朱燁婷 華金渭 盛云杰 王詩語 秦路平 朱 波

三葉青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤，是我國特有的珍稀藥用植物[1]。三葉青主要分布于我國浙江、福建、廣西、云南等地，以地下塊根入藥，具有清熱解毒、活血散結(jié)、消炎止痛、祛風化痰、理氣健脾等功效，常用于小兒高熱驚厥、痢疾、支氣管炎、肺炎、咽喉炎、肝炎、病毒性腦膜炎、毒蛇咬傷、扁桃體炎、跌打損傷等疾病的治療[2]?，F(xiàn)代藥理學及化學成分研究表明，其主要活性成分為黃酮類[3]、有機酸類[4]、酚類[5]及揮發(fā)油類[6]等，具有增強免疫[7]、保肝護肝[8]、抗腫瘤[9]、抗炎[10]、抗病毒[11]等作用。三葉青現(xiàn)有報道多集中在化學成分分離鑒定[12]、栽培技術(shù)[13]、分子標記[14]等方面，而對于以有效成分為主要參考指標評價不同種質(zhì)三葉青的質(zhì)量鮮有報道。三葉青野生資源稀缺，近年來各地均開展人工栽培馴化，不同產(chǎn)地的三葉青外觀性狀、藥理活性、產(chǎn)量及價格均差異懸殊，三葉青化學成分的差異會影響三葉青藥材質(zhì)量以及臨床用藥療效。三葉青中黃酮類和多糖類化合物的含量遠高于其他化學物質(zhì)，黃酮類具有抗氧化、降血糖、抗菌消炎等多種生理活性[15]。本試驗收集全國三葉青主產(chǎn)區(qū)20個種質(zhì)資源，建立同時測定塊根中蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷的超高效液相色譜（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）方法，并分析其與生境因子間的相關(guān)性，為三葉青質(zhì)量控制和資源合理利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料、試劑與儀器 采集浙江、湖南、廣西、江西、湖北、貴州、重慶等8省20個產(chǎn)地新鮮健康三葉青塊根，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學張巧艷教授鑒定為葡萄科三葉青Tetrastigma hemsleyanum（見表1）。標準品：異槲皮苷（B21529）、山奈酚-3-O-蕓香糖苷（B21133），福林酚試劑（S30000）均購自上海源葉生物科技有限公司，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、碳酸鈉等試劑購自杭州木木生物科技有限公司，色譜級甲醇、乙腈購自上海百靈威化學技術(shù)有限公司，其他試劑為分析純。實驗儀器：Waters 超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Milli-Q-Academic 超純水儀（美國Millipore 公司）；DHG-9031A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信試驗儀器有限公司）；D37520 快速離心機（德國Heraeus 公司）；MA110 型電子天平(上海第三分析儀器廠)；RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；YQ-1002C 型超聲波清洗機（上海易凈超聲波儀器有限公司）；FW100 高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市瑞德儀器設(shè)備有限公司）。

表1 樣品信息

1.2 蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量測定

1.2.1 樣品溶液制備與含量測定 稱取樣品粉末2g至100mL 燒瓶，加入40mL 80%甲醇室溫超聲提取10min，抽濾旋干，用30%甲醇定容至2mL 容量瓶，0.45μm 濾膜過濾，待用。

1.2.2 色譜條件 Waters UPLC 色譜柱，BEHC18（2.1×150mm，1.7μm）；流動相為甲醇與0.1%甲酸水，采用梯度洗脫；柱溫45℃；檢測波長300nm；流速0.25mL/min；進樣量1μL。

1.2.3 線性關(guān)系考察 配制質(zhì)量濃度為0.2mg/mL的蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷混合對照品溶液，分別采用原液、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 稀釋液，在上述色譜條件下測定峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)果見表2。

表2 蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷線性關(guān)系考察

1.2.4 精密度試驗 取同一混合標準品溶液，按照線性關(guān)系考察方法測定光密度（optical density，OD）值，連續(xù)測定6 次，測得蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值分別為0.42%、1.10%與0.66%，儀器精密度良好。

1.2.5 重復性試驗 取重慶梁平樣品6 份，按照樣品溶液制備與含量測定方法測定OD 值，得樣品平均蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量為0.0160、0.0115、0.0297mg/g，RSD值分別為1.99%、2.01%、1.66%，試驗重復性良好。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗 取重慶梁平樣品，按照“1.2.1”方法制備樣品溶液，室溫避光保存，分別在1、2、4、6、8、10、12、24h 測定OD 值，計算得蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量RSD 值分別為0.82%、0.95%、1.10%與1.43%，表明樣品溶液在室溫避光保存24h 內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.7 加樣回收率試驗 取重慶梁平樣品6 份，加入質(zhì)量分數(shù)為0.02mg/mL 的蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷混合對照品溶液1mL，按照上述樣品制備方法與色譜條件下測定峰面積，計算加樣回收率（%）=（C-A）/B×100%，A 為樣品各成分含量，B 為加入對照品含量，C 為實際測得含量。結(jié)果顯示，蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷平均回收率分別為98.39%、101.16%與98.96%，RSD 值分別為3.79%、3.54%與3.35%。見表3。

表3 加樣回收率試驗（n=6）

1.3 清除DPPH 自由基能力測定 精密稱取樣品粉末1g 至水解管，加20mL 甲醇80%超聲10min，過濾定容至25mL 容量瓶，將母液稀釋成25、12.5、10、6.25、5、3.125、2.5、1.25、0.625、0.5mg/mL的樣品溶液，進行清除DPPH 自由基的抗氧化能力測定。配制0.1mol/L 的DPPH 溶液，利用DPPH 溶液特征紫紅色團在波長517nm 下有最大吸收，并在加入抗氧化劑提取物后出現(xiàn)吸收下降的表現(xiàn)，表示其對有機自由基的清除能力。按照公式計算DPPH 清除率，清除率=[1-（A1-A0）/ACK]×100%，A1 為1mL 樣品＋1mL DPPH 的OD 值，A0 為1mL 樣品＋1mL 無水乙醇的OD 值，ACK 為1mL 溶劑＋1mL DPPH 的OD 值。用SPSS 17.0 軟件回歸擬合不同濃度醇溶性成分的清除DPPH 自由基能力函數(shù)曲線，采用Probit 模型，以清除DPPH 自由基能力為響應頻率，觀測值匯總為1，樣品濃度為協(xié)變量進行模型分析，以置信限制中概率為0.50 時的濃度作為半抑制率（IC50 值）[16]。

圖1 超高效液相色譜圖

1.4 統(tǒng)計學方法 應用Excel 2007 對數(shù)據(jù)進行整理與相關(guān)性分析；應用SPSS 17.0 軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素analysis of variance（ANOVA）法分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD），P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義；應用DPS 9.05 軟件進行系統(tǒng)聚類分析，根據(jù)歐氏距離采用類平均法（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉青中3種黃酮苷含量及清除DPPH 自由基能力比較 不同產(chǎn)地三葉青塊根中蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量存在差異（P<0.01），平均含量分別為0.0058、0.0059、0.0127mg/g。其中，廣西田林三葉青蘆丁含量最高，達0.0302mg/g，但有11個樣品未檢測到蘆丁含量；福建建陽三葉青異槲皮苷含量最高，為0.0135mg/g，有4個樣品未檢測到異槲皮苷含量；廣西樂業(yè)三葉青山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量最高，為0.0463mg/g，全部樣品均能檢測到山奈酚-3-O-蕓香糖苷，其變幅為0.0014～0.0463mg/g。不同產(chǎn)地三葉青塊根醇提物對DPPH 自由基均有一定的清除作用，但存在差異，其中浙江景寧與福建建陽三葉青清除DPPH 自由基能力最強，IC50 值均為0.683mg/mL，湖南懷化種質(zhì)清除DPPH 自由基能力最弱，IC50 值為19.624mg/mL。見表4。

表4 不同產(chǎn)地三葉青蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量與IC50 值比較（n=3）

2.2 黃酮苷含量與農(nóng)藝性狀、生境因子的相關(guān)性三葉青塊根中3種黃酮苷含量與塊根農(nóng)藝性狀、生境因子間存在相關(guān)性（見表5），與塊根縱徑、塊根橫徑、塊根重、海拔呈正相關(guān)關(guān)系，其中異槲皮苷含量與塊莖橫徑呈最大正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達0.7046；與塊根縱橫徑比、經(jīng)度、緯度呈負相關(guān)關(guān)系，其中異槲皮苷含量與經(jīng)度呈最大負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.7151。相關(guān)性分析顯示，低經(jīng)緯度、高海拔地區(qū)種植三葉青，有利于其塊根中黃酮苷含量積累。

表5 三葉青黃酮苷含量與生長性狀、生境因子的相關(guān)性分析

2.3 聚類分析 以塊根生長性狀、黃酮苷含量為指標，對20個三葉青樣品進行聚類分析，并按照D2=18.96 的聚類水平將20個三葉青樣品劃分為4 類（見圖2）。第Ⅰ類群共8個種質(zhì)，以浙江種質(zhì)為主，分別為浙江蓮都1、浙江蓮都2、浙江慶元、湖南懷化、浙江景寧、浙江遂昌、浙江青田、浙江黃巖，該類群植株葉片小而狹長或?qū)掆g，顏色深綠背部無柔毛，莖較細，圓柱形，根系較發(fā)達，塊根小，表面多光滑，黃酮苷含量較低；第Ⅱ類群共4個種質(zhì)，福建建陽、湖北咸豐、江西弋陽與浙江泰順，該類群植株葉片較寬鈍，莖較粗，方形或少圓形，塊根中等大小，表面褶皺或光滑，黃酮苷含量除福建建陽樣品外，其余樣品含量較低；第Ⅲ類群共4個種質(zhì)，以廣西樣品為主，分別為廣西田林、樂業(yè)、天峨和重慶梁平，該類群三葉青葉片較大而狹長或?qū)掆g，顏色多淺綠背部有柔毛，莖較粗，方形，根系發(fā)達，塊根大，黃酮苷含量較高；第Ⅳ類群共4個種質(zhì)，分別為貴州赤水、重慶綦江、廣西鐘山與湖南汝城，該類群三葉青植株形態(tài)與第Ⅲ類群類似，塊根較大，黃酮苷含量較低。

圖2 聚類分析圖

3 小 結(jié)

目前市場上三葉青藥材野生資源日益匱乏，人工栽培條件受限，栽培種質(zhì)混亂，不同產(chǎn)地三葉青在生長性狀、有效成分含量等方面存在差異，故收集并評價不同產(chǎn)地三葉青有效成分含量對三葉青良種選育與高產(chǎn)栽培具有重要意義。藥用植物在長期適應環(huán)境的過程中，通過調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的積累，抵抗害蟲、物理、化學等生物性與非生物性環(huán)境因子脅迫，其生物學性狀、生態(tài)適應性、農(nóng)藝性狀、藥效成分等受自身遺傳與環(huán)境因子雙重影響，產(chǎn)地、經(jīng)緯度、海拔、氣候條件等環(huán)境因子是影響中藥材生長與藥效成分含量積累的重要因素[18]。本實驗結(jié)果表明，20個三葉青種質(zhì)的塊根中蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量存在差異，其中重慶、福建、廣西三葉青黃酮苷含量較高，貴州次之，浙江、湖北、湖南、江西較低；塊根中黃酮苷含量與塊根生長性狀、生境因子間存在相關(guān)性，與塊根縱徑、塊根橫徑、塊根重、海拔呈正相關(guān)關(guān)系，與塊根縱橫徑比、經(jīng)度、緯度呈負相關(guān)關(guān)系，結(jié)果提示三葉青優(yōu)良種質(zhì)篩選可優(yōu)先在低經(jīng)緯度、高海拔地區(qū)種植的重慶、福建、廣西種質(zhì)中選擇。

中藥材實際栽培應綜合考慮有效成分含量、藥材產(chǎn)量、種質(zhì)生態(tài)適應性差異、立地條件優(yōu)劣等多方面因素。單一指標含量高低并不能明確評價藥材質(zhì)量優(yōu)劣，因此，盡快統(tǒng)一三葉青藥材含量評價指標，建立三葉青藥材化學成分指紋圖譜，并綜合藥效學、藥代動力學等建立三葉青藥材質(zhì)量評價體系，是促進三葉青產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。綜合生長性狀與黃酮苷含量，初步篩選出重慶綦江、重慶梁平、廣西樂業(yè)、廣西田林、福建建陽5個三葉青優(yōu)良種質(zhì)，生長勢好，塊根中黃酮苷含量高，下一步可優(yōu)先對初篩優(yōu)良種質(zhì)進行同一栽培區(qū)域內(nèi)的大田育種試驗。三葉青分布地域廣，本實驗收集了20個產(chǎn)地種質(zhì)資源，其中如福建、貴州、江西等地種質(zhì)，僅收集到1個樣品，代表性弱，后續(xù)工作將加強對福建、貴州、江西等地三葉青的種質(zhì)資源收集與評價，以期為三葉青種質(zhì)資源利用與優(yōu)良品種選育提供科學依據(jù)。