李洪媛，馬美榮，周林艷，劉天成，劉小改，王小偉，張 坤

（北京紅星股份有限公司，北京 101400）

混菌發(fā)酵是指采用兩種及以上菌株進(jìn)行混合發(fā)酵，利用微生物之間酶系的協(xié)同作用，有效提高酶活力，提高原料的利用率，降低其生產(chǎn)成本，本研究主要探究根霉和酵母混合培養(yǎng)制曲對于原酒品質(zhì)的影響。產(chǎn)酯能力較強(qiáng)的菌種有產(chǎn)酯酵母、紅曲霉、根霉、毛霉等[1]，其中產(chǎn)酯酵母可以增酯，提升酒的質(zhì)量。在發(fā)酵過程中，可通過代謝和自溶，參與風(fēng)味物質(zhì)的生成，豐富酒體的香氣[2]。根霉在生長過程中能產(chǎn)生大量的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶，而且還能產(chǎn)生檸檬酸、葡萄糖酸、乳酸、琥珀酸等有機(jī)酸。少數(shù)根霉如少孢根霉、華根霉，具有較強(qiáng)的合成脂肪酶的能力[3]。

根霉在與其他菌種混合培養(yǎng)時表現(xiàn)出一種極好的“團(tuán)結(jié)性”，能與不同來源的菌類在曲坯上以共生、拮抗等方式雜居在一起，而且不僅僅是“和平共處”，還能一枝獨(dú)秀，這就明顯區(qū)別于曲霉的“孤獨(dú)”[3]。根霉缺乏酸性羧基蛋白酶(羧肽酶)，在熟料上生長時，不能分解利用加熱變性蛋白質(zhì)，而一旦缺乏有機(jī)氮，則會影響菌絲的生長和產(chǎn)酶酶活[4]。根霉在與酵母混合培養(yǎng)時，酵母含有多種蛋白酶可分解利用熟料中的蛋白質(zhì)，同時酵母衰老死亡的菌體中含有大量的氮源可供根霉生長。酵母菌缺少淀粉酶和糖化酶，因此二者共生時酵母可以通過根霉分解淀粉類原料獲取生長更易利用的碳源，同時根霉菌可利用淀粉產(chǎn)生多種有機(jī)酸類物質(zhì)，酵母含酒化酶產(chǎn)乙醇等醇類物質(zhì)，在根霉酯化酶、酵母酯化酶的作用下合成酯類物質(zhì)，達(dá)到互利共生、增酯添香的目的。

本研究旨在通過優(yōu)選性能優(yōu)良的酵母菌、根霉菌，并研究適宜的混合培養(yǎng)方式，最終使用圓盤進(jìn)行大規(guī)模制曲并應(yīng)用于發(fā)酵實驗，達(dá)到降低制曲成本，縮短制曲時間，提高原酒酯類物質(zhì)含量，增加原酒香氣成分，提升品質(zhì)的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酵母菌株：J4、J34、J35、J38、J39、J40、J42，北京紅星股份有限公司從清香型大曲、酒醅中分離并保存；根霉菌株：R1、R29、R36、R37、R38、R41、R46、R47，北京紅星股份有限公司從清香型大曲、酒醅中分離并保存；釀酒酵母、UV-11 麩曲：北京紅星股份有限公司釀造車間提供。釀酒干酵母：安琪酵母股份有限公司。

玉米粉：市售；麩皮、高粱粉、酒糟、稻殼：北京紅星股份有限公司釀造車間提供。

酚酞：福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉：北京化工廠有限責(zé)任公司；乙醛、甲醇、正丙醇、乙酸乙酯、異丁醇、乳酸乙酯：中國計量科學(xué)研究院國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源庫；乙酸正戊酯：西格瑪奧德里奇(上海貿(mào)易有限公司)。

酒尾發(fā)酵培養(yǎng)基：酒糟與水按質(zhì)量比1∶4 混合均勻后蒸煮10 min 后過濾，在浸出液中加入10%白酒蒸餾酒尾，酒尾酒精度為25%vol，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min[5]。

YPD 液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，121 ℃滅菌20 min。麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽浸粉20 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母浸膏1 g/L，121 ℃滅菌20 min。

麩皮培養(yǎng)基：麩皮∶蒸餾水=1∶1，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min[6]。

儀器設(shè)備：GC-2010 plus氣相色譜(gas chromatography，GC)儀，日本島津公司；CJ-2DFS 凈化工作臺，天津市泰斯特儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JJ6000 型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；DMA5000M全自動密度儀，安東帕公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母及根霉菌種優(yōu)選

選取紅星公司分離于清香型大曲、酒醅中的部分酵母和根霉菌種進(jìn)行性能研究試驗，酵母菌株采用酒尾發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵驗證產(chǎn)乙酸乙酯能力[5]，根霉菌種制純種麩曲后檢測成曲的糖化力、酯化力。

1.2.1.1 酵母種子培養(yǎng)

自保藏斜面培養(yǎng)基挑取1 環(huán)酵母接種于裝有YPD 液體培養(yǎng)基的試管中，28 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)完成后按照10%（V/V)的接種量轉(zhuǎn)接于裝有YPD 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，裝液量100 mL/500 mL，28 ℃培養(yǎng)24 h，作為種子液備用。

1.2.1.2 酵母菌種生長曲線測定

取1.2.1.1 酵母菌種子液以10%（V/V) 的接種量轉(zhuǎn)接于裝有YPD 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，裝液量100 mL/500 mL，30 ℃靜止培養(yǎng)24 h，每隔1 h 取發(fā)酵液測定其OD600nm值，以時間為橫坐標(biāo)、OD600nm值為縱坐標(biāo)繪制酵母菌生長曲線[7]。

1.2.1.3 酵母菌產(chǎn)乙酸乙酯能力測定

將酵母種子液按10%（V/V)的接種量轉(zhuǎn)接于酒尾發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d，最終取發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾并通過氣相色譜檢測乙酸乙酯含量。

1.2.1.4 根霉純種麩曲制作

制備根霉種曲用三角瓶麩皮培養(yǎng)基：將保藏于斜面上的純種根霉菌接種于三角瓶麩皮培養(yǎng)基內(nèi)，裝料量30 g 干麩皮/500 mL 三角瓶，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d。將三角瓶原菌接種于滅過菌的麩皮培養(yǎng)基上，使用淺盤培養(yǎng)，裝料量600 g干麩皮/盤，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h，制成純種根霉麩曲[8]。

1.2.2 根霉酵母菌種組合優(yōu)化

1.2.2.1 根霉酵母菌種組合優(yōu)化實驗表

對1.2.1 中篩選得到的優(yōu)良酵母與根霉菌種進(jìn)行優(yōu)化組合實驗，設(shè)計的實驗表見表1。

表1 根霉酵母菌種組合優(yōu)化實驗表

1.2.2.2 混合培養(yǎng)麩曲制作

（1）制備麥汁培養(yǎng)基，將保藏于斜面上的純種酵母菌種接種于滅菌后的麥汁培養(yǎng)基內(nèi)，裝液量100 mL/500 mL，30 ℃搖床培養(yǎng)24 h，制成純種液體酵母[9]。

（2）制備三角瓶麩皮培養(yǎng)基，裝料量30 g 干麩皮/500 mL 三角瓶，接種純種根霉于滅菌后的三角瓶麩皮培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d，制成純種根霉三角瓶種曲。

（3）制作淺盤麩皮培養(yǎng)基，單盤裝料量600 g(以絕干計）。同時接種相應(yīng)純種液體酵母和純種根霉三角瓶種曲，接種量分別為6%～8%和0.6%～0.8%。30 ℃培養(yǎng)28～32 h，培養(yǎng)12 h 后每4～6 h劃曲1次，制成酵母-根霉混合培養(yǎng)麩曲。

1.2.2.3 混合培養(yǎng)麩曲不銹鋼桶釀酒實驗

選用不銹鋼發(fā)酵桶作為發(fā)酵容器[10]，設(shè)置投糧量為1 kg，糧醅比為1∶4，糧糠比為1∶0.25，發(fā)酵周期為7 d，發(fā)酵排次為3 排。對照糖化發(fā)酵劑組成：UV-11麩曲9%，釀酒干酵母0.03%；混合麩曲實驗糖化發(fā)酵劑組成：UV-11 麩曲6%，釀酒干酵母0.03%，混合麩曲4%。發(fā)酵結(jié)束后蒸酒，對酒樣進(jìn)行乙酸乙酯檢測。

1.2.3 根霉酵母混合麩曲不同培養(yǎng)方式對釀酒的影響

根霉麩曲制作：同1.2.1.4。

酵母麩曲制作：將1.2.1.1 培養(yǎng)得到的液態(tài)酵母接種于滅過菌的淺盤麩曲上，28 ℃恒溫培養(yǎng)20 h左右，每4～6 h劃曲一次，制成酵母麩曲。

根霉酵母混合培養(yǎng)麩曲制作：同1.2.2.2。

根霉酵母混合麩曲不同培養(yǎng)方式釀酒實驗：根霉酵母混合麩曲釀酒的糖化發(fā)酵劑配方見表2，發(fā)酵設(shè)備、工藝條件同1.2.2.3，共進(jìn)行5排實驗。發(fā)酵結(jié)束后蒸酒，計算出酒率，對酒樣采用氣相色譜進(jìn)行乙酸乙酯、乳酸乙酯等理化分析，確定根霉酵母混合麩曲培養(yǎng)方式對原酒品質(zhì)的影響。

表2 根霉酵母混合麩曲實驗室釀酒實驗糖化發(fā)酵劑配比

1.2.4 根霉酵母混合麩曲釀酒中試實驗

1.2.4.1 根霉酵母混合麩曲圓盤培養(yǎng)

根霉原菌、三角瓶曲種制備及酵母液體種子培養(yǎng)參照1.2.1.1—1.2.1.3。以種曲機(jī)培養(yǎng)根霉種曲，三角瓶曲種接種量為0.7%（以麩皮計）。圓盤制曲機(jī)制作混合麩曲：根霉種曲接種量為0.6%～0.8%，酵母用量6.5%～8%（以麩皮計），根霉和酵母分別采用固態(tài)接種和液態(tài)接種方式同時接種至圓盤麩皮培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)32 h（0～12 h，28～30 ℃；12～24 h，30～33 ℃；24～32 h，32～36 ℃），在培養(yǎng)12～32 h期間，每6～8 h翻曲1次。

1.2.4.2 根霉酵母混合麩曲釀酒發(fā)酵應(yīng)用

麩曲清香型麩曲生產(chǎn)工藝如圖1 所示[11]，按照糖化發(fā)酵劑組成分為對照組和實驗組進(jìn)行發(fā)酵實驗。

圖1 根霉酵母混合麩曲發(fā)酵實驗流程圖

對照組：UV11 麩曲8%、釀酒酵母3.5%，出入池要求同生產(chǎn)，發(fā)酵期為7 d。實驗組：UV11 麩曲8%，根霉酵母混合麩曲2.5%，釀酒酵母3%。出入池要求同生產(chǎn)，發(fā)酵期為7 d。

記錄每排的出酒率，并用氣相色譜分析酒樣的風(fēng)味成分。

1.2.5 分析檢測

1.2.5.1 乙酸乙酯、乳酸乙酯等風(fēng)味成分分析

色譜條件：DB-WAX UI 石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.5 μm）；氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）檢測器，檢測器溫度240 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：35 ℃保持4 min，以5 ℃/min 升至100 ℃，再以10 ℃/min 升至230 ℃，保持13 min；載氣為氮?dú)猓∟2）；吹掃流量為3 mL/min；分流比為1∶30。載氣流速：氮?dú)?6.5 mL/min，氫氣40 mL/min，空氣400 mL/min。根據(jù)保留時間定性，采用內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)物為叔戊醇（質(zhì)量濃度198.27 mg/L）、乙酸正戊酯（質(zhì)量濃度174.93 mg/L）和2-乙基丁酸（質(zhì)量濃度198.20 mg/L）。

1.2.5.2 麩曲酸度測定

稱取試樣10 g（精確至0.01 g）于250 mL 燒杯中，準(zhǔn)確加水100 mL，于室溫下浸泡30 min（每隔10 min攪拌1次），用脫脂棉過濾后的清液進(jìn)行酸度測定[12]。

酸度定義：每100 g 曲消耗0.1 mmol/L 氫氧化鈉的毫升數(shù)，消耗1毫升記為1°T。

1.2.5.3 麩曲糖化力測定

稱取5 g 麩曲，加入90 mL 水和10 mL 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，攪勻。35 ℃水浴1 h，用脫脂棉過濾，棄去最初5 mL，接收其余澄清濾液進(jìn)行淀粉酶解糖測定，測定方法參照斐林定糖法[13]。

式中：V0表示加空白溶液后消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積，mL；V 表示加紅曲糖化液后消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積，mL；C 表示標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液濃度，g/mL；糖化酶活力單位為U。

糖化酶活力單位：1.0 g 干曲在35 ℃、pH4.6 條件下，反應(yīng)1 h，將可溶性淀粉分解為葡萄糖1 mg所需的酶量稱為1個酶活力單位(U/g)。

1.2.5.4 麩曲酯化力檢測

酯化力檢測方法借鑒QB/T 4257—2011釀酒大曲通用分析方法[14]。

1.2.5.5 混合麩曲酵母計數(shù)

采用直接計數(shù)法（血球計數(shù)板計數(shù)法）[15]。

1.2.5.6 麩曲感官評定

由8 位具有專業(yè)知識的技術(shù)人員(年齡20～50歲，5 男3 女，高級釀酒師5 人，釀酒師3 人)取培養(yǎng)成熟的麩曲觀察成曲顏色、表面及斷面生長情況，并聞其香氣情況，有無雜菌污染[16]。

1.2.5.7 酒樣酒精度測定

樣品使用Anton Paar DMA 5000 M全自動密度儀進(jìn)行自動檢測。

1.2.5.8 原料出酒率的測定

原料出酒率=折算為65%vol 原酒產(chǎn)量/原料用量×100%。

1.2.5.9 酒樣感官評價

根據(jù)GB/T 33404—2016 白酒感官品評導(dǎo)則進(jìn)行品評描述。由9 位具有專業(yè)知識的技術(shù)人員(年齡20～40 歲，5 男4 女，國家品酒評委4 人，一級品酒師2人，二級品酒師2人，三級品酒師1人)從原酒風(fēng)味方面進(jìn)行感官評分[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母優(yōu)選

2.1.1 酵母菌生長曲線測定(圖2)

圖2 酵母菌生長曲線

由圖2 可知，在同樣初始接種量的情況下，菌株J35、J38在培養(yǎng)6 h左右進(jìn)入對數(shù)生長期，菌株J4在培養(yǎng)7 h 左右進(jìn)入對數(shù)生長期，菌株J34、J39、J42在培養(yǎng)8 h左右進(jìn)入對數(shù)生長期，J40 在培養(yǎng)10 h 左右進(jìn)入對數(shù)生長期。菌株J40在培養(yǎng)14 h達(dá)到平穩(wěn)期，菌株J4、J35、J38、J42培養(yǎng)16 h達(dá)到平穩(wěn)期，菌株J39在培養(yǎng)17 h達(dá)到平穩(wěn)期，菌株J34在培養(yǎng)18 h達(dá)到平穩(wěn)期。J4、J35、J40、J42 的光密度穩(wěn)定值較高，考慮到根霉在20～32 h 生長期產(chǎn)酶的特性[18]，為配合酵母與根霉共同培養(yǎng)，選擇對數(shù)期穩(wěn)定期相對靠后，且生命活性相對旺盛的酵母菌株：J4、J42。

2.1.2 酵母產(chǎn)乙酸乙酯能力測定(圖3)

圖3 不同酵母乙酸乙酯產(chǎn)量

由圖3 可知，在酒尾培養(yǎng)基中具有高產(chǎn)乙酸乙酯能力的菌株包括：J4、J38、J42。

根據(jù)產(chǎn)乙酸乙酯能力及生長情況，選擇J4、J38、J42作為后續(xù)組合菌種。

2.2 根霉優(yōu)良菌株篩選(表3)

表3 根霉菌性能鑒定

由表3 可知，根霉菌株中產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的菌株有R36、R38、R46，產(chǎn)糖化酶活力較高菌株有R1、R38、R41、R46、R37，產(chǎn)酯能力較強(qiáng)菌株有R1、R37、R38。3 種性能都較為優(yōu)良的菌株有R1、R37、R38，選擇這3個菌種為后續(xù)組合菌種。

2.3 根霉酵母菌種組合優(yōu)化(表4)

表4 根霉酵母菌種組合優(yōu)化結(jié)果

對2.1 和2.2 篩選出性能較為優(yōu)良的酵母J4、J38、J42，根霉R1、R37、R38 進(jìn)行組合優(yōu)化釀酒實驗，實驗重復(fù)3排，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

上述實驗數(shù)據(jù)顯示：J4+R1、J38+R38 和J42+R1的組合形式增酯效果較為顯著。對該實驗的因變量進(jìn)行拆解，利用SPSS 軟件進(jìn)行多因素方差分析，分析結(jié)果見表5。

表5 主體效應(yīng)檢驗表

通過多因素方差分析得到：影響酯化力的因素中酵母菌種＞根霉菌種＞根霉酵母混合。因此在3組實驗配方挑選上優(yōu)先考慮酵母產(chǎn)酯能力更為突出的J4 組合。最終采用J4+R1 作為根霉酵母麩曲菌種進(jìn)行生產(chǎn)中試實驗。

2.4 根霉酵母混合麩曲不同培養(yǎng)方式對釀酒的影響

對不同培養(yǎng)方式得到的根霉酵母混合麩曲進(jìn)行釀酒實驗，原酒理化指標(biāo)、出酒率等結(jié)果見表6。實驗組酒樣乙酸乙酯含量比對照組乙酸乙酯含量提升明顯，提升值在0.34～0.36 g/L。實驗組一和實驗組二的乙酸乙酯產(chǎn)量較為相近，但實驗組二的出酒率較高，即根霉酵母混合培養(yǎng)麩曲與兩者單獨(dú)培養(yǎng)制曲再混合使用所產(chǎn)酒樣的乙酸乙酯含量較接近。實驗組二出酒率更高的原因可能是實驗組一的根霉麩曲添加量為2%，實驗組二混合麩曲的添加量為4%，實驗組二根霉的用量可能相對較大，因根霉具有優(yōu)良的糖化、發(fā)酵性能，有利于出酒率提高。結(jié)合出酒率和酒樣乙酸乙酯含量，確定根霉酵母混合曲采用兩者混合培養(yǎng)制曲方式。

表6 根霉酵母混合麩曲不同培養(yǎng)方式的釀酒實驗結(jié)果

2.5 根霉酵母混合麩曲釀酒中試實驗

2.5.1 根霉酵母成曲感官評價質(zhì)地松軟，呈灰黃色，略有酯香，內(nèi)外一致，無雜菌感染，無污染現(xiàn)象，鏡檢可見明顯酵母細(xì)胞和根霉菌絲。

2.5.2 根霉酵母混合麩曲成曲理化指標(biāo)分析(表7)

表7 根霉酵母混合麩曲成曲理化指標(biāo)分析

表7 是2019 年11 月—2021 年5 月間根霉酵 母混合麩曲15 排次成曲的持續(xù)追蹤結(jié)果，成曲中酵母菌數(shù)均值可達(dá)32×108個/g 左右，糖化力在500 U左右。

2.5.3 根霉酵母混合麩曲發(fā)酵應(yīng)用結(jié)果

2019 年11 月—2021 年5 月根霉酵母混合麩曲發(fā)酵實驗產(chǎn)酒及對照產(chǎn)酒情況見圖4，根霉酵母混合麩曲的添加可以增加原酒乙酸乙酯含量，原酒乙酸乙酯由0.90 g/L 提升至1.52 g/L，出酒率由46.15%提升至47.67%。

圖4 根霉酵母混合麩曲2019年11月—2021年5月發(fā)酵實驗結(jié)果

2.5.4 酒樣風(fēng)味成分分析

對照組和實驗組酒樣的風(fēng)味成分分析結(jié)果見表8。實驗組與對照組相比乙酸乙酯含量增加明顯，其他酯類如乳酸乙酯等略有提升。乙酯類物質(zhì)如乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸乙酯等對清香型白酒香氣強(qiáng)度值高，為原酒增香起到重要作用[20]。酸類化合物中乙酸、辛酸等含量略有增加，酸類化合物含量增加，可能是根霉具有產(chǎn)多種有機(jī)酸的能力，如L-乳酸、L-蘋果酸、富馬酸、乳酸等[21]。高級醇（正丙醇、異戊醇等）含量未有明顯提升?？墒咕瓢l(fā)甜的醇類物質(zhì)含量有所增加。

表8 根霉酵母混合麩曲發(fā)酵實驗原酒風(fēng)味成分分析結(jié)果 (mg/L)

2.5.5 實驗酒樣品評

組織10 名品酒師(包括4 名國家級評酒委員)對酒樣進(jìn)行品評，品評結(jié)果見表9。從酒樣品嘗結(jié)果來看，在清香型麩曲白酒發(fā)酵過程中應(yīng)用根霉酵母混合麩曲，實驗組比對照組酯香突出，入口醇甜感較突出，增加了酒體柔順、醇厚感。

表9 根霉酵母混合麩曲酒樣嘗評結(jié)果表

3 結(jié)論

本研究通過菌種性能優(yōu)選實驗及菌種組合釀酒實驗，篩選出生長速率較為適宜且高產(chǎn)乙酸乙酯的J4 酵母和高產(chǎn)糖化酶、酯化酶的R1 根霉菌。通過釀酒小試實驗確定制曲采用混合培養(yǎng)方式，即在麩皮培養(yǎng)基上同時接種酵母和根霉菌，接種量分別為6%～8%和0.6%～0.8%。經(jīng)過中試實驗確定了適用于圓盤制曲培養(yǎng)的參數(shù)條件。通過多排次成曲質(zhì)量跟蹤檢測和生產(chǎn)發(fā)酵實驗驗證，混合麩曲中酵母數(shù)量可達(dá)32×108個/g 麩曲，糖化力500U 左右，應(yīng)用于麩曲清香型白酒生產(chǎn)，在統(tǒng)計期內(nèi)，乙酸乙酯含量由0.90 g/L 提升到1.52 g/L，出酒率提升1.52%。根霉酵母混合麩曲的制備及應(yīng)用提升了原酒乙酸乙酯含量，增加了原酒的酯香、醇甜感、柔順、醇厚感。后期將嘗試使用近紅外光譜儀大數(shù)據(jù)建模的方式建立成曲酯化力、糖化力快速檢測手段，把控生產(chǎn)過程中各階段理化指標(biāo)情況和成曲質(zhì)量，更為科學(xué)準(zhǔn)確的管理制曲生產(chǎn)。