吳亞松，李 薇，朱 毅，李 東

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬明基醫(yī)院輸血科，江蘇 南京 210003；2湖南師范大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，湖南 長沙 410005；3南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胰腺中心，4普外科，江蘇 南京 210009

嵌合抗原受體T（chimeric antigen receptor-T，CAR-T）細(xì)胞在針對B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病［1-2］和B細(xì)胞淋巴瘤［3-4］的臨床試驗中取得了巨大成功，徹底改變了血液腫瘤的治療方法，為相應(yīng)疾病的患者提供了新選擇。在CAR-T 細(xì)胞治療技術(shù)的研發(fā)過程中，細(xì)胞殺傷實驗是非常關(guān)鍵的驗證手段，此實驗用CAR-T細(xì)胞與靶細(xì)胞以一定比例共培養(yǎng)，特定時長之后用特定的方法檢測靶細(xì)胞的死亡比例，即可以用靶細(xì)胞的死亡率來表示CAR-T 細(xì)胞的殺傷能力。靶細(xì)胞死亡率的檢測方法中，傳統(tǒng)的51Cr（鉻51）釋放實驗需要專門的放射性檢測儀器［5］，而銪元素（Europium）標(biāo)記、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）代謝產(chǎn)物等檢測方法具有較高的檢測背景，導(dǎo)致信噪比較低［6-7］，因此我們建立并比較了熒光染料雙染流式法和螢火蟲熒光素酶法兩種方法，希望以此驗證這兩種方法的有效性與適用條件。

1 材料和方法

1.1 材料

人淋巴瘤細(xì)胞系Raji 細(xì)胞和人白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫，表達(dá)luciferase 基因的Raji-luc 細(xì)胞和表達(dá)人CD19 基因的K562-CD19細(xì)胞為本實驗室構(gòu)建；Malme-3m細(xì)胞購自南通表源生物技術(shù)有限公司，表達(dá)人CD19和luciferase基因的Malme-3m-CD19-luc細(xì)胞為本實驗室構(gòu)建；人外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood monouclear cell，PBMC）來自天津市血液中心，CD19-CART細(xì)胞為本實驗室構(gòu)建。

DMEM 培養(yǎng)基（C11995500BT，Gibco 公司，美國）；胎牛血清（FSP500，Excell 公司，美國）；Calcein-AM（貨號C131116-1mg，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；CellTracker DeepRed Dye（貨號C34565，Invitrogen 公司，美國）；D-Luciferin（貨號7902-1G，BioVision 公司，美國）；ATP（貨號A100885，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；PBS（SH30256.01，HyClone公司，美國）；0.25%Trypsin（25200-072，Gibco 公司，美國）；二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo 公司，美國）；生物安全柜（Thermo Scientific 1300 Series A2，Thermo公司，美國）；小動物活體成像系統(tǒng)（IVIS Lumina Ⅲ，Caliper 公司，美國）；流式細(xì)胞儀（Guava EasyCyte，Millipore公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 靶細(xì)胞系構(gòu)建

pRL-luciferase、pRL-hCD19、pRL-hCD19-luciferase 3 個質(zhì)粒分別與pCMV-VSV-G 和pCMV-dR8.91 2 個包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞，收獲的病毒上清經(jīng)20倍濃縮后，分別感染Raji細(xì)胞、K562細(xì)胞和Malme-3m細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選純化后，得到Rajiluc、K562-CD19、Malme-3m-CD19-luc 3 個細(xì)胞系作為殺傷實驗的靶細(xì)胞。

1.2.2 CAR-T細(xì)胞的制備與培養(yǎng)

用CD19-CAR 質(zhì)粒與pCMV-dR8.91 和pCMVVSV-G 2個包裝質(zhì)粒按照4∶3∶1的比例，用PEI共轉(zhuǎn)染293-T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h收獲病毒上清，經(jīng)超速離心后換T細(xì)胞培養(yǎng)基（X-VIVO15+0.5%HSA）進行20倍濃縮。人PBMC細(xì)胞經(jīng)Ficoll分離后加100 ng/mL可溶性CD3 抗體（OKT3）和300 U 白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-2刺激，48 h 后換液加入病毒32 ℃300g離心90 min感染，感染后24 h換新鮮T細(xì)胞培養(yǎng)基，CAR-T細(xì)胞培養(yǎng)到第7天即可作為效應(yīng)細(xì)胞開展殺傷實驗。

1.2.3 熒光染料雙染流式法檢測細(xì)胞殺傷

熒光染料雙染流式法是用兩種不用的熒光染料標(biāo)記靶細(xì)胞，在與效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)后檢測殺傷的方法，在流式細(xì)胞儀上檢測雙熒光細(xì)胞的減少確定死亡細(xì)胞，并計算殺傷效率［8-10］。具體方法為：在1 mL T細(xì)胞培養(yǎng)基（X-VIVO15+0.5%HSA）中加入1×106個Raji 細(xì)胞，加入Calcein-AM 至終濃度2 nmol/L，加入CellTracker DeepRed Dye 至終濃度0.1 μmol/L，混勻后37 ℃避光孵育30 min，孵育完成后用PBS洗3次，以1×104個/孔的密度接種于96 孔板中。實驗組取CD19-CART 細(xì)胞，PBS 洗1 遍后重懸于T 細(xì)胞培養(yǎng)基中，以1∶1、5∶1、10∶1的細(xì)胞量分別加入到對應(yīng)的Raji細(xì)胞孔中，每孔終體積為200 μL，陽性對照組不加CD19-CART 細(xì)胞，用T 細(xì)胞培養(yǎng)基補足體積至200 μL。所有孔混勻后放置CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育約4 h，孵育完成后即可直接用流式細(xì)胞儀檢測。

使用的染料包括一種綠色熒光染料Calcein-AM和一種紅色熒光染料CellTracker DeepRed Dye，兩個染料都可以對活的靶細(xì)胞均勻染色，用流式細(xì)胞儀可以檢測到顯著的陽性。設(shè)置流式檢測象限的X軸為Red-R，Y軸為Green-B，則雙陽性的靶細(xì)胞在象限的右上角，雙陰性的效應(yīng)細(xì)胞在象限的左下角。

殺傷效率計算公式為：（靶細(xì)胞密度值陽性對照-靶細(xì)胞密度值實驗組）/靶細(xì)胞密度值陽性對照×100%。

1.2.4 螢火蟲熒光素酶法檢測細(xì)胞殺傷

螢火蟲熒光素酶法是利用螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase，下文簡稱“l(fā)uc”）的化學(xué)發(fā)光特性，用基因工程方法構(gòu)建表達(dá)luc 的靶細(xì)胞，在殺傷實驗檢測時加入luc 的發(fā)光底物后，即可通過發(fā)出的熒光信號的強弱來顯示活細(xì)胞數(shù)目，以此來計算殺傷效率［11-12］。具體方法為：用表達(dá)luc的細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以1×104個/孔的密度接種于96 孔板中，實驗組將CD19-CART 細(xì)胞以1∶1、5∶1、10∶1、20∶1 的細(xì)胞量分別加入到各個靶細(xì)胞孔中，每孔終體積為200 μL，陽性對照為只有靶細(xì)胞且不加CAR-T 細(xì)胞，用培養(yǎng)基補足體積至200 μL，陰性對照為靶細(xì)胞加50 μL 2%Triton X-100溶液裂解，所有孔混勻后放置CO2培養(yǎng)箱37 ℃孵育約16 h。孵育過后，首先每孔加入50 μL 2%的Triton X-100 溶液，用移液器混勻后每孔取出50 μL，加入到檢測用的黑色96 孔板中，再向黑色96孔板中每孔加入50 μL的底物溶液（300 μg/mL D-Luciferin 水溶液與2 mg/mL ATP水溶液按照體積比為3∶1 混和），用移液器混勻后靜置5 min，上機檢測。檢測儀器可用多功能酶標(biāo)儀或活體成像儀。

殺傷效率計算公式為：［（熒光強度陽性對照-熒光強度陰性對照）-（熒光強度實驗組-熒光強度陰性對照）］/（熒光強度陽性對照-熒光強度陰性對照）×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用涉及兩組數(shù)據(jù)間的比較時統(tǒng)計方法采用Student-t檢驗。涉及3組及以上數(shù)據(jù)間的比較時統(tǒng)計方法為單因素方差分析，用LSD 法進行多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光染料雙染流式法在懸浮細(xì)胞殺傷實驗中的效果

為了驗證熒光染料雙染流式法檢測殺傷實驗的效果，用靶向CD19 的CD19-CAR 病毒感染人的PBMC 制備了CD19-CART，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)驗證，其CD3陽性率大于90%，其CAR陽性率可達(dá)39.5%（圖1A），將此CD19-CART 細(xì)胞與CD19 陽性的Raji 細(xì)胞共孵育可檢測到IFN-γ釋放的顯著提高（圖1B），證明此CD19-CART細(xì)胞具有針對CD19陽性細(xì)胞的殺傷能力。

為了觀察細(xì)胞數(shù)目而非相對的比例，需要將流式參數(shù)設(shè)置為顯示細(xì)胞濃度，這樣所有樣品收集等體積的上樣量，即可得到相應(yīng)目的細(xì)胞的濃度數(shù)值（圖1C）。為了驗證流式方法檢測細(xì)胞數(shù)量的準(zhǔn)確性，我們用效應(yīng)細(xì)胞的劑量梯度與流式讀數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示了很好的線性關(guān)系（圖1D）。殺傷效率隨著CD19-CART 效應(yīng)細(xì)胞的增多而增高的趨勢（圖1E）。

CD19-CART細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，并用感染對照病毒的同批次培養(yǎng)T細(xì)胞作對照，用上述“熒光染料雙染流式法”開展了以Raji 細(xì)胞和表達(dá)CD19 的K562細(xì)胞（K562-CD19）為靶細(xì)胞的殺傷實驗，結(jié)果顯示CD19-CART 細(xì)胞對兩種懸浮靶細(xì)胞的殺傷都高于其對照T細(xì)胞，差異具有顯著性（圖1F、G）。

鑒于有些殺傷實驗會用到貼壁細(xì)胞作為靶細(xì)胞，我們用黑色素瘤細(xì)胞系Malme-3m 構(gòu)建了表達(dá)CD19的貼壁細(xì)胞系Malme-3m-CD19，并用上述方法開展了同樣的殺傷實驗，但結(jié)果卻顯示誤差過大，CD19-CART 細(xì)胞與對照T 細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷效率沒有顯著性差異（圖1H），分析認(rèn)為貼壁細(xì)胞若采用此種方法會需要采用胰酶消化與吹打等操作，不但容易造成更多的細(xì)胞損傷，而且已標(biāo)記到胞內(nèi)的染料還可能外泄，進而更易產(chǎn)生較大誤差，因此此流式方法更適用于懸浮細(xì)胞的檢測，對于貼壁細(xì)胞還需其他更溫和且更適合的方法。

圖1 熒光染料雙染流式法可檢測CAR-T細(xì)胞對懸浮細(xì)胞的殺傷實驗

2.2 螢火蟲熒光素酶法在貼壁細(xì)胞殺傷實驗中的效果

為了驗證熒光素酶法檢測殺傷實驗的效果，我們在96孔板中加入按比例稀釋的靶細(xì)胞，加入底物后用活體成像儀檢測，拍下96 孔板發(fā)光照片（圖2A），計算出的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2B），證明了此方法的準(zhǔn)確性。在加入了相等數(shù)目靶細(xì)胞Raji-luc細(xì)胞的孔中分別加入1倍、5倍、10倍、20倍數(shù)目的CD19-CART 細(xì)胞，加入底物后用活體成像儀檢測，拍下96 孔板發(fā)光照片（圖2C、D）。由于靶細(xì)胞被殺傷后釋放出的熒光素酶降解需要一定時間，為了增加實驗的準(zhǔn)確性，我們?yōu)闊晒馑孛阜ㄔO(shè)定了更久的殺傷孵育時間（過夜殺傷，16 h），考慮到實驗組與對照組都經(jīng)歷了同樣的孵育時長，我們認(rèn)為細(xì)胞在此孵育期間的增殖效應(yīng)對雙方是等效的，所以在此實驗中默認(rèn)細(xì)胞增殖不影響結(jié)果判定。結(jié)果顯示，隨著加入的CD19-CART細(xì)胞的增加，殺傷效率呈顯著增高趨勢（圖2E）。

用此方法開展CD19-CART 細(xì)胞及其對照T細(xì)胞對懸浮的Raji-luc細(xì)胞和貼壁的Malme-3m-CD19-luc（表達(dá)CD19 和luciferase 的Malme-3m 細(xì)胞）的殺傷實驗，結(jié)果顯示CD19-CART細(xì)胞對兩種靶細(xì)胞的殺傷都顯著高于其對照T 細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2E、F），因此螢火蟲熒光素酶法對懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的殺傷實驗都適用。

圖2 螢火蟲熒光素酶法對靶細(xì)胞為懸浮細(xì)胞或貼壁細(xì)胞的殺傷實驗

3 討論

CD19-CART 細(xì)胞治療已經(jīng)成為復(fù)發(fā)/難治性B細(xì)胞白血病和非霍奇金淋巴瘤的最優(yōu)療法，其完全緩解率甚至可為50%～90%，由此引起了學(xué)術(shù)界極大的興趣，催生了大量的CD19 和非CD19 靶向性的CAR-T 研究［13-15］，所針對的疾病除了血液系統(tǒng)腫瘤外，還包括多種實體瘤等［16-17］，而所有這些研究都需要細(xì)胞殺傷實驗來證明其有效性。傳統(tǒng)的51Cr 釋放、Europium 標(biāo)記、LDH 代謝產(chǎn)物等殺傷實驗檢測方法都各有缺點，難以同時兼顧便利性和準(zhǔn)確性。

本研究比較了兩種簡便且準(zhǔn)確的殺傷實驗檢測方法：熒光染料雙染流式法和螢火蟲熒光素酶法。熒光染料雙染流式法不需構(gòu)建特殊的靶細(xì)胞系，只需用兩種熒光染料對靶細(xì)胞染色，即可用流式細(xì)胞儀進行殺傷效率檢測，其缺點是在使用貼壁靶細(xì)胞時會因產(chǎn)生過大的誤差而導(dǎo)致實驗失?。晃灮鹣x熒光素酶法對懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞都適用，可用多功能酶標(biāo)儀或活體成像儀檢測，但前提是要先構(gòu)建出表達(dá)熒光素酶（luc）的靶細(xì)胞。有研究者在NK92細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞這種非特異性殺傷的實驗條件下比較了這兩種方法［18］，但并未開展CAR-T細(xì)胞殺傷多種靶細(xì)胞的可行性驗證，本文則是在CD19-CART 細(xì)胞的特異性殺傷實驗中，使用了自然表達(dá)CD19的Raji細(xì)胞、過表達(dá)CD19的K562細(xì)胞兩種懸浮細(xì)胞和一種過表達(dá)CD19 的Malme-3m 貼壁細(xì)胞這3 種靶細(xì)胞，實際檢驗了這兩種方法在各個實驗條件下的表現(xiàn)。兩種方法雖仍各有缺點，但其便利性和準(zhǔn)確性得以兼顧，有望幫研究者降低進入CART領(lǐng)域的門檻，促進CAR-T研究的發(fā)展。

實驗中發(fā)現(xiàn)螢火蟲熒光素酶法在低效靶比條件下，T細(xì)胞對照組有時會出現(xiàn)負(fù)的殺傷結(jié)果，分析可能是加入的T細(xì)胞通過細(xì)胞接觸等機制提高了靶細(xì)胞的代謝水平，進而導(dǎo)致了熒光素酶蛋白的表達(dá)升高。鑒于同組的T細(xì)胞或CAR-T細(xì)胞條件都加入了相同數(shù)量的T 或CAR-T 細(xì)胞，我們認(rèn)為這種統(tǒng)一的背景變化不會影響最終的殺傷結(jié)論。

綜上所述，本研究建立了熒光染料雙染流式法和螢火蟲熒光素酶法兩種CAR-T 殺傷實驗檢測方法，并比較了在靶細(xì)胞為懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞時這兩種方法的可行性和優(yōu)缺點，結(jié)果顯示熒光染料雙染流式法僅適用于懸浮細(xì)胞的殺傷實驗，不適用于貼壁細(xì)胞的情況；而螢火蟲熒光素酶法在靶細(xì)胞為懸浮細(xì)胞或貼壁細(xì)胞的情況下都可以用來檢測殺傷效率。