韓希鳳，李書啟，陳存坤，王俊全*，蓋旭，陳玲

（1．天津天獅學(xué)院 食品工程學(xué)院，天津 301700；2.國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津），農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

石榴不僅含有人體所需的多種氨基酸和微量元素，還含有大量維生素、蛋白質(zhì)、碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有抗疲勞、生津止渴、食療保健等功能[1-2]。最初，石榴主要是鮮食。但近年來(lái)，隨著我國(guó)石榴種植面積上升，產(chǎn)量不斷增加，而鮮銷量有限，石榴深加工相對(duì)滯后，造成鮮果大量浪費(fèi)。以石榴汁為原料，經(jīng)發(fā)酵、陳釀制成的低度的石榴果酒[3]，果香濃郁、營(yíng)養(yǎng)豐富，將石榴加工成果酒不僅豐富了石榴深加工產(chǎn)品的種類，提高了石榴的利用率和附加值，同時(shí)與國(guó)家用低度酒代替高度酒、果酒代替糧食酒的號(hào)召相輔相成，是石榴深加工的一條新途徑。然而，發(fā)酵后的石榴果酒顏色較深，并含有果膠、鞣酸等大分子物質(zhì)，后期陳釀時(shí)這些物質(zhì)易絮凝沉淀，導(dǎo)致酒體渾濁，嚴(yán)重影響果酒的品質(zhì)[4-6]。

果酒澄清最常用的方法是加入澄清劑，且同一種澄清劑對(duì)不同果酒的澄清效果也不同[7-8]。皂土、殼聚糖、明膠、果膠酶等是目前果酒生產(chǎn)中常用的澄清劑，選擇適宜的澄清劑可有效去除易造成渾濁沉淀的物質(zhì)，使果酒具有良好的感官指標(biāo)和穩(wěn)定性[9]。如李德燕等[10]對(duì)比殼聚糖、皂土、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、明膠、硅藻土和果膠酶6種澄清劑對(duì)酥李果酒的澄清效果，發(fā)現(xiàn)利用最適用量的不同澄清劑澄清酒液，其感官品質(zhì)均有顯著提高，但殼聚糖澄清的酥李果酒，其澄清速率和穩(wěn)定性最佳，是酥李果酒的最適澄清劑。

然而，迄今為止專門針對(duì)石榴果酒澄清劑篩選及其工藝優(yōu)化的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。由此，本試驗(yàn)采用4種不同的澄清劑（殼聚糖、明膠、皂土和果膠酶）對(duì)石榴果酒進(jìn)行澄清處理，通過(guò)對(duì)澄清后酒樣的理化指標(biāo)、澄清度等進(jìn)行分析，并結(jié)合感官評(píng)價(jià)，探索適合石榴果酒的澄清劑并利用正交試驗(yàn)對(duì)其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為石榴果酒的加工提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴果酒：天津天獅學(xué)院果蔬制品工藝實(shí)驗(yàn)室自制（市售陜西酸石榴，按照葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)釀造工藝正常發(fā)酵，于酒罐貯存1個(gè)月，取上清液進(jìn)行澄清試驗(yàn)）。

皂土（食品級(jí)）、果膠酶（食品級(jí)，酶活＞40000U/mg）：煙臺(tái)帝伯士自釀機(jī)有限公司；明膠（食品級(jí)）、殼聚糖（食品級(jí)，脫乙酰度85%）：浙江一諾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動(dòng)測(cè)色色差計(jì)（TCPⅡ）：北京奧依克光電儀器有限公司；數(shù)字阿貝折光儀（WAY-2S型）：上海儀電物理光學(xué)儀器有限公司；紫外分光光度計(jì)（UV2550）：日本島津公司；高溫滅菌鍋（MJ-78A型）：上海恰森儀器有限公司；生物傳感器（SBA-40C）：山東省科學(xué)院生物研究所。

1.3 方法

1.3.1 石榴果酒的制作工藝流程

無(wú)籽石榴→挑選→去皮→加水打漿 [料液比1∶3（g/mL）]→果膠酶酶解（果膠酶用量 2%，4 h）→成分調(diào)整（糖度16%，pH4.5）→滅菌（沸水浴 15 min）→冷卻→酵母菌活化→接種→發(fā)酵（28℃，7 d）→陳釀→澄清→過(guò)濾→灌裝→殺菌→成品

1.3.2 澄清劑的配制

1%殼聚糖溶液：參照郭燕等[11]的方法配制；1%明膠溶液：參照李亞輝等[12]的方法配制；1%皂土溶液（懸濁液）參照邵曉慶等[13]的方法配制；1%果膠酶溶液：參照饒炎炎等[14]的方法配制。

1.3.3 石榴果酒澄清劑篩選試驗(yàn)

取石榴果酒50.00 mL，24份，將殼聚糖、明膠、皂土、果膠酶分別加入果酒中（添加量見(jiàn)表1），混勻，20℃靜置10 h后，4 000 r/min離心15 min，取上清液，測(cè)定A720，計(jì)算石榴果酒的澄清度。澄清度/%=10-A720×100[15]。

表1 4種澄清劑澄清試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design of four clarifiers

1.3.4 皂土澄清單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 皂土添加量

取5份石榴果酒，各50.00 mL，皂土溶液分別按照0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g/L 加入果酒中，混勻，20 ℃靜置10 h 后，4 000 r/min 離心 15 min，取上清液，測(cè)定 A720，計(jì)算澄清度。

1.3.4.2 處理溫度

取5份石榴果酒，各50.00 mL，皂土溶液以0.7 g/L加入果酒中，混勻，分別于 10、15、20、25、30 ℃靜置10 h 后，4 000 r/min 離心 15 min，取上清液，測(cè)定 A720，計(jì)算澄清度。

1.3.4.3 處理時(shí)間

取5份石榴果酒，各50.00 mL，皂土溶液以0.7 g/L加入果酒中，混勻，于 20 ℃分別靜置 5、10、15、20、25 h后，4 000 r/min 離心 15 min，取上清液，測(cè)定 A720，計(jì)算澄清度。

1.3.5 皂土澄清條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以澄清度為指標(biāo)，以皂土添加量（A）、處理溫度（B）、處理時(shí)間（C），設(shè)計(jì)三因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)，對(duì)皂土的澄清條件進(jìn)行優(yōu)化，因素與水平見(jiàn)表2。

表2 因素水平Table 2 Factors and level

1.3.6 理化指標(biāo)的檢測(cè)方法和感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

色度：參照曹建康等[16]的方法測(cè)定；色差：參照周禹含等[17]的方法測(cè)定；可溶性固形物含量：利用阿貝折光儀測(cè)定，重復(fù)3次，取平均值；酒精度：參照韓希鳳等[18]的方法進(jìn)行測(cè)定。

感官評(píng)價(jià)：石榴果酒評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表3所示。該標(biāo)準(zhǔn)由14名專業(yè)人員組成的感官評(píng)價(jià)小組參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》共同制定。感官評(píng)價(jià)小組成員對(duì)果酒進(jìn)行評(píng)價(jià)打分（滿分為100分），取平均值作為試驗(yàn)結(jié)果。

表3 石榴果酒感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation standard of pomegranate wine

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 石榴果酒澄清劑的篩選

2.1.1 明膠添加量對(duì)石榴果酒的澄清效果

明膠添加量對(duì)石榴果酒澄清效果的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，隨著明膠添加量增加，石榴果酒的澄清度整體上呈先增大后減小的趨勢(shì)，在明膠添加量為0.9 g/L時(shí)澄清效果最佳，澄清度為80.9%，之后，隨明膠添加量增加，石榴果酒的澄清度整體下降，這是因?yàn)槊髂z作為水溶性蛋白質(zhì)，在水溶液中形成的分散體系帶正電荷，一方面可與果酒中單寧、果膠等帶負(fù)電的化合物絮凝沉淀，一方面可與酒中單寧結(jié)合成黏稠狀物質(zhì)，吸附果酒中的渾濁微粒沉淀，使酒體澄清[19]；但過(guò)量的明膠自身會(huì)形成絮狀體或懸濁液，導(dǎo)致酒體渾濁[20]。由此，明膠添加量為0.9 g/L時(shí)對(duì)石榴果酒的澄清效果最好。

圖1 明膠添加量對(duì)石榴果酒澄清效果的影響Fig.1 Effects of different gelatin addition on clarification for pomegranate wine

2.1.2 殼聚糖添加量對(duì)石榴果酒的澄清效果

殼聚糖添加量對(duì)石榴果酒的澄清效果的影響見(jiàn)圖2。

圖2 殼聚糖添加量對(duì)石榴果酒澄清效果影響Fig.2 Effects of different chitosan addition on clarification for pomegranate wine

由圖2可知，隨著殼聚糖添加量增加，石榴果酒澄清度整體上先升后降，殼聚糖添加量為0.6 g/L時(shí)效果最好，澄清度達(dá)到94.8%，說(shuō)明殼聚糖添加量適當(dāng)時(shí)，可提高果酒澄清度，這與殼聚糖本身是陽(yáng)離子絮凝劑，可與單寧、果膠、蛋白質(zhì)等帶負(fù)電荷物質(zhì)凝聚、沉淀有關(guān)[21]；但殼聚糖超過(guò)一定量時(shí)反而使果酒澄清度下降，這可能是因?yàn)闅ぞ厶且彩窃龀韯?，過(guò)量的殼聚糖溶解于果酒會(huì)形成相對(duì)穩(wěn)定的絮凝體系，而對(duì)酒體澄清不利。由此，殼聚糖添加量為0.6 g/L時(shí)對(duì)石榴果酒的澄清效果最好。

2.1.3 皂土添加量對(duì)石榴果酒澄清效果的影響

皂土添加量對(duì)石榴果酒澄清效果的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，隨著皂土添加量增加，果酒澄清度整體上先升后降，皂土添加量為0.6 g/L時(shí)澄清效果較好，澄清度為97.7%，說(shuō)明適量的皂土能與果酒中部分渾濁物以及帶顏色物質(zhì)發(fā)生絮凝沉淀，但過(guò)量的皂土?xí)陨斫惶嫘纬蓱覞嵋?，而不利于石榴果酒澄清。皂土是由硅酸鹽薄片組成的無(wú)機(jī)礦物凝膠，吸收水溶脹后，形成的膠體懸浮液帶負(fù)電荷，致使果酒中帶正電荷的蛋白質(zhì)和單寧等物質(zhì)通過(guò)電荷中和作用絮凝沉淀，從而使酒體澄清[22-23]。由此，皂土添加量為0.6 g/L時(shí)對(duì)石榴果酒的澄清效果最好。

圖3 皂土添加量對(duì)石榴果酒澄清效果影響Fig.3 Effects of different bentonite addition on clarification for pomegranate wine

2.1.4 果膠酶添加量對(duì)石榴果酒澄清效果的影響

果膠酶添加量對(duì)石榴果酒澄清效果的影響見(jiàn)圖4。

圖4 果膠酶添加量對(duì)石榴果酒澄清效果影響Fig.4 Effects of different pectinase addition on clarification for pomegranate wine

由圖4可知，石榴果酒的澄清度隨著果膠酶添加量的增加先升后降。當(dāng)果膠酶添加量為0.3 g/L時(shí)，澄清效果最好，澄清度可達(dá)80.4%。果膠酶添加量高于0.3 g/L時(shí)，果酒的澄清度開始下降，這與過(guò)多酶蛋白引起果酒渾濁有關(guān)。

2.1.5 不同澄清劑對(duì)石榴果酒澄清效果的比較

在適宜添加量下，分析了4種澄清劑（果膠酶、殼聚糖、皂土、明膠）對(duì)石榴果酒澄清效果的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 石榴果酒澄清前后的比較分析Table 4 Analysis of pomegranate wine before and after clarification

由表4可知，殼聚糖和皂土澄清的果酒澄清度均在90%以上，澄清效果相近；果膠酶和明膠的澄清效果較差。同時(shí)，添加澄清劑的果酒，其可溶性固形物含量、色度、色差都低于未添加澄清劑的樣品，而皂土處理的果酒，感官評(píng)分最高，為86.8分，酒精度與未澄清的果酒最接近，效果優(yōu)于殼聚糖澄清，且所得果酒澄清透明、顏色鮮亮、口感好。因此，皂土為石榴果酒的適宜澄清劑。

2.2 皂土澄清石榴果酒條件的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

皂土添加量、處理溫度、處理時(shí)間單因素試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)圖5、圖6、圖7。

圖5 皂土添加量對(duì)石榴果酒澄清效果影響Fig.5 Effects of different bentonite addition on clarification for pomegranate wine

圖6 處理溫度對(duì)石榴果酒澄清效果影響Fig.6 Effects of different tempreture on clarification for pomegranate wine

圖7 處理時(shí)間對(duì)石榴果酒澄清效果影響Fig.7 Effects of different time on clarification for pomegranate wine

由圖5、圖6、圖7可知，皂土添加量、處理溫度、處理時(shí)間對(duì)石榴果酒澄清度的影響均為整體上先升后降，皂土添加量0.7 g/L時(shí)，澄清效果最好，果酒澄清度達(dá)到最大值94.8%；處理溫度20℃時(shí)，果酒的澄清度達(dá)到最大值95.5%；處理時(shí)間為10 h時(shí)，果酒的澄清度達(dá)到最大值97.7%。

2.2.2 正交試驗(yàn)

2.2.2.1 正交試驗(yàn)分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以澄清度為指標(biāo)，以皂土添加量（A）、處理溫度（B）、處理時(shí)間（C）設(shè)計(jì)三因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)，對(duì)皂土的澄清條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of orthogonal test

由表5和表6可知，3個(gè)因素對(duì)石榴果酒澄清度的影響順序?yàn)锽＞A＞C，即處理溫度＞皂土添加量＞處理時(shí)間，且皂土添加量和處理溫度的影響顯著（P＜0.05），處理時(shí)間影響不顯著。其最優(yōu)方案為A2B1C1，即皂土添加量為0.70 g/L，處理溫度為18℃，處理時(shí)間為8.0 h。

表6 方差分析結(jié)果Table 6 Results of variance analysis

2.2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

方案1（正交試驗(yàn)理論最佳組合）：皂土添加量0.70 g/L，處理溫度18℃，處理時(shí)間8.0 h。方案2（正交試驗(yàn)實(shí)際最佳組合）：皂土添加量為0.70 g/L，處理溫度為18℃，處理時(shí)間為10.0 h。對(duì)方案1和方案2進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析Table 7 Analysis of verification test results

由表7可知，方案1澄清后的果酒，其可溶性固形物含量、色差、色度及酒精度均優(yōu)于方案2，感官評(píng)分優(yōu)于方案2，因此，最佳澄清工藝條件為方案1，即皂土添加量為0.70 g/L，處理溫度為18℃，處理時(shí)間為8.0 h。

3 結(jié)論

通過(guò)4種澄清劑的篩選試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)石榴果酒的澄清效果最好的為皂土，其次是殼聚糖，果膠酶和明膠的較差。同時(shí)，添加澄清劑的石榴果酒，其可溶性固形物含量、色度、色差都低于未添加澄清劑的樣品；而皂土澄清的石榴果酒，其各項(xiàng)指標(biāo)均高于殼聚糖澄清，且酒精度與未澄清的果酒相近，感官品質(zhì)較佳。因此，皂土為石榴果酒的適宜澄清劑。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以澄清度為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)皂土澄清工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：3個(gè)因素對(duì)石榴果酒澄清度的影響順序?yàn)樘幚頊囟龋驹硗撂砑恿浚咎幚頃r(shí)間，且皂土添加量和處理溫度的影響顯著（P＜0.05），處理時(shí)間影響不顯著。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，最優(yōu)方案為A2B1C1，即皂土添加量為0.70 g/L，處理溫度為18℃，處理時(shí)間為8.0 h。此時(shí)果酒的澄清度為最高達(dá)98.9%，感官評(píng)分88.2分，果酒清澈透明、均一穩(wěn)定，呈鮮亮紅色，品質(zhì)較佳。