劉瑩?彭隆?胡成

【摘要】目的 探討銀杏紅曲維生素組方（MGM）對混合型高脂血癥大鼠血脂水平的影響及其急性毒性。方法 采用混合型高脂血癥SD大鼠模型，灌胃給予25 mg/kg、50 mg/kg劑量的MGM和陽性對照品32 d后，評價(jià)MGM的調(diào)脂效果。采用最大耐受劑量法評價(jià)23.2 g/（kg·d）的MGM單次給藥72 h后對BALB/c小鼠與SD大鼠2種嚙齒類動物的急性毒性。結(jié)果 MGM及陽性對照品給藥32 d后較給藥前顯著降低高脂血癥大鼠總膽固醇、甘油三酯和LDL-C的含量（P均< 0.001），其中25 mg/kg的MGM的調(diào)脂效果與50 mg/kg劑量的陽性對照品相當(dāng)，表明MGM的復(fù)方優(yōu)于陽性對照品的調(diào)脂效果。急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MGM對大、小鼠的最大耐受劑量為23.2 g/（kg·d），相當(dāng)于人體推薦口服劑量的1933倍，在該劑量下觀察小鼠與大鼠心臟、肝臟、腎臟的病理切片結(jié)果未發(fā)現(xiàn)損傷性病變。結(jié)論 MGM顯著降低高脂血癥大鼠的血脂水平，在推薦量范圍內(nèi)服用MGM安全可靠。

【關(guān)鍵詞】銀杏葉提取物;紅曲提取物;葉酸;維生素B6;急性毒性

Hypolipidemic efficacy and safety of Ginkgo biloba leaf and Monascus extracts combined with vitamin mixture Liu Ying， Peng Long， Hu Cheng. Department of Infectious Disease， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China Corresponding author， Hu Cheng， E-mail： hucheng2@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To evaluate the hypolipidemic efficacy and acute toxicity of Ginkgo biloba leaf and Monascus extracts combined with folic acid and vitamin B6 （MGM） in SD rats with mixed hyperlipidemia. Methods The SD rat models with mixed hyperlipidemia were orally given with 25 mg/kg， 50 mg/kg of MGM and positive control substance for 32 d to explore the efficacy of MGM on the blood lipid level. The acute toxicity at 72 d after single administration of 23.2 g/（kg·d） MGM in BALB/c mice and SD rats was assessed by the maximum tolerated dose method. Results In the MGM and positive control substance groups， the contents of total cholesterol （TC）， triglycerides （TG） and low density lipoprotein-cholesterol （LDL-C） at 32 d after administration were significantly lower compared with those before administration （all P < 0.001）， and the lipid-lowering effect of MGM at a dose of 25 mg/kg was equivalent to that of the positive control substance at 50 mg/kg. Acute toxicity test showed that the maximum tolerated dose of MGM for the rats and mice was 23.2 g/（kg·d）， 1933 times of the recommended human oral dose. After administration at this dose， no pathological changes were observed in the tissues sections of heart， liver and kidney. Conclusion MGM can significantly reduce the blood lipid level in rat models with mixed hyperlipidemia， which is safe and reliable when administered within the recommended range of dose.

【Key words】Ginkgo biloba leaf extract;Monascus extract;Folic acid;Vitamin B6;Acute toxicity

血脂異常升高是導(dǎo)致心腦血管疾病發(fā)生的主要元兇。在伴有高血壓、年齡超過40歲、糖尿病等危險(xiǎn)因素存在的情況下，血脂的正常值需向下作顯著的調(diào)整，以降低共患病風(fēng)險(xiǎn)而防止心腦血管疾病的發(fā)生[1]。2019年一項(xiàng)中國人群隊(duì)列研究結(jié)果顯示HDL-C < 1.3 mmol/L時缺血性和出血性腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)均明顯增加。因此，控制血脂對健康狀況的維持亞健康的預(yù)防和疾病狀態(tài)的治療具有十分重要的意義。近30年來，中國人群的血脂水平逐步升高，血脂異常患病率明顯增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)2012年中國成人血脂異?？傮w患病率高達(dá)40.4%，血清膽固醇水平的升高將導(dǎo)致2010至2030年我國心血管病事件約增加920萬[2]。血脂異常的主要危害是增加動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┘奥阅I臟病并發(fā)動脈粥樣硬化相關(guān)性心臟病的發(fā)病危險(xiǎn)，是威脅我國人民身體健康的重要危險(xiǎn)因素[3]。

高脂血癥治療常用他汀類藥物，但其不良反應(yīng)也不容忽視，比如肝損、肌溶解、血糖升高、停藥后快速反彈[4]。這些不良反應(yīng)阻礙了部分患者使用他汀類藥物的依從性，同時也讓血脂升高的亞健康人群將其拒之門外。因此，研發(fā)天然全植物成分或藥食同源配方的調(diào)脂保健產(chǎn)品具有巨大的社會需求。本研究探討了一種藥食同源銀杏紅曲維生素組方（MGM）對混合型高脂血癥大鼠調(diào)脂的有效性，同時在正常大、小鼠上進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)觀察其安全性。

材料與方法

一、試劑

MGM由銀杏葉提取物、紅曲提取物、葉酸和維生素B6的混合物經(jīng)制粒、過篩為棕紅色粉末狀，使用時用無菌水配置，由廣州市賽普特醫(yī)藥科技股份有限公司提供。陽性對照品是依據(jù)南京海陵中藥制藥工藝技術(shù)研究有限公司申請的《預(yù)防或治療心腦血管疾病的紅曲、銀杏葉組合物及其應(yīng)用（專利號：CN200510041265.7）》發(fā)明專利組方而設(shè)定，以銀杏葉提取物和紅曲粉碎后過60目篩后按1∶1的質(zhì)量比混合而成。銀杏葉提取物購自浙江康恩貝制藥股份有限公司;紅曲提取物購自杭州雙馬球生物股份有限公司;葉酸、維生素B6購自江西天新藥業(yè)股份有限公司。

總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、LDL-C、HDL-C試劑盒均購自上海科華生物工程股份有限公司;中性樹膠（中國上海標(biāo)本模型廠），HE染色液（無錫市江原實(shí)業(yè)技貿(mào)總公司）。

二、儀器

BS-3000A電子分析天平（上海友聲衡器有限公司），5418臺式高速離心機(jī)（德國EPPENDORF），7020型全自動生化儀（日本株式會社日立高新技術(shù)），JJ2000電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠），BSA224S電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。ECLIPSE Ci-S正置顯微鏡（尼康公司），DHG-9145A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

三、MGM對混合型高脂血癥大鼠調(diào)脂功效評價(jià)方法

健康雄性SPF級SD大鼠50只，體質(zhì)量220.3 ～ 261.9 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

第1次分組：大鼠檢疫期結(jié)束后，按照動物體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對照組10只，高脂飼料（HFC）模型組（模型組） 40只。 正常對照組給予維持飼料，模型組給予HFC，持續(xù)2周（給藥前）。HFC是在維持飼料中添加20.0%蔗糖、15.0%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉，適量的酪蛋白、磷酸氫鈣和石粉等。所有飼料均由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

第2次分組：HFC喂養(yǎng)2周后，動物不禁食，使用異氟烷吸入麻醉后，眼眶靜脈竇采血，3000 轉(zhuǎn)/分離心10 min，分離血清，使用7020型全自動生化分析儀測定血清TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量。模型組淘汰血清TC含量較低的10只動物，根據(jù)動物血清TC水平將模型組剩余動物隨機(jī)分為3組。MGM的人體推薦口服劑量為0.012 g/（kg·d），實(shí)驗(yàn)設(shè)約人體推薦劑量的2倍和4倍為MGM的劑量，即分別為25 mg/kg和50 mg/kg劑量的MGM組及陽性對照組（50 mg/kg），每組10只大鼠。正常對照組大鼠按體質(zhì)量灌胃給予純凈水，各給藥組分別給予對應(yīng)的藥物溶液，每日給藥1次，連續(xù)給藥32 d，給藥32 d后采血分離血清，測定血脂含量。

四、MGM急性毒性實(shí)驗(yàn)安全性評價(jià)方法

健康SPF級BALB/c小鼠，體質(zhì)量19 ～ 22 g，40只;SD大鼠，體質(zhì)量220.3 ～ 261.9 g，10只，雌雄各半;購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物自由進(jìn)食飲水。

參照《GB15193.3-2014食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)：急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)》的最大耐受劑量法進(jìn)行本配方的安全性評價(jià)。將40只正常的BALB/c小鼠隨機(jī)分成正常組20只，MGM組20只;10只正常SD大鼠隨機(jī)分成正常組4只，MGM組6只。

動物隔夜禁食后灌胃給予MGM溶液，1 d給藥2次，間隔4 h，總給藥劑量為23.2 g/（kg·d）是人體推薦口服劑量的1933倍。給藥前后動物稱重，72 h內(nèi)觀察記錄動物死亡情況及中毒表現(xiàn)等;72 h時各組動物取心臟、肝臟和腎臟稱量各臟器濕重，計(jì)算臟器系數(shù) （%） = 臟器濕重/體質(zhì)量×100%，然后將各臟器放入固定液中固定后進(jìn)行石蠟包埋及HE染色進(jìn)行各臟器組織病理學(xué)檢查。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Graphpad Prism 7.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和作圖。正態(tài)分布定量資料用表示，2組間若方差齊性則采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若方差不齊則采用Welchs校正t檢驗(yàn);不服從正態(tài)分布的定量資料以M（P25， P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。各組給藥前后比較，2組數(shù)據(jù)的差值服從正態(tài)分布，采用配對t檢驗(yàn);不服從正態(tài)分布采用Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)。α = 0.05。

結(jié)果

一、MGM對混合型高脂血癥大鼠調(diào)脂功效評價(jià)

模型組大鼠喂養(yǎng)HFC 2周后，與正常對照組比較，血清HDL-C的含量變化不顯著，表明HFC喂養(yǎng)對大鼠HDL-C的水平無影響;模型組大鼠血清總TC、TG和LDL-C的含量升高（P均< 0.001），表明高脂血癥大鼠模型建立成功，見表1。

正常對照組在0 d和32 d檢測血清中的TC、TG和LDL-C含量未見顯著變化。

25 mg/kg劑量MGM給藥32 d后TC含量[（3.873 ±0.681）mmol/L]較給藥前[（5.951±0.828）mmol/L]降低（P < 0.001）;50 mg/kg劑量MGM給藥32 d后TC含量[（3.959±0.924）mmol/L]較給藥前[（5.997 ±1.048）mmol/L]降低（P < 0.001）;陽性對照品給藥32 d后TC含量[4.046 （3.010， 4.818）mmol/L]較給藥前[6.035 （5.373， 6.775）mmol/L]降低（P = 0.004）。25 mg/kg劑量MGM給藥32 d后TG含量[（1.263 ±0.416）mmol/L]較給藥前[（3.951±1.015）mmol/L]降低（P < 0.001）;50 mg/kg劑量MGM給藥32 d后TG含量[（1.417±0.691）mmol/L]較給藥前[（4.311±1.714）mmol/L]降低（P < 0.001）;陽性對照品給藥32 d后TG含量[（1.427±0.400）mol/L]較給藥前[（3.379±0.908）mol/L]降低（P < 0.001）。

LDL-C含量25 mg/kg劑量MGM給藥32 d后LDL-C含量[（0.479±0.079）mol/L]較給藥前[（1.096±0.167）mol/L]降低（P < 0.001）;50 mg/kg劑量MGM給藥32 d后LDL-C為[（0.565±0.219）mol/L]較給藥前[（1.314±0.492）mol/L]降低（P < 0.001）;陽性對照品給藥32 d后LDL-C含量[（0.514±0.125）mol/L]較給藥前[（1.108±0.277）mol/L]降低（P < 0.001）。25 mg/kg的MGM的調(diào)脂效果與50 mg/kg劑量的陽性對照品相當(dāng)，表明MGM的復(fù)方優(yōu)于陽性對照品的調(diào)脂效果。

動物灌胃各試劑32 d后，正常對照組、MGM（25和50 mg/kg）組及陽性對照組大鼠血清中HDL-C的含量變化不顯著，各組HDL-C含量分別為（0.534±0.081）mol/L、（0.633±0.117）mol/L、0.625（0.535，0.658） mol/L、（0.611±0.052）mol/L，說明HFC不會造成大鼠HDL-C水平的紊亂。

二、MGM急性毒性實(shí)驗(yàn)安全性評價(jià)

1.一般臨床觀察及體質(zhì)量

急性毒性實(shí)驗(yàn)在2次灌胃后的72 h內(nèi)各組均無動物死亡，大、小鼠行為活動均正常，無明顯中毒反應(yīng)。72 h動物解剖肉眼觀察心、肝、腎等主要器官未見顏色形態(tài)異常，亦沒有出血點(diǎn)或其他病理改變。給藥前大、小鼠2組體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），說明隨機(jī)分組均勻。23.2 g/kg的MGM給藥后，2組體質(zhì)量及各臟器系數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見表2 ～ 4。急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MGM對大、小鼠的最大耐受量為23.2 g/（kg·d），相當(dāng)于人體推薦口服劑量的1933倍，未能測出LD50。按照急性毒性劑量分級，屬無毒級。

2.組織病理學(xué)檢查

2組的心臟、肝臟、腎臟等主要器官肉眼觀察未見顏色形態(tài)異常，亦沒有出血點(diǎn)或其他病理改變。HE染色結(jié)果顯示與正常組比較，MGM急性給藥未見小鼠和大鼠心臟、肝臟、腎臟主要臟器發(fā)生病理性損傷，各臟器結(jié)構(gòu)清晰、細(xì)胞形態(tài)正常，初步數(shù)據(jù)表明MGM在高出人體推薦劑量1933倍的基礎(chǔ)上是安全的，見圖1。

討論

高脂血癥是一種慢性疾病，治療周期長，患者需長期服藥，然而長時間服用他汀類藥物容易產(chǎn)生耐藥性和不良反應(yīng)。藥食同源材料的復(fù)方毒性極低、適合長期服用。

紅曲為傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，紅曲提取物是從紅曲總體去分離得到以洛伐他汀為標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品，它是膽固醇合成限速酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，其對高脂血癥具有較好的預(yù)防和治療效果，并具有抗動脈粥樣斑塊形成作用，紅曲劑量與藥效呈正相關(guān)[5]。銀杏提取物中含有銀杏總黃酮、銀杏內(nèi)酯等物質(zhì)并主要以苷的形式存在。有研究發(fā)現(xiàn)銀杏提取物能夠通過調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠的多不飽和脂肪酸的分布、抑制HMG-CoA還原酶，促進(jìn)糞便膽固醇的增加，進(jìn)而導(dǎo)致膽固醇的吸收減少，以及血漿和肝膽固醇的降低，發(fā)揮調(diào)脂的作用[6]。南京海陵中藥制藥工藝技術(shù)研究有限公司申請的《預(yù)防或治療心腦血管疾病的紅曲、銀杏葉組合物及其應(yīng)用》發(fā)明專利證實(shí)紅曲提取物與銀杏葉提取物按1∶1配比關(guān)系配制，具有顯著的協(xié)同作用。本研究所用配方是在銀杏葉和紅曲提取物組分的基礎(chǔ)上進(jìn)一步添加了葉酸與維生素B6，觀察其與脂質(zhì)代謝之間的聯(lián)系。

本研究結(jié)果顯示，MGM給藥32 d后顯著降低大鼠血清中TC、TG和LDL-C的水平，具有調(diào)脂作用，且MGM復(fù)方優(yōu)于陽性對照品的調(diào)脂效果，證實(shí)MGM四組分的配方比紅曲和銀杏葉兩組分配方具有更強(qiáng)的協(xié)同調(diào)脂作用。為了保證銀杏葉、紅曲提取物合并葉酸與維生素B6聯(lián)用復(fù)方做為調(diào)脂產(chǎn)品的安全性，初步急性毒性實(shí)驗(yàn)，正常雌雄大、小鼠MGM的最大耐受劑量為23.2 g/（kg·d），高于人體推薦劑量的1933倍，病理組織學(xué)檢查MGM組動物心臟、肝臟和腎臟未見異常改變。按照急性毒性劑量分級，屬無毒級，說明按推薦量食用是安全的。根據(jù)以上結(jié)果，我們可以初步判斷，在人體推薦劑量范圍內(nèi)服用MGM是有效、安全的。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國成人血脂異常防治指南修訂聯(lián)合委員會. 中國成人血脂異常防治指南 （2016年修訂版）. 中國循環(huán)雜志，2016，31 （10）： 937-953.

[2] Moran A， Gu D， Zhao D， Coxson P， Wang YC， Chen CS， Liu J， Cheng J， Bibbins-Domingo K， Shen YM， He J， Goldman L. Future cardiovascular disease in china： markov model and risk factor scenario projections from the coronary heart disease policy model-china. Circ Cardiovasc Qual Outcomes，2010，3（3）：243-252.

[3] 胡文濤， 李少敏， 劉佩佳， Desmond Y.H.Yap， 劉迅. 血脂水平在不同CKD分期患者中與心血管事件和全因死亡預(yù)后關(guān)系研究. 新醫(yī)學(xué)，2020，51（6）： 439-444.

[4] Baigent C， Keech A， Kearney PM， Blackwell L， Buck G， Pollicino C， Kirby A， Sourjina T， Peto R， Collins R， Simes R; Cholesterol Treatment Trialists' （CTT） Collaborators. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment： prospective meta-analysis of data from 90，056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet，2005，366（9493）：1267-1278.

[5] Alberts AW， Chen J， Kuron G， Hunt V， Huff J， Hoffman C， Rothrock J， Lopez M， Joshua H， Harris E， Patchett A， Monaghan R， Currie S， Stapley E， Albers-Schonberg G， Hensens O， Hirshfield J， Hoogsteen K， Liesch J， Springer J. Mevinolin： a highly potent competitive inhibitor of hydroxymethylglutaryl-coenzyme a reductase and a cholesterol-lowering agent. Proc Natl Acad Sci U S A，1980，77（7）：3957-3961.

[6] Zhang Q， Wang GJ， A JY， Wu D， Zhu LL， Ma B， Du Y. Application of GC/MS-based metabonomic profiling in studying the lipid-regulating effects of Ginkgo biloba extract on diet-induced hyperlipidemia in rats. Acta Pharmacol Sin，2009，30（12）：1674-1687.

（收稿日期：2021-01-05）

（本文編輯：楊江瑜）