盧 玲，姚 偉△，龔光遠

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 401120；2.重慶市綦江區(qū)人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 401420

目前，膿毒癥是造成我國重癥監(jiān)護病房患者死亡的主要原因之一。據(jù)估計，全世界每年發(fā)生1 800萬例膿毒血癥[1]。以炎癥風(fēng)暴為特征，進而導(dǎo)致多器官功能損傷及衰竭，是膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[2]。盡管針對膿毒癥的相關(guān)研究，近些年已取得了一定進展，但有效的診斷和治療方法仍相對欠缺。為了降低膿毒癥及相關(guān)并發(fā)癥的病死率，更好地明確膿毒癥相關(guān)的生物學(xué)機制至關(guān)重要。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是負責(zé)蛋白質(zhì)折疊、組裝的細胞器，參與了眾多生理功能。在應(yīng)激和炎癥狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損，引起未折疊的蛋白應(yīng)答激活，以重建細胞穩(wěn)態(tài)[3]。但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白長期積聚，觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，會引發(fā)細胞凋亡。越來越多的證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與眾多炎癥性疾病及惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)[4-5]。本研究擬觀察膿毒癥患者外周血單個核細胞(PBMC)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子表達水平，并分析其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2020年8月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院(簡稱本院)就診的膿毒癥患者130例(觀察組)為研究對象。觀察組男75例、女55例，年齡31～72歲、平均年齡(50.5±13.8)歲，體質(zhì)量指數(shù)(25.0±3.1)kg/m2。納入標準：(1)年齡>18～75歲；(2)所有患者均滿足膿毒癥診治指南[6]：對于感染或疑似感染的患者，膿毒癥相關(guān)序貫器官衰竭(SOFA)評分較基線上升≥2分。排除標準：(1)數(shù)據(jù)不完整或不準確的患者；(2)入院24 h內(nèi)死亡的患者；(3)患慢性疾病的患者如惡性腫瘤、自身免疫性疾病等；(4)近期接受免疫抑制劑治療的患者；(5)未簽署知情同意書的患者。根據(jù)觀察組患者預(yù)后分為存活組(96例)和死亡組(34例)。另選取50例健康志愿者為對照組，均來自同期同一醫(yī)療機構(gòu)的健康體檢中心，其中男28例，女22例，年齡32～70歲，平均年齡(51.3±14.0)歲，體質(zhì)量指數(shù)(25.2±3.5)kg/m2，觀察組與對照組在性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)等方面比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。該研究獲得本院倫理委員會批準，并征得患者家屬知情同意。

1.2方法

1.2.1檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA表達水平 收集所有研究對象外周血3 mL，提取單個核細胞(PBMC)，采用實時定量PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA表達水平。具體檢測方法見相關(guān)參考文獻[7]，簡要步驟包括設(shè)計引物(引物序列見表1)、RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、擴增等。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法計算相對mRNA表達水平。

表1 引物序列

1.2.2檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因蛋白表達水平 提取各組PBMC，在RIPA裂解緩沖液中進行冰育裂解20 min，經(jīng)離心后收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。配置10%電泳液，進行蛋白免疫印跡，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達水平。具體操作可見參考文獻[8]，簡要步驟如下：每孔加入等量蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育(抗CHOP抗體和抗ATF-6抗體均為1∶500，抗GAPDH抗體為1∶800)、洗滌、二抗孵育、洗滌及顯影等。以GAPDH為內(nèi)參，計算內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白條帶與GAPDH灰度比值。

1.2.3檢測PBMC中部分炎性和氧化應(yīng)激指標 收集所有研究對象空腹靜脈血3 mL，經(jīng)抗凝離心后，獲取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定不同組間PBMC中部分炎性指標[白細胞介素(IL)-1β、IL-6]和氧化應(yīng)激指標[超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)]水平。具體檢測方法見相關(guān)試劑盒說明書，炎性指標試劑盒購自南京建成生物公司，氧化應(yīng)激指標試劑盒購自武漢博士德生物公司。

2 結(jié) 果

2.1對照組與觀察組PBMC中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA及蛋白表達水平比較 與對照組比較，觀察組患者PBMC中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子CHOP和ATF-6 mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，見表1及圖1。

表1 兩組外周血內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA表達水平比較

2.2對照組與觀察組PBMC中部分炎性及氧化應(yīng)激指標水平比較 與對照組比較，觀察組PBMC中部分炎性指標IL-1β、IL-6水平和氧化應(yīng)激指標MDA水平顯著升高，而抗氧化應(yīng)激指標SOD水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組PBMC中部分炎性和氧化應(yīng)激指標水平比較

2.3不同預(yù)后組間PBMC中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA和蛋白表達水平比較 與存活組比較，死亡組患者PBMC中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子CHOP和ATF-6 mRNA及蛋白表達水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 不同預(yù)后組PBMC中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA和蛋白表達水平比較

2.4不同預(yù)后組PBMC中部分炎性及氧化應(yīng)激指標水平比較 與存活組比較，死亡組PBMC中部分炎性指標IL-1β、IL-6水平和氧化應(yīng)激指標MDA水平顯著升高，而抗氧化應(yīng)激指標SOD水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

注：與對照組比較，aP<0.05。

表4 不同預(yù)后組PBMC中部分炎性和氧化應(yīng)激指標水平比較

2.5相關(guān)性分析 觀察組PBMC中CHOP和ATF-6 mRNA分別與IL-1β(r=0.450，P=0.019；r=0.493，P=0.017)、IL-6(r=0.413，P=0.025；r=0.445，P=0.019)、MDA(r=0.540，P=0.013；r=0.590，P=0.008)水平呈正相關(guān)。而與SOD水平呈負相關(guān)(r=-0.514，P=0.016；r=-0.499，P=0.017)。

2.6ROC曲線分析 觀察組PBMC中CHOP和ATF-6 mRNA的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.852(95%CI：0.775～0.929)和0.840(95%CI：0.755～0.926)，靈敏度分別為77.27%和76.92%，特異度分別為84.91%和79.49%，見圖2。

圖2 ROC曲線分析

3 討 論

膿毒癥引發(fā)眾多器官功能不全，造成高致死率，是目前臨床面臨的重大醫(yī)學(xué)問題。膿毒癥發(fā)病機制極其復(fù)雜，包括炎性反應(yīng)、免疫功能障礙、線粒體損傷、神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)異常、自噬及其他病理生理過程，最終導(dǎo)致器官功能障礙[9]。最近研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號與膿毒癥引起的組織細胞死亡有關(guān)，在膿毒癥細胞及動物模型中，未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，改變其穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和鈣超載，促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的激活[10]。抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號，可顯著降低膿毒癥引起的細胞凋亡，降低炎性反應(yīng)，改善器官功能[11]。在膿毒癥患者人群中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子表達水平如何，并且與預(yù)后的關(guān)系，目前尚未闡明。

研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路的激活與多種疾病如糖尿病、高血壓、缺血再灌注損傷等發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[12-14]。抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象，促進未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，提示抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號可能是疾病治療的重要靶點[15]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要包含3條信號通路如CHOP的轉(zhuǎn)錄激活，肌醇酶-1及ATF-6激活。膿毒癥大鼠中，心臟組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要成分CHOP顯著上調(diào)，可作用于腫瘤壞死因子受體家族或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原1樣蛋白，引起過量的鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸至線粒體，觸發(fā)鈣依賴型細胞凋亡通路[16]。ATF-6作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)中關(guān)鍵的應(yīng)激蛋白，當受到壓力時被切割為具有轉(zhuǎn)錄因子活性的蛋白，并從高爾基體膜轉(zhuǎn)位至細胞核中，激活靶基因的表達，從而參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，維持細胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)[17]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，ATF-6過度激活可導(dǎo)致與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用的多個膜性細胞器穩(wěn)態(tài)的失衡，包括核膜的皺縮、異染色質(zhì)的丟失及線粒體結(jié)構(gòu)和膜電勢的紊亂，促進半胱氨酸蛋白酶-3凋亡通路激活[18-20]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，膿毒癥患者PBMC中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激顯著激活，同時下游炎性和氧化應(yīng)激指標顯著上調(diào)，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進了下游炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，參與了膿毒癥的發(fā)生過程。相關(guān)研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可促進炎癥及氧化應(yīng)激激活，降低大鼠血管舒張反應(yīng)，升高血壓，而給予內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑處理，可顯著逆轉(zhuǎn)上述異常反應(yīng)[21]。觀察組根據(jù)膿毒癥預(yù)后進行分組，研究結(jié)果提示，死亡組患者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及下游通路顯著較存活組增強。ROC曲線分析顯示，PBMC中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子(CHOP和ATF-6 mRNA)對膿毒癥患者預(yù)后的評估價值較高，提示這兩項指標具有一定的臨床運用價值。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的激活參與了膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展過程，其相關(guān)標志物不僅可作為評估膿毒癥患者預(yù)后的有效指標，還可能為其治療提供有效的靶點。

膿毒癥患者PBMC中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激顯著激活，其相關(guān)因子可作為評估膿毒癥患者預(yù)后的有效指標，但膿毒癥患者中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的上游調(diào)控機制尚不清楚，還需動物及細胞實驗進一步探索及驗證。