張吉麗+司鴻飛+李冰+程富勝+周緒正+張繼瑜

摘要：為了對五氯柳胺混懸劑的安全性進行評價，采用簡化寇氏法進行了大鼠的急性毒性研究。首先通過預(yù)試驗的最小致死劑量（LD100）和最大耐受劑量（LD0）確定給藥劑量及試驗分組。灌胃給藥，觀察7 d， 記錄死亡數(shù)，計算LD50及95%的置信區(qū)間。結(jié)果表明，五氯柳胺混懸劑對大鼠的急性毒性LD50為3.333 g/kg，95%的置信區(qū)間為3.084 6～3.600 8 g/kg。表明如按照化學(xué)藥物劑量分級，五氯柳胺混懸劑可認定為低毒物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：五氯柳胺混懸劑；大鼠；急性毒性；LD50

中圖分類號：S855.9；S859.79+5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5313-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.036

Abstract： A acute toxicity test of oxyclozanide suspension on rats was taken to evaluate its safety by simplified Karbers method. The dosage and grouping were determined based on the minimum lethal dose（LD100） and the maximum tolerated dose（LD0） in preliminary experiment. The rats were gavaged with oxyclozanide suspension and observed seven days. The number of deaths was recorded for calculating the LD50（lethal dose 50%） and the 95% confidence limit. The results showed that the acute toxicity LD50 of Oxyclozanide suspension on rats was 3.333 g/kg，95% confidence limit ranges was from 3.084 6 g/kg to 3.600 8 g/kg. It indicated that the oxyclozanide suspension was low-toxic drug according to chemically drug classification.

Key words： oxyclozanide suspension； rats； acute toxicity； LD50

肝片吸蟲?。‵ascioliasis hepatica）是由肝片吸蟲引起的食源性的人畜共患病。該病遍及歐洲、亞洲、非洲、美洲和大洋洲等區(qū)域[1]。患病動物出現(xiàn)消瘦、貧血、使役能力下降、乳牛產(chǎn)奶量降低等癥狀，嚴重阻礙了畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，對保障食品安全、公共衛(wèi)生安全和環(huán)境生態(tài)安全構(gòu)成了極大的威脅，同時也造成了嚴重的經(jīng)濟損失[2，3]。目前對肝片吸蟲的防治與其他蠕蟲一樣，主要依靠化學(xué)藥物進行控制。五氯柳胺混懸劑為水楊酰苯胺類化學(xué)合成類抗吸蟲藥物，主要用于抗牛、羊的肝片吸蟲感染，對絳蟲和線蟲也有較好的治療效果[4]。它可以抑制蟲體線粒體中氧化磷酸化過程，阻礙能量（ATP）生成，使蟲體因能量耗盡而死[5]。國外對于五氯柳胺的研究較早，特別是在印度、英國、美國等寄生蟲感染的高發(fā)病地區(qū)，已有大量研究表明該藥具有較好的驅(qū)蟲效果，應(yīng)用十分廣泛[6-8]。但由于該藥不溶于水，國內(nèi)并未對該藥進行系統(tǒng)性研究，相關(guān)報道較少。筆者制備了五氯柳胺混懸劑，前期試驗解決了制備工藝問題以及臨床方便給藥、儲藏運輸?shù)葘嶋H需求。本試驗以大鼠為試驗動物進行五氯柳胺混懸劑的急性毒性試驗，旨在為指導(dǎo)臨床科學(xué)、安全地使用該混懸劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗動物：SPF級SD大鼠110只，購自北京維通利華實驗動物有限公司。體重在180～220 g，雌雄各半，雌性未產(chǎn)未孕。試驗前飼養(yǎng)3～5 d，以適應(yīng)試驗環(huán)境。

藥品：五氯柳胺混懸劑，由農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室制備。試驗前，精密稱定處方中主藥及輔料，配制成0.209 g/mL的混懸劑，待用。按照處方中各輔料的用料配比，配制輔料對照組（不含主藥五氯柳胺）的濃度為0.1 g/mL。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)試驗 采用遞加法分別進行五氯柳胺混懸劑組預(yù)試驗以及輔料對照組預(yù)試驗。

五氯柳胺混懸劑預(yù)試驗：將20只SD大鼠平均分為5組，每組4只，雌雄各半，分別給大鼠稱重，計算給藥劑量。最高劑量組為5.0 g/kg，最低劑量組為1.0 g/kg。灌胃給藥，觀察7 d，記錄大鼠的死亡數(shù)，得到最小致死劑量（LD100）（記為b）和最大耐受劑量（LD0）（記為a）。確定組數(shù)N以及各組間劑量比r。

N由預(yù)試驗的最小致死劑量（LD100）b與最大耐受劑量（LD0）a的比值來確定。

r=lg-1[（lgb-lga）/（N-1）]

輔料對照組預(yù)試驗方法同上。

1.2.2 正式試驗 由預(yù)試驗結(jié)果可知，輔料預(yù)試驗的LD100大于5.0 g/kg，將大鼠樣本量增至10只，雌雄各半，仍未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，按照化學(xué)藥物毒性分級屬于實際無毒，因此得到結(jié)論，該混懸劑輔料實際無毒。根據(jù)五氯柳胺混懸劑預(yù)試驗得到的最小致死劑量（LD100）和最大耐受劑量（LD0），采用簡化寇氏法計算正式試驗組數(shù)N以及各組間劑量比r。

根據(jù)五氯柳胺混懸劑預(yù)試驗結(jié)果將正式試驗分為6組，其中包括空白對照組1組以及不同劑量給藥組5組。將60只SD大鼠（雌雄各半，體重180～220 g）隨機分為6組，每組雌雄各半。試驗組的給藥劑量分別為5.000、3.375、2.250、1.500、1.000 g/kg，空白對照組給予等量的飲用水。灌胃給藥，觀察7 d，自由飲水，采食，觀察大鼠的外觀體征、飲食欲、行為活動、大小便等相關(guān)癥狀。給藥后4 h，持續(xù)觀察；4～8 h內(nèi)每30 min觀察一次；8～12 h，每1 h觀察一次；12～48 h，每隔3 h觀察一次；3 d后每天觀察3次，直至第七天結(jié)束。記錄每組死亡大鼠個數(shù)，對死亡動物進行剖檢，與空白組對照，觀察各組織器官的病理變化。用改良寇氏法計算LD50及95%的置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)試驗結(jié)果

輔料預(yù)試驗組的LD100大于5.0 g/kg，增加試驗動物數(shù)量至10只，仍未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，按照化學(xué)藥物的毒性分級可以視為實際無毒。

五氯柳胺混懸劑試驗組預(yù)試驗的LD100為5.0 g/kg，LD0為1.0 g/kg。從而確定正式試驗的組數(shù)N為5。各組之間的劑量比值r=1.495。由此將預(yù)試驗分為6組，其中5組為不同劑量給藥組，1組為空白對照組。

2.2 正式試驗結(jié)果

觀察給藥后動物表現(xiàn)出的癥狀為：大鼠被毛逆亂、精神沉郁，伏臥不動，眼睛微閉，食欲不振，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，個別大鼠出現(xiàn)四肢無力、糞便變軟，少數(shù)大鼠出現(xiàn)后肢癱瘓等現(xiàn)象，死亡前出現(xiàn)全身震顫、側(cè)翻現(xiàn)象，大約持續(xù)5～10 min死亡。高劑量組的癥狀明顯，低劑量組癥狀較輕微，恢復(fù)快。大鼠死亡時間集中在8～15 h，2 d后再無死亡現(xiàn)象，癥狀逐漸緩解。

對死亡動物剖檢，與空白對照組相比，死亡動物的口唇、四肢、尾巴青紫。高劑量組中，個別大鼠出現(xiàn)脾腫大、肝有出血點、胃部膨大、胃壁變薄等現(xiàn)象。

正式試驗死亡情況見表1。根據(jù)簡化寇氏法計算LD50以及95%置信限公式如下：

式中，Xm為最大劑量的對數(shù)；i為組距，即相鄰兩組劑量對數(shù)值之差；p為各劑量組死亡率，q為各劑量組存活率；∑p為各劑量組死亡率之和；n為各組動物數(shù)；sx50為lgLD50的標準誤差。

計算得到LD50為3.333 g/kg，95%置信區(qū)間為3.084 6～3.600 8 g/kg。根據(jù)化學(xué)物急性毒性（LD50）劑量分級可知五氯柳胺口服混懸劑為低毒物質(zhì)。

3 小結(jié)與討論

本試驗嚴格遵守《獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編》[9]中對藥物急性毒性試驗的相關(guān)規(guī)定。試驗采用SPF級SD大鼠作為試驗動物，保證試驗動物健康無污染，以防對試驗結(jié)果造成影響。由于高劑量組藥物濃度較大，液體較黏稠，稀釋后給藥體積較大，考慮到大鼠的胃容積，為防止撐死現(xiàn)象的發(fā)生，采用多次給藥。給藥間隔為1～2 h，24 h內(nèi)給藥完成。

由試驗結(jié)果可知，大鼠給予五氯柳胺混懸劑后，出現(xiàn)精神倦怠、食欲減退、生長遲緩等現(xiàn)象，根據(jù)大鼠的死亡數(shù)計算五氯柳胺混懸劑的半數(shù)致死劑量（LD50）為3.333 g/kg，95%置信區(qū)間為3.084 6～3.600 8 g/kg。由化學(xué)物毒性分級可知，五氯柳胺混懸劑為低毒物質(zhì)，臨床用藥安全。五氯柳胺作為廣譜抗寄生蟲藥，具有廣譜高效、無耐藥性等特點[10]，本研究對其新制劑五氯柳胺混懸劑的安全性進行了評價，以期為該制劑的后續(xù)研究及臨床推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] ASHRAFI K，BARGUES M D，O'NEILL S，et al.Fascioliasis：A worldwide parasitic disease of importance in travel medicine[J].Travel Med Infect Dis，2014，12（6）：636-649.

[2] KHORAMIAN H，ARBABI M，OSQOI M M，et al. Prevalence of ruminants fascioliasis and their economic effects in Kashan， center of Iran[J].Asian Pac J Trop Biomed，2014，4（11）：918-922.

[3] ABDEL-NASSER A H，REFAAT K. Fascioliasis prevalences among animals and human in Upper Egypt[J].Journal of King Saud University（Science），2010，22（1）：15-19.

[4] SANABRIA R，MORENO L，ALVAREZ L，et al.Efficacy of oxyclozanide against adult Paramphistomum leydeni in naturally infected sheep[J].Veterinary parasitology，2014，206（3）：277-281.

[5] 崔 瑩.驅(qū)蟲藥五氯柳胺的制備[J].現(xiàn)代商貿(mào)工業(yè)，2010（20）：300.

[6] GALDHAR C N，ROY M，ROY S. Efficacy of oxyclozanide （Neozide suspension） against paramphistomiasis in buffaloes[J]. Intas Polivet，2003，4（2）：266-268.

[7] PARAUD C，GAUDIN C，PORS I，et al.Efficacy of oxyclozanide against the rumen fluke Calicophoron daubneyi in experimentally infected goats[J].The Veterinary Journal，2009，180（2）：265-267.

[8] ATHAR L A，KHAN M N，SAJID M S，et al. Cost benefits analysis of anthelmintic treatment of cattle and buffaloes[J]. Pakistan Veterinary Journal，2011，31（2）：149-152.

[9] 農(nóng)業(yè)部獸藥評審中心.獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則匯編[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2012.

[10] ARIAS M S，SANCHIS J，F(xiàn)RANCISCO I，et al.The efficacy of four anthelmintics against Calicophoron daubneyi in naturally infected dairy cattle[J].Vet Parasitol，2013，197（1-2）：126-129.