劉明麗 金鳳梅 周靜江 曹宇霏 馬清杰 王尉 劉哲 陳利娜 閻澤君

人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)是一種嚴重威脅人類安全的病原體，能特異性攻擊人體免疫系統(tǒng)(特別T淋巴系統(tǒng))，造成人體免疫系統(tǒng)不可逆性缺陷，誘發(fā)各種機會性感染及腫瘤發(fā)生率，嚴重影響患者身心健康和生命安全[1,2]。其常見傳播途徑包括性接觸傳播、血液傳播、母嬰傳播，血液傳播是HIV傳播的主要途徑，如何降低輸血傳染性殘余風險、保障輸血使用安全，是全社會共同關(guān)注的問題[3]。因HIV檢測“窗口期”較長、病毒變異、免疫靜默感染等因素的影響，酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linded immunosorbent assays,ELISA)檢測有“弱陽性標本”漏檢的風險[4,5]。核酸檢測(nucleic acid test,NAT)通過擴增靶核酸或其攜帶的特異性DNA或RNA片段，可將極微量的核酸轉(zhuǎn)化為直觀的光電等可視信號，能有效縮短病毒檢測“窗口期”，提高檢測效能[6,7]。ELISA、NAT聯(lián)合篩查已成為我國采供血機構(gòu)HIV的篩查策略，能夠提高HIV檢出率、減少血液資源浪費、保障輸血安全[8,9]。本文通過回顧性分析2018至2019年承德市中心血站77 886例無償獻血者血液樣本相關(guān)檢測數(shù)據(jù)，以蛋白印跡法(westem blot,WB)為“金標準”，探討ELISA、NAT在檢測HIV中的應用價值，旨在為基層中心血站HIV檢測提供參考。

1 對象與方法

1.1 調(diào)查對象 回顧性分析2018至2019年承德市中心血站77 886例無償獻血者血液樣本相關(guān)檢測數(shù)據(jù)，所有獻血者健康體檢符合中華人民共和國衛(wèi)生和計劃生育委員會等《BG18467-2011獻血者健康檢查要求》[10]標準。男46 594例，女31 292例；年齡21～56歲，平均(35.64±6.12)歲。其中初次獻血者49 675例，≥2次獻血者28 211例。

1.2 標本采集 每位獻血者采集3管5 ml血液標本，4 h內(nèi)3 000 r/min離心10 min取血清，保存于2℃～8℃下，72 h完成相關(guān)檢測。

1.3 試劑與儀器 (1)第3代ELISA檢測試劑盒購自英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司，第4代ELISA檢測試劑盒購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，NAT檢測試劑上?？迫A生物工程有限公司；WB試劑盒購自新加坡MP生物醫(yī)學亞太私人公司。(2)離心機：德國Sigma公司Sigma-6K15型；全自動加樣儀：瑞士HAMILTON公司STAR 8CH型；全自動酶免分析系統(tǒng)：瑞士MAMILTON公司FAME24/20、FAME24/30、深圳愛康Uranus AE 280；核酸檢測系統(tǒng)：瑞士HAMILTON公司STAR提取系統(tǒng)、ABI7500擴增儀。

1.4 檢測方法 (1)血清學檢測：采用第3代、第4代ELISA進行HIV抗原或抗體檢測，兩種ELISA檢測試劑均呈無反應性則判定該標本為ELISA無反應性。任意1種試劑呈陽性反應，采用該試劑進行雙孔復試，雙孔復試均有陽性反應或單孔有陽性反應，則判定為ELISA反應性；如2種試劑均呈陽性反應性則判定為ELISA反應性。(2)病毒核酸檢測：采用PCR-熒光法進行核酸檢測，檢測模式采用混樣-折分模式或單樣本檢測。如混樣出現(xiàn)反應性則進行拆分檢測，若仍有反應性且ELISA有反應，則送至承德市疾病預防控制中心進行WB確認，若仍有反應性且ELISA無反應性，則進行追蹤檢測。

1.5 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，所有計數(shù)資料以頻數(shù)或率表示，采用χ2檢驗或秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA、NAT檢測反應性及WB確證結(jié)果分析 77 886份樣本中，第3代ELISA單試劑反應性35例，反應率0.45‰；第4代ILISA單試劑反應性41例，反應率0.57‰；第3、4代ELISA雙試劑反應性28例，反應率0.36‰；NAT反應31例，反應率0.40‰；WE確證29例，確證率0.37‰。見表1。

表1 2018至2019年無償獻血者ELISA、NAT檢測反應及WB確證結(jié)果 例(‰)

2.2 NAT反應性與ELISA檢測單雙反應性符合率分析 NAT與第3代、4代ELISA單試劑與雙試劑反應性有良好的陽性及陰性符合率。見表2。

表2 NAT反應性與與ELISA檢測單反應性、雙反應比較 例

2.3 NAT反應與ELISA檢測總反應性分析 107例反應性樣本中，NAT檢出31例，ELISA檢出104份。其中NAT在ELIAS無反應性樣本中檢出3例，WB確認2例，ELIAS檢測HIV殘余風險為1：38943。NAT(+)ELISA(+)、NAT(+)ELISA(-)檢出率高于ELISA(+)NAT(-)檢出率(χ2=89.204,33.739,P<0.05)。見表3、4。

表3 NAT反應性與ELISA檢測總反應性比較 例

2.4 ELISA單反應性及NAT反應性檢測效果分析 以WB確證結(jié)果為“金標準”，第3代ELISA單反應靈敏度、特異度分為為82.7586%、99.9859%，第4代ELISA單反應靈敏度、特異度分別為86.2069%、99.9794%，NAT反應性靈敏度、特異度分別為96.5517%、99.9961%。NAT反應性靈敏度高于第3代ELISA單反應靈敏度(χ2=4.062,P<0.05)，特異度高于第3代、第4代反應特異度(χ2=5.401,8.896,P<0.05)。見表5。

表4 NAT與ELISA檢測反應者驗證結(jié)果 例

表5 ELISA單反應性與NAT反應性檢測效果

3 討論

我國無償獻血人數(shù)和采血量已保持連續(xù)23年增長，2018年獻血人次高達1 500萬[11]，如何保證血液安全特別是血液本身質(zhì)量的安全，是全社會共同關(guān)注的問題。血液傳播是各類傳染病感染的一種重要途徑，輸血也成為傳染病傳播的一種特殊方式。加強無償獻血者血液篩查力度，能夠有效防范因輸血罹患傳染病的風險[12]。我國《血站技術(shù)操作規(guī)程(2019版)》[13]檢測策略明確要求，HIV感染標志物應至少各進行1次核酸、血清學檢測，抗HIV陰性血液才可以應用于臨床。

ELISA為免疫學經(jīng)典檢測實驗，將可溶性抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體表面，借助抗原抗體特異性免疫反應，進行定性定量檢測。ELISA是血液HIV感染常用篩查方法，廣泛應用于我國各級中心血站血液檢測中。其特點是檢測快速、靈敏度較高、費用較低。盡管ELISA技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到第四代，但檢測HIV抗體“窗口期”仍為22 d[14,15]。ELISA檢測目標為血液中病毒抗原，如果病毒仍處于“窗口期”，ELISA難以進行有效檢測，HIV“窗口期”較長，ELISA檢測易出現(xiàn)漏診風險[16]。同時病毒滴度、免疫沉默性感染、病毒變異等各種因素的影響，ELISA檢測仍存在輸血相關(guān)感染的風險。本文研究中，77 779份ELIAS無反應性樣本中，NAT檢出3例，WB確認2例，ELIAS檢測HIV殘余風險為1∶38 943。低于吳敬林等[17]報道的1∶32 605(廣西柳州)，高于陳艷萍[18]報道的1∶67 307(深圳地區(qū))，可能與不同地區(qū)HIV感染情況、獻血人群組成、數(shù)據(jù)采集時間段等因素有關(guān)，但能夠說明因HIV感染“窗口期”較長，ELISA檢測易發(fā)生漏檢，仍有輸血殘余風險發(fā)生的可能。

NAT也稱病毒核酸擴增技術(shù)，利用DNA“高溫變性、低溫復性、中溫延伸”的變化規(guī)律，95℃變性為單鏈，60℃左右引物與單鏈按堿基互補配對，72℃(DNA聚合酶最適反應溫度)DNA聚合酶沿磷酸到五碳糖方向合成互補鏈。可使DNA迅速擴增，極大縮短檢測窗口期(22 d縮短為11 d)[19]。利用物理、化學、生物學等方法，直接擴增靶核酸或攜帶的特異性DNA或RNA片段，使肉眼不可見的極微量核酸轉(zhuǎn)變?yōu)橹庇^光電或可視信號，以檢測標本中是否存在相應病原體[20]。不論是聚合酶鏈反應(PCR)、轉(zhuǎn)錄介導擴增(TMA)、核酸序列依賴擴增(NASBA)，均能夠至少縮短HIV感染“窗口期”7 d以上，這樣可以篩查早期急性病毒感染的獻血者，進一步降低經(jīng)輸血傳播疾病的風險[21,22]。而且NAT反應性、ELISA反應性與WB確認有良好的符合關(guān)系[23]。本文研究中，NAT(+)ELISA(+)檢出符合率92.86%(26/28)、NAT(+)ELISA(-)檢出符合率66.67%(2/3)高于ELISA(+)NAT(-)檢測符合率1.32%(1/77)(χ2=89.204,33.739,P<0.05)。所得結(jié)論也支持上述文獻觀點。

進一步分析表明，77 886份樣本中，第3代ELISA反應性35例，第4代ILISA反應性41例，第3、4代ELISA雙反應性28例，NAT反應31例。以WE確證(29例)為金標準，第4代ELISA靈敏度86.2069%略高于第3代ELISA 82.7586%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與何成濤等[24]文獻報道基本相似。同時NAT反應性靈敏度96.5517%高于第3代ELISA 82.7586%，特異度99.9961%高于第3代ELISA 99.9859%、第4代ELISA 反應99.9794%(P<0.05)。湛玉武[25]也有類似的文獻報道，說明NAT篩查HIV效能優(yōu)于ELISA。需要指出的，NAT檢測對象為RNA，RNA提取與保存是最難控制的環(huán)節(jié)，操作過程中易受到污染，極其微量的污染就會出現(xiàn)假陽性率和復測無反應性等問題[26,27]。因此建議基層血站在篩查HIV感染中，盡量采用ELISA聯(lián)合NAT檢測，以提高診斷檢測準確率。

相關(guān)研究表明，NAT與ELISA在血液篩查中有較好的互補性[28,29]。(1)ELISA以病原體抗原、抗體為檢測對象，病毒進入體內(nèi)產(chǎn)生能夠檢測的抗體需要較長時間，明顯延長了檢測窗口期。NAT技術(shù)以病原體核酸為檢測對象，可縮短窗口期漏檢誤檢風險。(2)外周血中病原存在間歇性現(xiàn)象導致病毒載量降低，若低于NAT檢出水平，也會導致NAT漏檢風險。而窗口期延長病毒感染會增加血液中抗體或抗原體滴度，不會影響ELISA檢出水平[30,31]。(3)抗體需要免疫應答才能產(chǎn)生，當機體對病原體刺激無應答反應時，會增加相應抗體ELISA漏檢的風險。NAT以病原體核酸為檢測對象，不受免疫靜默感染的影響[32]。(4)ELISA通過抗原體反應識別“靶目標”，NAT依靠引物與探針識別“靶目標”，二者均難以保證病毒變異的檢出率[33]。也就是說，ELISA、NAT在HIV篩查中均由自己的局限性，同時兩種方法也有良好的互補性，這也NAT聯(lián)合ELISA能夠提高HIV檢出率的理論基礎(chǔ)。

本文研究結(jié)果表明，NAT反應性、ELISA反應性與WB確證有良好的符合關(guān)系，NAT檢測能夠縮短檢測“窗口期”，與ELISA平行檢測能夠降低HIV殘余風險，保障輸血使用安全性。需要指出的是，本文僅為單中心回顧性研究，也未對ELISA單反應性、雙反應性殘余風險的分析，同時也未進行ELISA、NAT聯(lián)合檢測HIV的比較。需要后續(xù)擴大樣本、進行多中心前瞻性研究，以獲取更客觀、更有說服力的結(jié)論，為基層血站制定血液檢測策略提供參考。