楊帆平 奚 燕

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)辦公室，上海 200062；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200032

哮喘是一種常見的呼吸道疾病，主要由免疫介導(dǎo)引起氣道反應(yīng)性增高，形成慢性氣道炎癥，在不同的國家有1%～18%的人群受到侵襲[1]。據(jù)研究統(tǒng)計(jì)中國大陸成年人哮喘患病率為1.81%[2]，患病率有逐年升高的趨勢(shì)[3]。

吸入糖皮質(zhì)激素是治療輕度和中度哮喘的主要手段之一[4]。咳喘六味合劑是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由麻黃、附子、細(xì)辛、桃仁、黃芩及虎耳草組成，具有溫陽抗寒、化痰平喘之功[5-6]。課題組前期已對(duì)咳喘六味合劑原有制備工藝中加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間、乙醇用量及其濃度等工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，提高了麻黃中麻黃堿和偽麻黃堿以及黃芩中黃芩苷的轉(zhuǎn)移率并制訂了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[7]。本研究通過觀察新工藝制備的咳喘六味合劑對(duì)哮喘小鼠的氣道反應(yīng)性、肺組織病理變化以及炎癥反應(yīng)的作用，驗(yàn)證其對(duì)哮喘病癥的有效性并探討其作用機(jī)制[8-10]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性BALB/c 小鼠，6～8 周齡，體重18～26 g，清潔級(jí)，由上海斯萊克公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬）2017-0003。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，環(huán)境溫度18～22℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h/12 h 光暗循環(huán)。本研究設(shè)計(jì)和操作均嚴(yán)格按照上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理原則進(jìn)行。小鼠自購入起，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥和儀器

咳喘六味合劑（新工藝）（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，批號(hào)：1706001）；地塞米松（上海上藥信誼制藥有限公司，批號(hào)：015161004）；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美國Sigma 公司，貨號(hào)：A5503）；氫氧化鋁凝膠（美國Sigma 公司，貨號(hào)：V900163）；白細(xì)胞介素（in terleukin，IL）-13 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（上海西唐生物，貨號(hào)：F10890）；IL-17 ELISA 試劑盒（上海西唐生物，貨號(hào)：F10910）；γ 干擾素（IFN-γ）ELISA 試劑盒（上海西唐生物，貨號(hào)：F10660）；無創(chuàng)式動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀（美國Buxco 公司，型號(hào)：FinePointeTMNAM）；正置顯微鏡（日本OLYMPUS 公司，型號(hào)：CX41）；恒溫烘箱（上海恒一科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：DHG-9023A）；石蠟切片機(jī)（湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司，型號(hào)：SQ2125）；多功能酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo 公司，型號(hào)：DENLEY DRAGON Wellscan MK 3）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)：TGL-168），旋渦混合器（上海青浦滬西儀器廠，型號(hào)：XW-80A）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與哮喘模型制備 將小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、哮喘模型組、咳喘六味合劑（新工藝）低劑量組、咳喘六味合劑（新工藝）高劑量組和地塞米松組，每組6 只。除對(duì)照組外，其他各組小鼠分別于第0、7、14 天進(jìn)行腹腔注射致敏液（0.08% OVA 0.1 ml＋氫氧化鋁凝膠0.1 ml）致敏，對(duì)照組小鼠給予等劑量生理鹽水。第21 天起將小鼠置于密閉霧化吸入箱中，予1% OVA 30 ml 霧化激發(fā)，對(duì)照組小鼠給予等劑量生理鹽水霧化激發(fā)，各組小鼠激發(fā)30 min，1 次/d，連續(xù)10 d。當(dāng)小鼠出現(xiàn)躁動(dòng)、呼吸急促、擦鼻、打噴嚏、腹肌收縮等癥狀，提示造模成功。每次霧化激發(fā)前30 min 給藥，對(duì)照組和哮喘模型組給予生理鹽水灌胃，咳喘六味合劑（新工藝）低劑量組給予咳喘六味合劑（新工藝）15.5 g/kg 灌胃；咳喘六味合劑（新工藝）高劑量組給予咳喘六味合劑（新工藝）31 g/kg 灌胃；地塞米松組給予地塞米松3 mg/kg 灌胃[11-13]。

1.3.2 小鼠氣道反應(yīng)性測(cè)定 采用無創(chuàng)的整體體積描記法測(cè)量各組小鼠的氣道反應(yīng)性，以呼氣間歇（enhanced pause，Penh）值來表示氣道受限程度。使用無創(chuàng)式動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀，將小鼠密封放置于特定的描記器內(nèi)，按照儀器使用說明操作，待小鼠適應(yīng)5 min穩(wěn)定后，依次用濃度梯度為0.000、3.125、6.250、12.500和50.000 mg/ml 的乙酰甲膽堿（Methacholine，Mch）激發(fā)小鼠，每次激發(fā)時(shí)間不超過1.5 min，間隔3 min，記錄各濃度激發(fā)后的Penh 值。

1.3.3 小鼠肺組織HE 染色觀察 取小鼠左肺組織，厚度0.2～0.3 cm，大小為1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm 為宜，置10%福爾馬林中固定48 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE 染色后，顯微鏡（200×）下觀察肺組織和炎癥細(xì)胞浸潤情況[14]。

1.3.4 小鼠血清IL-13、IL-17、IFN-γ 的含量測(cè)定離心（4℃，離心速率2500 r/min，時(shí)間10 min）后收集各組小鼠血清，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作和檢測(cè)[15-16]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，方差齊則多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；方差不齊多組間的比較用Welch Brown 檢驗(yàn)，組間兩兩比較則用Games-Howell test 檢驗(yàn)。以P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠霧化激發(fā)后的行為表現(xiàn)

對(duì)照組小鼠行為表現(xiàn)一切如常。哮喘模型組、咳喘六味合劑（新工藝）低劑量組、咳喘六味合劑（新工藝）高劑量組、地塞米松組小鼠均霧化激發(fā)哮喘成功。其中哮喘模型組小鼠表現(xiàn)出不喜活動(dòng)、眼神呆滯、精神狀態(tài)逐漸變差，呼吸頻率較為急促，腹部伴隨呼吸抽動(dòng)，兩前爪頻繁撓動(dòng)、擦拭鼻子；各給藥組小鼠也觀察到以上表現(xiàn)，但程度較哮喘模型組輕。

2.2 各組小鼠受到不同濃度Mch 激發(fā)后的Penh 值比較

當(dāng)Mch 濃度為6.250、12.500、50.000 mg/ml，哮喘模型組Penh 值高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；咳喘六味合劑（新工藝）低劑量組、咳喘六味合劑（新工藝）高劑量組、地塞米松組Penh 值低于哮喘模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠受到不同濃度Mch 激發(fā)后的Penh 值比較（）

表1 各組小鼠受到不同濃度Mch 激發(fā)后的Penh 值比較（）

注：與對(duì)照組同濃度比較，aP <0.05；與哮喘模型組同濃度比較，bP<0.05

2.3 各組小鼠肺組織病理變化

對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰、完整，支氣管、肺泡等正常，未見明顯的炎癥細(xì)胞。哮喘模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，支氣管變窄、壁變厚，周圍有炎癥細(xì)胞。咳喘六味合劑（新工藝）低劑量組、咳喘六味合劑（新工藝）高劑量組、地塞米松組小鼠肺組織稍顯改變，結(jié)構(gòu)尚好；支氣管均有不同程度的變形，但變窄變厚程度輕于哮喘模型組，有少量炎癥細(xì)胞。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化（HE 染色，200×）

2.4 各組小鼠血清IL-13、IL-17 和IFN-γ 水平比較

哮喘模型組血清IL-13、IL-17、IFN-γ 水平與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；咳喘六味合劑（新工藝）低劑量組、咳喘六味合劑（新工藝）高劑量組、地塞米松組血清IL-13、IL-17、IFN-γ 水平與哮喘模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠血清IL-13、IL-17 和IFN-γ 水平比較（mg/ml，）

表2 各組小鼠血清IL-13、IL-17 和IFN-γ 水平比較（mg/ml，）

注：IL：白細(xì)胞介素；IFN-γ：γ 干擾素

3 討論

炎癥被認(rèn)為是哮喘發(fā)病的核心，臨床表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性與可逆性氣流受限[17-18]，而Th1/Th2 亞群比例失衡和功能失調(diào)被認(rèn)為是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[19-20]。IL-13 是執(zhí)行Th2 細(xì)胞分化的主要細(xì)胞因子[21]，當(dāng)哮喘形成時(shí)IFN-γ 明顯下降，Th2 細(xì)胞分化占據(jù)優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致IL-13 等細(xì)胞因子大量產(chǎn)生[22-23]。IL-17 對(duì)于哮喘炎癥起著關(guān)鍵作用，哮喘形成時(shí)，IL-17 呈高表達(dá)狀態(tài)[24-25]。

咳喘六味合劑全方配伍，可振奮腎陽。相關(guān)研究證實(shí)[26]，溫陽補(bǔ)腎可以調(diào)節(jié)Th1/Th2 的比例和功能失衡，從而改善氣道炎癥。麻黃中的總生物堿可調(diào)節(jié)哮喘模型大鼠IL-4、IL-13、IFN-γ 等炎癥因子的表達(dá)[27]；黃芩苷能作用于HMGB1-TLR4 信號(hào)通路，影響其信號(hào)傳導(dǎo)，抑制下游炎癥反應(yīng)遞質(zhì)的釋放，阻斷炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，減輕氣道炎癥反應(yīng)[28]；細(xì)辛中所含揮發(fā)油可松弛支氣管平滑肌，抑制氣道炎癥反應(yīng)，降低哮喘發(fā)病率[29]。

本研究結(jié)果顯示，新工藝制備的咳喘六味合劑對(duì)哮喘小鼠有一定的治療作用，可以緩解氣道高反應(yīng)，減輕呼吸氣流受限程度，改善肺組織病理狀態(tài)；而對(duì)于相關(guān)炎癥因子的調(diào)節(jié)作用將做進(jìn)一步研究。