張曉芳 張宜群 王 珩

子宮內(nèi)膜癌以異常子宮出血為主要臨床癥狀，通常高發(fā)于絕經(jīng)后女性[1]。目前子宮內(nèi)膜癌的一線療法包括卵巢、輸卵管、子宮和子宮頸切除術(shù)或盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)[2]。但手術(shù)切除術(shù)不適用于育齡期患者[3]。化學(xué)療法已發(fā)展為一種治療高危和晚期子宮內(nèi)膜癌患者的重要手段[4]。但化療藥物毒性大、副作用強、易產(chǎn)生耐藥性，嚴重影響患者身心健康[5]。桂枝茯苓丸出自《金匱要略》，由桂枝、茯苓、丹皮、芍藥、桃仁組成，具有活血化瘀、破癥散結(jié)、理氣鎮(zhèn)痛等功效。桂枝茯苓丸聯(lián)合培美曲塞和奈達鉑治療晚期子宮內(nèi)膜癌的療效較好且不良反應(yīng)較輕[6]，但其作用機制尚待進一步闡明。本研究觀察桂枝茯苓丸對子宮內(nèi)膜癌細胞病理學(xué)功能的影響及其作用機制，報道如下。

1 實驗材料

1.1 細胞株 從美國模式培養(yǎng)物集存庫購得人子宮內(nèi)膜癌細胞系HEC-1A（批號）、HEC-1B（批號）和人正常子宮內(nèi)膜細胞系hESC（批號），Ishikawa細胞（批號CL-0283）則購買于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物 桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、丹皮、赤芍、桃仁各9g 組成，中藥飲片購自浙江省中醫(yī)院。將藥材加10 倍水浸泡30min 后煎2 次，每次大火煎開后小火煎2h，合并2 次煎液并濃縮至2000mL，加入等量95%乙醇使藥渣沉淀，棄掉藥渣，濃縮至黏稠狀后真空干燥，取干燥藥物用培養(yǎng)基配置成2700μg/mL的桂枝茯苓丸含藥培養(yǎng)液，用0.22μM 無菌濾器過濾后4℃保存，詳細流程參考文獻[7]的方法。

1.3 試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基（批號11875）、胎牛血清（批號s9030）、BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒（批號PC0020-500）、TRIzol（批號15596026）、電泳緩沖液（批號T1070）和TBST 緩沖液（批號T1085）均購于北京索萊寶科技有限公司；青霉素鏈霉素（批號15140148）和M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（批號C28025-014）購自美國invitrogen；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號P0018M）和增強型CCK8 試劑盒（批號C0042）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒（批號P-CA-202）購買于武漢普諾賽生命科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)購自Promega（批號fa231654）；兔多克隆SGK1 抗體（批號ab32374），兔單克隆抗體P62（批號ab109012）、Beclin1（批號ab210498）、LC3II（批號ab192890）和山羊抗兔IgG H&L（批號ab205718）購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司。lncRNA H19 的段發(fā)夾RNA（sh-H19）和其陰性對照（sh-NC），H19 的過表達載體（oe-H19）和oe-NC 均購買于海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.4 儀器 Eppendorf CellXpert C170 CO2培養(yǎng)箱，德國Eppendorf 公司；751 型分光光度計，美國伯騰儀器有限公司；超凈工作臺BSC-1004IIA2，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Applied Biosystems ABI 7500，美國賽默飛世爾科技公司；Gel Doc EZ 凝膠成像分析儀，美國Bio-Rad 公司；-80℃超低溫冰箱DW-86L100J，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) HEC-1A、HEC-1B、Ishikawa和人正常子宮內(nèi)膜細胞系hESC 用含有10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100g/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，而HEK-293T細胞則用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，所有細胞置于5%CO2、37℃的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合至90%進行傳代。

2.2 qRT-PCR 測定RNA 水平 取對數(shù)生長期的Ishikawa細胞，加入TRIzol 室溫放置5～8min 使細胞裂解。加入氯仿，靜置后離心取上清。收集上面的水樣層后，加入異丙醇沉淀RNA。使用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq 在Applied Biosystems ABI 7500 實時PCR 操作系統(tǒng)上進行qRT-PCR。其中miR-195-5p 以U6 為內(nèi)參歸一化處理，lncRNA H19和SGK1 以GAPDH 為內(nèi)參。合成的寡聚體DNA 以O(shè)D260 為單位來表示。通過2-ΔΔCt方法來比較對照組和實驗組的目的基因相對表達量的差異。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。引物序列如下：lncRNA H19 上游引物：5'-ATCGGTGCCTCAGCGTTCGG-3'，下游引物：5'-TCCAGAATGCCAAATCGGCT-3'；SGK1 上游引物：5'-AGGATGGGTCTGAACGACTTT-3'，下游引物：5'-GCCCTTTCCGATCACTTTCAAG-3'；GAPDH 上游引物:5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAA-AT-3'；下游引物：5' -GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG -3'；miR -195-5p 上游引物：5′-GGGGTAGCAGCACAGAAAT-3′；下游引物：5′-TCCAGTGCGTGTCGTGGA-3′；U6上游引物：5'-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3'；下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

2.3 免疫印跡法（Western blot）檢測SGK1 蛋白表達水平 用PBS 洗滌細胞，使用含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白質(zhì)濃度并制作Western blot 上樣樣本。取20μg 蛋白樣本利用SDS 聚丙烯酰胺凝膠分離，并轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上。使用以下抗體進行Western blot：一抗兔多克隆抗體SGK1、GAPDH、P62、Beclin1和LC3II。二抗山羊抗兔IgG H&L。最后使用ECL 試劑盒進行顯影，并用凝膠成像儀分析蛋白條帶。

2.4 CCK8 法測定細胞增殖活性 在96 孔板中接種100μL 濃度為4×103個/mL 的Ishikawa細胞懸液。培養(yǎng)24h 后，按實驗分組要求將孔內(nèi)培養(yǎng)液更換為含藥培養(yǎng)液，再分別培養(yǎng)72h 后，將10μL CCK8 溶液添加到每個孔中。使用酶標儀在450nm 處測量吸光度。

2.5 雙熒光素酶報告基因檢測lncRNA H19與miR-195-5p 及miR-195-5p與SGK1 的結(jié)合 用H19-WT/SGK1-WT 或H19-MUT/SGK1-MUT的熒光素酶報告質(zhì)粒與miR-195-5p mimic 或NC mimic共轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，同時加藥組用終濃度為200μg/mL 的桂枝茯苓丸溶液處理。轉(zhuǎn)染后48h 裂解細胞，并使用雙熒光素酶報告試劑盒檢測相對熒光素酶活性。

2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取待檢測細胞，胰酶消化為單細胞懸液，按照Annexin V-FITC/PI 凋亡細胞試劑盒說明書對細胞染色，并使用流式細胞儀在60min 內(nèi)檢測，cellquest 軟件分析細胞凋亡百分比。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.0 統(tǒng)計軟件分析所有數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，每項實驗重復(fù)3 次。多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用非配對雙尾t 檢驗，P<0.05 認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 lncRNA H19 對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡和自噬的影響 我們進行qRT-PCR 實驗檢測lncRNA H19 在子宮內(nèi)膜癌細胞和人正常子宮內(nèi)膜細胞的表達，觀察到子宮內(nèi)膜癌細胞HEC-1A、HEC-1B、Ishikawa 中l(wèi)ncRNA H19 的RNA 水平顯著高于人正常子宮內(nèi)膜細胞EMC（P<0.05 或P<0.01）（見表1）。為了確定H19 在子宮內(nèi)膜癌細胞增殖中的作用，在Ishikawa細胞敲低H19 的表達，通過CCK8 實驗評估細胞的增殖活性，結(jié)果顯示，敲低lncRNA H19 后細胞的增殖能力顯著降低（P<0.05）（見表2）。通過流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡情況，結(jié)果如表3和圖1所示，sh-H19 組的細胞凋亡率較對照組明顯增加（P＜0.05）。通過Western blot 對自噬標志蛋白P62、Beclin1和LC3II表達進行檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，敲低H19 的Ishikawa細胞P62表達降低，Beclin1和LC3II表達增強，見圖2。

圖2 Western blot 檢測敲低lncRNA H19 對自噬相關(guān)蛋白P62、Beclin1和LC3II表達的影響

表1 lncRNA H19 在人正常子宮內(nèi)膜細胞和子宮內(nèi)膜癌細胞表達（±s）

表1 lncRNA H19 在人正常子宮內(nèi)膜細胞和子宮內(nèi)膜癌細胞表達（±s）

注：與EMC細胞比較，aP＜0.05，aaP＜0.01

表2 敲低lncRNA H19 后Ishikawa細胞增殖活性變化（%，±s）

表2 敲低lncRNA H19 后Ishikawa細胞增殖活性變化（%，±s）

注：對照組為轉(zhuǎn)染sh-NC 的Ishikawa細胞；sh-H19 組為敲低lncRNA H19表達組；與對照組比較，aP＜0.05

表3 敲低lncRNA H19 后Ishikawa細胞凋亡率變化（%，±s）

注：對照組為轉(zhuǎn)染sh-NC 的Ishikawa細胞；sh-H19 組為敲低lncRNA H19表達組；與對照組比較，aP＜0.05

圖1 敲低H19 對Ishikawa細胞凋亡的影響

3.2 lncRNA H19 作為分子海綿吸附并調(diào)控miR-195-5p表達 由于lncRNA 可作為分子海綿吸附miRNA[8]。因此我們對lncRNA 的靶miRNA 進行預(yù)測，miR-195-5p和H19 3'UTR 之間有7nt 的結(jié)合位點（見圖3）。雙熒光素酶報告基因檢測miR-195-5p和lncRNA H19 的結(jié)合關(guān)系，與NC mimic+H19-WT組比較，miR-195-5p mimic+H19-WT 組的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），表明lncRNA H19 海綿吸附miR-195-5p（見表4）。此外，在敲低lncRNA H19 后檢測Ishikawa細胞miR-195-5p 水平，與對照組比較，敲低lncRNA H19 后miR-195-5p表達上調(diào)（P＜0.05），見表5。

表5 qRT-PCR 檢測敲低lncRNA H19 對miR-195-5p表達的影響（±s）

表5 qRT-PCR 檢測敲低lncRNA H19 對miR-195-5p表達的影響（±s）

注：sh-NC 為敲低對照組；sh-H19 組為敲低lncRNA H19表達組；與sh-NC 組比較，aP<0.05

圖3 miR-195-5p與H19 3'UTR 的結(jié)合位點

表4 雙熒光素酶報告基因驗證lncRNA H19與miR-195-5p 的靶向結(jié)合（±s）

表4 雙熒光素酶報告基因驗證lncRNA H19與miR-195-5p 的靶向結(jié)合（±s）

注：NC mimic+H19-WT 組為共轉(zhuǎn)染NC mimic和野生型lncRNA H19的293T細胞；miR-195-5p mimic+H19-WT 組為共轉(zhuǎn)染miR-195-5p mimic和野生型lncRNA H19 的293T細胞；NC mimic+H19-MUT 組為NC mimic和突變型lncRNA H19 共轉(zhuǎn)染的293T細胞；miR-195-5p mimic+H19-MUT 組為miR-195-5p mimic和突變型lncRNA H19共轉(zhuǎn)染的293T細胞；與NC mimic+H19-WT 組比較，aP<0.05

3.3 miR-195-5p 靶向調(diào)節(jié)SGK1表達 為進一步探究lncRNA H19 調(diào)控機制，通過starBase 對miRNA的靶基因進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-195-5p 能夠與SGK1的3'UTR 結(jié)合（見圖4）。通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)對該預(yù)測結(jié)果進行驗證，結(jié)果顯示，miR-195-5p mimic 能夠顯著降低SGK1-WT 報告基因的熒光素酶活性（P<0.05），但不影響SGK1-MUT 報告基因的活性（見表6）。為驗證并揭示miR-195-5p和SGK1 的靶向調(diào)控關(guān)系，首先我們在轉(zhuǎn)染miR-195-5p mimic 的Ishikawa細胞以及轉(zhuǎn)染NC mimic 的Ishikawa細胞檢測SGK1 mRNA和蛋白表達水平，從表7和圖5 可以看出miR-195-5p mimic 組Ishikawa細胞SGK1 mRNA和蛋白水平下調(diào)（P 均<0.05）。

表6 雙熒光素酶報告基因檢測miR-195-5p與lncRNA H19 的靶向結(jié)合關(guān)系（±s）

表6 雙熒光素酶報告基因檢測miR-195-5p與lncRNA H19 的靶向結(jié)合關(guān)系（±s）

注：NC mimic+SGK1-WT 組為NC mimic和野生型SGK1 共轉(zhuǎn)染的293T細胞；miR-195-5p mimic+SGK1-WT 組為miR-195-5p mimic和野生型共轉(zhuǎn)染的293T細胞；NC mimic+SGK1-MUT 組為NC mimic和突變型SGK1 共轉(zhuǎn)染的293T細胞；miR-195-5p mimic+SGK1-MUT 組為miR-195-5p mimic和突變型SGK1 共轉(zhuǎn)染的293T細胞；與NC mimic+SGK1-WT 組比較，aP<0.05

表7 過表達miR-195-5p 對SGK1 mRNA表達的影響（±s）

表7 過表達miR-195-5p 對SGK1 mRNA表達的影響（±s）

注：NC mimic 組為轉(zhuǎn)染NC mimic 的Ishikawa細胞；miR-195-5p mimic 組為轉(zhuǎn)染miR-195-5p mimic 的Ishikawa細胞；與NC mimic組比較，aP<0.05

圖4 starBase 預(yù)測SGK1與miR-195-5p 的結(jié)合位點

圖5 過表達miR-195-5p 對SGK1 蛋白表達的影響

3.4 桂枝茯苓丸逆轉(zhuǎn)lncRNA H19 對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖和自噬的影響 為了明確桂枝茯苓丸在lncRNA H19介導(dǎo)的子宮內(nèi)膜癌中的作用，設(shè)置oe-NC 組、oe-H19 組、oe-H19+桂枝茯苓丸組。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與oe-NC 組比較，oe-H19 組Ishikawa細胞lncRNA H19 的含量顯著增高（P<0.01），而桂枝茯苓丸能夠逆轉(zhuǎn)oe-H19 轉(zhuǎn)染引起的lncRNA H19 水平上升（P<0.05）（見表8）。采用CCK8 法檢測細胞的增殖活力，oe-H19 組細胞存活率較oe-NC 組顯著增高（P<0.05）（見表9）。將轉(zhuǎn)染oe-H19 的Ishikawa細胞在桂枝茯苓丸含藥培養(yǎng)液中培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)與oe-H19 組比較，經(jīng)桂枝茯苓丸含藥培養(yǎng)液處理的Ishikawa細胞的增殖活性顯著降低（P<0.05）。細胞凋亡測定結(jié)果顯示，過表達lncRNA H19 降低細胞的凋亡率，桂枝茯苓丸可以緩解oe-H19 對細胞凋亡率的下調(diào)（見圖6、表10）。Western blot 結(jié)果顯示，與oe-NC 組比較，oe-H19 組Ishikawa細胞P62表達顯著增加，Beclin1和LC3II表達顯著下調(diào)，表明細胞自噬被抑制，而經(jīng)桂枝茯苓丸含藥培養(yǎng)液處理則能逆轉(zhuǎn)oe-H19 對自噬的抑制作用，見圖7。

圖6 流式細胞術(shù)檢測桂枝茯苓丸對細胞凋亡的影響

圖7 Western blot 檢測桂枝茯苓丸對lncRNA H19 調(diào)控的細胞自噬標志蛋白表達的影響

表8 qRT-PCR 檢測桂枝茯苓丸對Ishikawa細胞lncRNA H19表達的影響（±s）

表8 qRT-PCR 檢測桂枝茯苓丸對Ishikawa細胞lncRNA H19表達的影響（±s）

注：oe-H19 為在Ishikawa細胞過表達lncRNA H19；oe-H19+桂枝茯苓丸組為在Ishikawa細胞過表達lncRNA H19 并用桂枝茯苓丸含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)；與oe-NC 組比較，aP<0.01；與oe-H19 組比較，bP<0.05

表9 CCK8 檢測桂枝茯苓丸對lncRNA H19 誘導(dǎo)的細胞增殖作用的影響（%，±s）

表9 CCK8 檢測桂枝茯苓丸對lncRNA H19 誘導(dǎo)的細胞增殖作用的影響（%，±s）

注：oe-H19 組為在Ishikawa細胞過表達lncRNA H19；oe-H19+桂枝茯苓丸組為在Ishikawa細胞過表達lncRNA H19 并用桂枝茯苓丸含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)；與oe-NC 組比較，aP<0.05；與oe-H19 組比較，bP<0.05

表10 流式細胞術(shù)檢測桂枝茯苓丸對細胞凋亡的影響（%，±s）

表10 流式細胞術(shù)檢測桂枝茯苓丸對細胞凋亡的影響（%，±s）

注：oe-H19 組為在Ishikawa細胞過表達H19；oe-H19+桂枝茯苓丸組為在Ishikawa細胞過表達lncRNA H19 并用桂枝茯苓丸含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)；與oe-NC 組比較，aP<0.05；與oe-H19 組比較，bP<0.05

4 討論

多項研究表明，lncRNA 是腫瘤起始和發(fā)展的重要調(diào)控因子[9]。然而，大多數(shù)lncRNA 由于保守性差、豐度差異等原因難以表征，只有高度保守、穩(wěn)定且豐富的lncRNA 才有可能成為潛在的腫瘤生物標志物和治療靶點[10]。本研究主要對高度保守的lncRNA H19 在子宮內(nèi)膜癌細胞表達和功能進行探索，通過qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)lncRNA H19 在子宮內(nèi)膜癌細胞高表達，較其在正常子宮內(nèi)膜細胞的表達差異較為顯著。這也與lncRNA H19 在其他21種癌癥類型中的表達趨勢一致[11]。CCK8 實驗結(jié)果顯示，敲低lncRNA H19 有效降低Ishikawa細胞的增殖能力（P＜0.05）。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，敲低lncRNA H19 可促進細胞凋亡（P＜0.05）。在自噬過程中，細胞質(zhì)LC3I 轉(zhuǎn)化為LC3II。因此，LC3II/LC3I 比率通常用作自噬的定量指標[12]。Beclin-1和P62 在自噬調(diào)節(jié)中具有重要作用，是自噬檢測的常用標記物[13]。本研究通過qRT-PCR和Western blot 發(fā)現(xiàn)，敲低lncRNA H19 的Ishikawa細胞P62 異常低表達，Beclin1和LC3II 異常高表達。提示敲低lncRNA H19 可抑制Ishikawa細胞增殖，促進細胞凋亡和自噬。

lncRNA 最常見的調(diào)節(jié)機制是通過與miRNA 相互作用調(diào)控miRNA 下游靶基因的表達[14]。lncRNA H19 在不同癌癥中也通過調(diào)節(jié)不同的miRNA/mRNA軸來參與癌癥進展。本研究通過靶向預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-195-5p與lncRNA H19 具有結(jié)合位點，且雙熒光素報告基因檢測和Western blot 結(jié)果也證明了lncRNA H19 靶向負調(diào)控miR-195-5p 的表達。通過starBase預(yù)測到miR-195-5p 能夠與SGK1 的3'UTR 結(jié)合，同時雙熒光素酶報告基因檢測和Western blot 驗證了miR-195-5p 對SGK1 的靶向負調(diào)控作用。上述結(jié)果表明，lncRNA H19 對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖和自噬的作用可能是通過調(diào)控miR-195-5p/SGK1 軸實現(xiàn)的，對該通路進行抑制可能會有效抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展。

綜上所述，桂枝茯苓丸能夠有效抑制lncRNA H19 對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的促進和對凋亡及自噬的抑制作用。這種作用可能是通過調(diào)控lncRNA H19/miR-195-5p/SGK1 軸實現(xiàn)的。