎癥小體激活，引發(fā)細胞焦亡，進而擴大炎癥反應造成血管損傷。另外，內(nèi)皮細胞炎性死亡引起血管收縮反應受損，并通過誘導血管黏附分子的產(chǎn)生進一步促進血管炎癥［25］。

GSDMD 與自身炎癥性疾?。篏SDMD 介導的細胞焦亡在驅(qū)動家族性地中海熱（familial Mediterra?nean fever，F(xiàn)MF）的發(fā)病中起著至關重要的作用。研究者發(fā)現(xiàn)GSDMD基因的缺失完全抵抗了FMF模型小鼠的發(fā)?。?6］。最近有報道，GSDMD驅(qū)動的細胞焦亡參與新生兒發(fā)病多系統(tǒng)炎性疾?。╪eonatal?on?set multisystem inflammatory disease，NOMID）的發(fā)病，GSDMD 的缺失能夠改善NOMID 小鼠的炎癥表型［27］。

GSDMD與神經(jīng)退行性疾?。杭毎雇黾捌浣閷У难装Y反應，通過不同方式廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展，抑制Caspase?1介導的細胞焦亡具有神經(jīng)元保護和認知保護功能［28］。研究表明細胞焦亡可通過促進IL?1β的分泌來增強炎癥反應，進而破壞神經(jīng)元，引起帕金森?。≒D）的發(fā)生［29］。細胞焦亡與阿爾茨海默癥（AD）發(fā)生也密切相關，具有AD癥狀的APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠大腦中NLRP1表達上調(diào)，體外培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元在淀粉樣β蛋白刺激下引發(fā)NLRP1 介導的Caspase?1 依賴性細胞焦亡［30］。另外，研究發(fā)現(xiàn)，焦亡蛋白GSDMD在外周髓系細胞中控制免疫激活過程，從而促進多發(fā)性硬化癥的發(fā)生［31］。

4.5 GSDME

GSDME在人的胎盤、大腦、心臟、腎臟、耳蝸、腸中均有表達，在小鼠中主要分布在脾臟、腎臟、大腸、小腸、睪丸、胃等器官。

GSDME 與人類聽力損失相關，此外GSDME 與腫瘤的關系也非常密切，研究顯示GSDME 敲低后腫瘤細胞生長、侵襲增加［32］。在黑色素瘤細胞中，GSDME缺失增加了細胞對依托泊苷的抗性，提示GS?DME促進黑色素瘤細胞對化療藥物的敏感性［33］。然而，最近報道顯示來自殺傷細胞的顆粒酶B 能夠切割激活GSDME 誘導腫瘤細胞焦亡進而抑制腫瘤發(fā)生［34］。

4.6 DFNB59

人源和鼠源DFNB59 主要分布在耳蝸、聽覺神經(jīng)元細胞體，此外，人源DFNB59在睪丸也有表達。

在人類中，DFNB59 的突變與非綜合征性感覺神經(jīng)性聽力損失有關。DFNB59缺失小鼠的耳蝸感覺毛細胞和聽覺神經(jīng)元極易受到噪音的傷害。研究發(fā)現(xiàn)，DFNB59 能夠調(diào)控過氧化物酶體的抗氧化活性進而保護聽覺系統(tǒng)免受噪聲引起的損害［35］。

5 細胞焦亡激活機制

5.1 炎癥小體激活的焦亡

在病原微生物入侵或內(nèi)部損傷因子作用下，機體固有免疫系統(tǒng)啟動炎癥小體的組裝激活。作為炎癥小體激活的下游事件，GSDMD分子介導的細胞焦亡進一步擴大炎癥反應，增強宿主防御能力，但另一方面，過強的炎癥反應能夠造成機體多器官損傷。

5.1.1 經(jīng)典炎癥小體

根據(jù)炎癥小體核心蛋白的不同，目前鑒別的經(jīng)典炎癥小體主要包括NLRP3、NLRC4、AIM2、NLRP1、Pyrin炎癥小體等。

NLRP3炎癥小體：NLRP3炎癥小體激活物包括細菌表面蛋白、真菌毒力蛋白、病毒核酸等病原相關分子模式（PAMP）或尿酸鈉（MSU）、二氧化硅、β淀粉樣蛋白等損傷相關分子模式（DAMP）。NLRP3炎癥小體激活機制包括K+外流、活性氧（ROS）產(chǎn)生和溶酶體破裂等，最近研究表明NLRP3在反面高爾基體網(wǎng)（trans Golgi network，TGN）和微管組織中心（microtubule organizing centers，MTOC）的募集定位對于NLRP3炎癥小體的激活是必需的［36］。

NLRC4炎癥小體：現(xiàn)有研究表明，傷寒沙門菌、弗氏志賀菌、嗜肺軍團菌等感染可激活宿主細胞NLRC4 炎癥小體。NLRC4 激活的方式是細菌通過功能性細菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)（type Ⅲsecretion system，T3SS）將鞭毛蛋白或毒力蛋白PrgJ 導入宿主細胞，NAIP蛋白在接受細菌配體作用后活化，促進NLRC4寡聚和炎癥小體的組裝活化。

AIM2炎癥小體：研究顯示，結核分枝桿菌、弗朗西斯菌等胞內(nèi)寄生菌，以及乙肝病毒、腸道病毒71（EV71）等病毒感染能夠激活AIM2 炎癥小體，繼而引發(fā)GSDMD 調(diào)控的細胞焦亡，促進炎癥介質(zhì)釋放，擴大炎癥反應［37］。

NLRP1 炎癥小體：炭疽致死毒素、胞壁酰二肽和某些寄生蟲能夠激活NLRP1 炎癥小體。最近新的研究表明，炭疽致死毒素和人鼻病毒的3C蛋白酶能夠誘導NLRP1 通過N 端介導的蛋白酶體降解完成炎癥小體組裝和下游活化［38-39］。

Pyrin炎癥小體：當細胞受到細菌毒素如艱難梭菌毒素TcdB的刺激后，Pyrin蛋白發(fā)生去磷酸化，進而募集ASC、Caspase?1、誘導Pyrin炎癥小體激活［40］。

5.1.2 非經(jīng)典炎癥小體

大腸桿菌、檸檬酸桿菌等革蘭陰性菌的LPS 能夠直接結合并激活宿主免疫細胞胞漿受體Caspase?4/5/11，促進GSDMD 剪切激活從而引發(fā)非經(jīng)典途徑的細胞焦亡。

5.2 非炎癥小體激活的焦亡

研究發(fā)現(xiàn)化療藥物引起腫瘤細胞Caspase?3 的激活，活化的Caspase?3 能夠在Asp270 位點剪切GSDME［9］。還有研究發(fā)現(xiàn)耶爾森菌感染抑制TAK1活性，從而引起Caspase?8 對GSDMD 的剪切激活［10，41］。2020年洪明奇團隊發(fā)現(xiàn)活化的Caspase?8在D365處剪切GSDMC 誘導腫瘤細胞焦亡的發(fā)生［22］。除了凋亡Caspase 介導細胞焦亡以外，中性粒細胞中的絲氨酸蛋白酶ELANE能夠以不依賴Caspase?1/11的方式在半胱氨酸268位切割激活GSDMD，引發(fā)中性粒細胞焦亡［11］。細胞毒性淋巴細胞中的顆粒酶Gran?zyme A 能夠水解腫瘤細胞中的GSDMB引發(fā)細胞焦亡［42］。另外，NK細胞和CTL中的顆粒酶Granzyme B能夠直接切割GSDME，誘導腫瘤細胞焦亡［34］?？傊茄装Y小體激活機制在細胞焦亡過程扮演的角色被越來越多的研究發(fā)現(xiàn)和揭示。

6 Gasdermin孔洞形成機制

根據(jù)解析的GSDMA3和GSDMD結構，GSDMA3和GSDMD N端結構具有可變性，C端主要由結構穩(wěn)定的α螺旋構成。C 端與N 端通過兩個疏水界面緊密結合，因而限制了N端的功能活性［43］。在GSDMs自抑制狀態(tài)解除后，GSDMNT發(fā)生構象變化，形成四鏈雙親性β片層結構，該結構從N 端片段核心球狀折疊中延伸產(chǎn)生3個寡聚界面，隨后GSDMNT片段寡聚，并結合胞膜形成插入膜中的β桶結構，繼而引起胞膜腫脹破裂，誘發(fā)細胞炎性死亡［44］。最近有報道，Caspase?1/11自發(fā)水解激活產(chǎn)生的p10亞基對于GSDMD的識別剪切是必要的［45］。

7 細胞焦亡的分子調(diào)控

細胞焦亡的關鍵執(zhí)行分子GSDMD 的表達和激活受到多種因素調(diào)控。有報道轉(zhuǎn)錄因子IRF2 通過直接結合GSDMD 啟動子區(qū)域內(nèi)的調(diào)節(jié)元件控制GSDMD 的轉(zhuǎn)錄表達［46］。Kang等［47］發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）降低脂質(zhì)氧化進而限制GSDMD N 端的胞膜定位從而負調(diào)控GSDMD 介導的細胞焦亡。Fitzgerald 課題組發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物富馬酸能夠在Cys191 位點（小鼠Cys192 位點）琥珀?；疓SDMD，進而阻止GSDMD N端片段的寡聚激活［48］。另外，細胞能夠通過轉(zhuǎn)運必需內(nèi)吞體復合體Ⅲ（Endosomal sorting com?plex required for transport?Ⅲ，ESCRT?Ⅲ）依賴的胞吐作用清除細胞焦亡形成的破裂胞膜，實現(xiàn)胞膜孔洞的修復［49］。鑒于GSDMD 在炎癥疾病中的重要作用，深入了解其分子調(diào)控機制，對我們更好地掌握炎癥疾病發(fā)生規(guī)律，進而開發(fā)干預炎癥疾病的新方法具有重要意義。

8 抑制細胞焦亡的小分子化合物

NLRP3炎癥小體激活伴隨細胞焦亡的發(fā)生，通過炎癥介質(zhì)的釋放擴大炎癥反應，在炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，因而靶向炎癥小體激活和細胞焦亡，是炎癥疾病的有效治療策略。

MCC950能夠特異性靶向抑制NLRP3炎癥小體激活，在小鼠實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎（experi?mental allergic encephalomyelitis，EAE）模型、Cryo?pyrin 相關周期性綜合征（Cryopyrin?associated peri?odic syndromes，CAPS）模型、PD 模型上能夠較大程度減輕小鼠發(fā)病程度［50］。NLRP3 抑制劑CY?09 對NLRP3 驅(qū)動的小鼠疾病模型（如T2D 和CAPS）具有顯著的治療作用［51］。Caspase?1的抑制劑VX?765能夠抑制血管平滑肌焦亡從而限制動脈粥樣硬化的病程，另外，VX?765 在小鼠EAE 模型上具有很好療效［52］。GSDMD 介導的細胞焦亡途徑與人類炎癥疾病的發(fā)展密切相關，篩選設計特異性靶向GSDMD的小分子抑制劑能夠阻止炎癥疾病的發(fā)生。有報道，磺酰胺類藥物NSA 能夠直接結合修飾GSDMD C191位點，抑制其成孔活性，從而抑制細胞焦亡，在LPS誘導的小鼠膿毒血癥中具有很好的療效［53］。最近發(fā)現(xiàn)用于治療酒精成癮的藥物雙硫侖在人和小鼠細胞中能夠有效抑制GSDMD 孔的形成，可接受劑量給藥的雙硫侖能夠抑制LPS誘導的小鼠膿毒癥死亡［54］。有報道，三羧酸循環(huán)中間體富馬酸酯能夠?qū)SDMD 中的半胱氨酸琥珀酰化，阻止其與半胱氨酸蛋白酶的相互作用以及隨后的加工活化，從而抑制細胞焦亡的發(fā)生［48］。

9 總結

細胞焦亡作為近年來新發(fā)現(xiàn)的細胞炎性死亡方式，越來越多地被認識到在炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用。本文闡述了細胞焦亡的特征和目前已知的核心分子調(diào)控機制，并概述了其在各炎癥疾病中的作用和影響，以及以其為靶標的治療策略。關于細胞焦亡的研究目前仍然有很多懸而未決的問題，例如，在疾病狀態(tài)下細胞死亡很可能是以多種方式并存的，而炎癥小體與Caspase 等蛋白的激活也并不一定全部引起焦亡，如何準確地區(qū)分與鑒別不同的細胞死亡類型？這需要開發(fā)新的鑒別方法。此外，作為關鍵的焦亡執(zhí)行分子，對GSDMD 蛋白本身的分子調(diào)節(jié)機制研究并不多，除了上游炎癥小體和Caspase蛋白外，是否存在其他的效應靶點仍有待發(fā)現(xiàn)。