唐國(guó)偉 李華山 郭明浩 烏達(dá)美

結(jié)直腸癌是一種侵襲性的原發(fā)性腸道惡性腫瘤，其發(fā)病率、死亡率在全球各類(lèi)癌癥中分別高居第三和第二位[1]。盡管早期篩查和根治性手術(shù)顯著提高了5年生存率，但大多數(shù)結(jié)直腸癌患者仍被診斷為晚期[2]。由于缺乏有效的治療手段，晚期患者死亡率較高。因此，尋找新的、有效的治療策略顯得至關(guān)重要。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類(lèi)由外顯子序列反向剪切產(chǎn)生的具有共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)源性RNA，其通過(guò)與微小RNA(miRNA)反應(yīng)元件結(jié)合負(fù)調(diào)控miRNA活性在腫瘤發(fā)生、進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[3,4]。研究顯示，circRNA中心體/紡錘體相關(guān)蛋白基因(circCSPP1)可促進(jìn)人B細(xì)胞淋巴瘤和乳腺癌的進(jìn)展[5,6]。在卵巢癌中，抑制circCSPP1表達(dá)可降低卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[7]。miRNA在腫瘤生物學(xué)進(jìn)程中亦具有重要作用。研究顯示，miR-495-3p在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-495-3p抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用[8]。序列分析發(fā)現(xiàn)circCSPP1與miR-495-3p存在特異性結(jié)合位點(diǎn)。然而，circCSPP1在結(jié)腸癌中的作用及其生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。有氧糖酵解是癌細(xì)胞的典型特征，抑制糖酵解有助于控制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究通過(guò)觀察在結(jié)腸癌組織中circCSPP1、miR-495-3p表達(dá)水平，重點(diǎn)探討circCSPP1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和糖酵解的影響及其與miR-495-3p之間關(guān)系，以期為結(jié)直腸癌治療提供有效靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來(lái)源:收集2017年1月至2018年6月我院收治的結(jié)直腸癌患者41例，手術(shù)切除的癌組織及癌旁組織標(biāo)本?；颊咝g(shù)前均未行抗腫瘤治療。組織標(biāo)本均在術(shù)后0.5 h內(nèi)獲取，液氮保存?zhèn)溆?。本研究在開(kāi)展前已獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者已簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 細(xì)胞與試劑:人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；DMEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；小干擾RNA(si-RNA)、miRNA模擬物(miRNA mimics)、miRNA抑制物(anti-miRNA)、雙熒光素酶報(bào)告載體由廣州復(fù)能基因公司提供；一步法RT-qPCR SuperMix試劑盒購(gòu)于上海聯(lián)邁生物工程有限公司；TRIzol試劑、miRNeasy Mini試劑盒、PrimeScript RT試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)上海弗元生物科技有限公司；乳酸檢測(cè)試劑盒、葡萄糖檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生化科技公司；放射免疫測(cè)定(RIPA)裂解緩沖液、兔抗人細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)抗體、兔抗人p21抗體、兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、山羊抗兔IgG二抗購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):HCT116細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、含5% CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組:將對(duì)數(shù)期HCT116細(xì)胞按照2×105/孔的密度接種到96孔板，細(xì)胞融合度為50%時(shí)更換為不含血清培養(yǎng)基，利用Lipofectamine 2000將si-NC、si-circCSPP1、miR-NC、miR-495-3p mimics、si-circCSPP1+anti-miR-NC、si-circCSPP1+anti-miR-495-3p分別轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，依次記為si-NC組、si-circCSPP1組、miR-NC組、miR-495-3p組、si-circCSPP1+anti-miR-NC組、si-circCSPP1+anti-miR-495-3p組，轉(zhuǎn)染6 h后更換為完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h時(shí)收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè):分別使用TRIzol試劑、miRNeasy Mini試劑盒從組織、HCT116細(xì)胞中提取總RNA和miRNA。取5 μg總RNA與RNase R含量為3 U/μg的20 μl反應(yīng)液孵育37℃孵育15 min，去除線性RNA。使用PrimeScript RT試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用一步法RT-qPCR SuperMix試劑盒進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。2-ΔΔCt法計(jì)算circCSPP1、miR-495-3p相對(duì)表達(dá)量。Circ-CSPP1上游5’-AGCAACAGAGGAACAAGAG-3’，下游5’-GAGAAGGAACAGGATGAACT-3’；內(nèi)參GAPDH上游5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’，下游5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAGAAC-3’；內(nèi)參U6上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.4 細(xì)胞活力檢測(cè):使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力。將各轉(zhuǎn)染組HCT116細(xì)胞按照5×103/孔、100 μl/孔的密度接種96孔板，在24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)取10 μl的CCK-8加至各孔中并孵育4 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm處吸光度(OD)值。

1.2.5 葡萄糖消耗和乳酸產(chǎn)生水平檢測(cè):轉(zhuǎn)染48 h收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，分別按照乳酸檢測(cè)試劑盒、葡萄糖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中的乳酸含量、葡萄糖消耗。

1.2.6 蛋白質(zhì)印記(Western blot)分析:采用RIPA裂解緩沖液裂解6孔板各組細(xì)胞獲得上清液記為細(xì)胞總蛋白。蛋白定量后，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量蛋白質(zhì)樣品，隨后利用濕電轉(zhuǎn)膜儀將已分離的細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。含5%脫脂牛奶的封閉液37℃孵育膜2 h后，加入稀釋的兔抗人CyclinD1抗體、兔抗人p21抗體、兔抗人GAPDH抗體4℃孵育過(guò)夜，隨后用稀釋的山羊抗兔IgG二抗孵育膜2 h。加入化學(xué)發(fā)光底物顯影后，采用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)目的蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):將含有miR-495-3p結(jié)合位點(diǎn)的circCSPP1野生型或突變型序列克隆到熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3獲得雙熒光素酶報(bào)告載體WT-circCSPP1、MUT-circCSPP1。利用Lipofectamine 2000將miR-NC、miR-495-3p mimics分別與WT-circCSPP1、MUT-circCSPP1共轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定轉(zhuǎn)染48 h后共轉(zhuǎn)染細(xì)胞中熒光素酶活性。將pcDNA、pcDNA-circCSPP1、si-NC、si-circCSPP1分別轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞中miR-495-3p表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 circCSPP1和miR-495-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá) 與癌旁組織比較，結(jié)直腸癌組織中circCSPP1表達(dá)顯著升高，miR-495-3p表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 circCSPP1和miR-495-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)

2.2 抑制circCSPP1表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖和糖酵解的影響 與si-NC組比較，si-circCSPP1組HCT116細(xì)胞circCSPP1表達(dá)顯著降低，細(xì)胞活力、CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低，p21蛋白表達(dá)顯著升高，葡糖糖消耗和乳酸產(chǎn)生水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表2。

圖1 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 抑制circCSPP1表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖和糖酵解的影響

2.3 過(guò)表達(dá)miR-495-3p對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖和糖酵解的影響 與miR-NC組比較，miR-495-3p組HCT116細(xì)胞miR-495-3p表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活力、CyclinD1蛋白表達(dá)顯著降低，p21蛋白表達(dá)顯著升高，葡糖糖消耗和乳酸產(chǎn)生水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

表3 miR-495-3p過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖和糖酵解的影響

圖2 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4 circCSPP1靶向調(diào)控miR-495-3p的表達(dá) StarBase數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析結(jié)果顯示，circCSPP1與miR-495-3p存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。miR-495-3p和WT-circCSPP1共轉(zhuǎn)染組HCT116細(xì)胞的熒光素酶活性較miR-NC和WT-circCSPP1共轉(zhuǎn)染組顯著降低(P<0.05)；miR-495-3p和MUT-circCSPP1共轉(zhuǎn)染組HCT116細(xì)胞的熒光素酶活性與miR-NC和MUT-circCSPP1共轉(zhuǎn)染組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。RT-qPCR檢測(cè)顯示，pcDNA-circCSPP1組HCT116細(xì)胞miR-495-3p的表達(dá)水平較pcDNA組顯著降低(P<0.05)；si-circCSPP1組HCT116細(xì)胞miR-495-3p的表達(dá)水平較si-NC組顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表4、5。

圖3 circCSPP1的序列中含有與miR-495-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5 circCSPP1調(diào)控miR-495-3p的表達(dá)

2.5 干擾miR-495-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制circCSPP1表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖和糖酵解的作用 與si-circCSPP1+anti-miR-NC組比較，si-circCSPP1+anti-miR-495-3p組HCT116細(xì)胞miR-495-3p的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活力、CyclinD1蛋白表達(dá)顯著升高，p21蛋白表達(dá)顯著降低，葡糖糖消耗和乳酸產(chǎn)生水平顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表6。

圖4 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表6 干擾miR-495-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)抑制circCSPP1表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞增殖和糖酵解的作用

3 討論

CSPP1最初被證實(shí)與G1/S期進(jìn)程和紡錘體裝配中發(fā)揮作用。circCSPP1是由CSPP1反向剪切形成的circRNA，其通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡，在腫瘤進(jìn)程具有重要功能。肝癌中circCSPP1表達(dá)上調(diào)，circCSPP1表達(dá)水平與肝癌腫瘤大小、臨床病例分期以及不良預(yù)后有關(guān)，circ-CSPP1高表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的體外活力、集落形成、遷移和侵襲能力，是肝癌患者潛在預(yù)后和治療標(biāo)志物[9]。宮頸癌中，抑制circCSPP1表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的增殖和遷移，抑制腫瘤生長(zhǎng)[10]。此外，抑制circCSPP1表達(dá)還可抑制膠質(zhì)瘤和卵巢癌細(xì)胞的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低細(xì)胞遷移和侵襲能力[11]。本研究顯示結(jié)腸癌組織中circCSPP1表達(dá)顯著上調(diào)。轉(zhuǎn)染特異性si-circCSPP1抑制circCSPP1表達(dá)可降低HCT116細(xì)胞的增殖能力、降低CyclinD1表達(dá)水平，升高p21表達(dá)水平。CyclinD1和p21是細(xì)胞周期進(jìn)程中的重要調(diào)控蛋白，CyclinD1結(jié)合并激活細(xì)胞周期蛋白激酶(CDKs)觸發(fā)Rb磷酸化使細(xì)胞周期向S期推進(jìn)發(fā)揮增殖促進(jìn)作用，而p21抑制CyclinD1/CDKs復(fù)合物活性發(fā)揮抗增殖作用[12]。即使在常氧條件下癌細(xì)胞依然會(huì)消耗葡萄糖產(chǎn)生乳酸進(jìn)行糖酵解，這是癌細(xì)胞的重要代謝特征[13]。糖酵解除提供能量外，還可產(chǎn)生代謝中間體促進(jìn)生物合成代謝提高腫瘤細(xì)胞在酸性腫瘤微環(huán)境中的生存優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而維持其干細(xì)胞特性并促進(jìn)腫瘤免疫逃逸[14]。本研究顯示，抑制circCSPP1表達(dá)可降低葡萄糖消耗量和乳酸產(chǎn)生量，抑制糖酵解。因此，抑制circCSPP1可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力，抑制糖酵解反應(yīng)。

研究顯示，Hsa_circRNA_103809通過(guò)負(fù)調(diào)控miR-532-3p表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移[15]。通過(guò)上調(diào)miR-597-5p表達(dá)可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的DNA修復(fù)能力，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)circCSPP1與miR-495-3p存在相互作用。已有研究表明，miR-495-3p在胃癌、黑色素瘤、透明腎細(xì)胞癌具有抑癌作用，過(guò)表達(dá)miR-495-3p能夠降低癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[17-19]。本研究顯示結(jié)腸癌組織中miR-495-3p表達(dá)顯著降低，過(guò)表達(dá)miR-495-3p可抑制HCT116細(xì)胞增殖和糖酵解反應(yīng)，與抑制circCSPP1表達(dá)的抗腫瘤作用一致。進(jìn)一步雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和RT-qPCR檢測(cè)證實(shí)circCSPP1靶向負(fù)調(diào)控miR-495-3p表達(dá)。此外，抑制miR-495-3p表達(dá)能夠挽救circCSPP1低表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞增殖和糖酵解的抑制作用?；谏鲜鼋Y(jié)果，本研究推斷circCSPP1靶向miR-495-3p參與調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和糖酵解反應(yīng)。

綜上所述，circCSPP1在結(jié)直腸癌中呈高表達(dá)，抑制circCSPP1可降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力，抑制糖酵解反應(yīng)，其機(jī)制與靶向調(diào)控miR-495-3p表達(dá)有關(guān)，因此circCSPP1有望成為結(jié)直腸癌治療的潛在靶點(diǎn)。