吳育民 杜端明 劉春霖 洪躍飛 江磊 昌羅偉 芝彭堯 JOHN Bell

（深圳市第二人民醫(yī)院介入治療科，深圳518000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是男 性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因，每年在全球范圍內(nèi)奪走超過70萬人的生命［1-2］。雖然手術(shù)切除、肝移植和消融治療可以治愈早期疾病，但通常晚期疾病的最終和主要治療方法是系統(tǒng)性藥物治療［3］。傳統(tǒng)化療在晚期肝癌患者中的應(yīng)答率很低。索拉非尼已被公認(rèn)為HCC患者的標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)治療方法，然而，腫瘤應(yīng)答率并不令人滿意［4］。因此，迫切需要新的策略來提高肝癌的治療反應(yīng)。

溶瘤病毒（oncolytic virus，OV）是一種自我擴(kuò)增的癌癥生物療法，可以在不損害正常組織的情況下摧毀惡性腫瘤［5］。OV療法是治療肝癌的一種潛在的有吸引力的策略［6］。水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV），在外周實(shí)體瘤模型中取得了強(qiáng)大的抗腫瘤效果，之前的研究已經(jīng)產(chǎn)生了新型VSV突變體VSVΔ51，以努力提高VSV在OV治療中的安全性［7-8］。這種病毒在VSV M蛋白的第51位有1個(gè)氨基酸缺失，通過阻止病毒阻斷宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和核質(zhì)運(yùn)輸，包括干擾素（IFN）的產(chǎn)生，鞏固其治療指數(shù)［9］。感染VSVΔ51后，IFN途徑完整的非惡性細(xì)胞得到保護(hù)，而失去IFN反應(yīng)能力的惡性細(xì)胞被裂解［10］。

盡管一些口服OV治療癌癥的臨床前研究仍得到極大關(guān)注，但在臨床試驗(yàn)中，OV的治療效果達(dá)不到基于臨床前模型的療效預(yù)期［11］。因此，通過一些藥物與OV聯(lián)合或許可能是優(yōu)化其腫瘤細(xì)胞殺傷的有效策略。在本研究中，篩選了多種通過不同機(jī)制抑制腫瘤生長(zhǎng)的小分子藥物與VSVΔ51進(jìn)行聯(lián)合，觀察此組合對(duì)腫瘤的抑制活性。研究發(fā)現(xiàn)具有DNA-PK抑制能力的M3814可以顯著提高VSVΔ51的溶瘤活性，并表明這種增效作用是通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNAPK抑制劑M3814聯(lián)合VSVΔ51或許可以為肝癌的治療提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系人肝癌細(xì)胞Huh-7及Vero細(xì)胞獲取于美國模式菌種保藏庫（ATCC）。均培養(yǎng)在添加10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2條件下生長(zhǎng)。

1.1.2 主要試劑MTT及二甲基亞砜購自美國Sigma公司，組織裂解液購自美國Thermo Scientific公司，GAPDH購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司，anti-p-JNK購自CST公司，anti-E1及anti-caspase 12購自Abcam公 司，anti-DNA-PKcs購自R&D公 司。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Thermo Scientific公司。特異性siRNA和對(duì)照siRNA均購自蘇州金唯智生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒的獲取及滴度確定VSVΔ51是先前描述的印第安納VSV血清型的重組衍生物。該病毒由JOHN Bell博士和DAVID Stojdl博士（渥太華健康研究所）提供。VSVΔ51在Vero細(xì)胞中增殖，并且通過Vero細(xì)胞上的標(biāo)準(zhǔn)空斑分析方法定量病毒滴度［12］。

1.2.2 RNA沉默Huh-7細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒，分別將對(duì)照siRNA，特異性siRNA轉(zhuǎn)染至Huh-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后更換為含DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 靶細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)Huh-7細(xì)胞接種在96孔板中，5 000個(gè)/孔細(xì)胞，加入100 μl培養(yǎng)基。按照MOI值為0.01 PFU/個(gè)加入VSVΔ51，同時(shí)分別加入不同濃度的4種抗腫瘤機(jī)制不同的小分子化合物，DNA-PK抑制劑M3814，EGFR酪氨酸激酶抑制劑OSI-420，PI3K通路抑制劑ZSTK474以及c-Met抑制劑SGX523處理后，向細(xì)胞中加入MTT（終濃度1 mg/ml），在37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。去除含MTT的培養(yǎng)基，將MTT沉淀物溶解于100 μl DMSO中。使用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定吸光度。細(xì)胞存活率=［OD570（實(shí)驗(yàn)組）/OD570（對(duì)照組）］×100%。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)將各組腫瘤組織放在含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中勻漿，提取蛋白并進(jìn)行BCA定量。通過12%SDS-PAGE分離蛋白。電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，之后在5%脫脂奶粉溶液中封閉，并在4℃下與一抗（1∶1 500）孵育過夜。用TBST室溫下洗滌3次后，將PVDF膜與HRP山羊抗兔或抗小鼠二抗（1∶20 000）在室溫下孵育1.5 h。室溫下TBST洗滌3次后進(jìn)行曝光。使用Image J對(duì)條帶的強(qiáng)度進(jìn)行量化。GAPDH作為同型對(duì)照。

1.2.5 電 鏡 實(shí) 驗(yàn)用M3814或/和VSVΔ51（0.001 PFU/個(gè)）處理Huh-7細(xì)胞24 h。室溫下1 000 r/min離心5 min后收集細(xì)胞。然后將細(xì)胞顆粒重懸，用PBS洗滌1次，在1 500 r/min下離心5 min，并在含有2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）中冰上固定4 h。然后將樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)透射電子顯微鏡超微結(jié)構(gòu)分析。

1.2.6 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)本研究由深圳市第二人民醫(yī)院動(dòng)物倫理與福利委員會(huì)批準(zhǔn)。對(duì)于皮下異種移植模型，將Huh-7（6×106個(gè)/只）細(xì)胞接種于4周齡雌性BALB/c-nu/nu小鼠的后側(cè)皮下。6 d后，可觸及的腫瘤形成后（50 mm3），小鼠隨機(jī)分為4組。在6~8 d和12~14 d將VSVΔ51溶瘤病毒［2.5×107PFU/（kg·d）］尾靜脈注射，M3814［2 mg/（kg·d）］腹腔注射共6次。每3 d測(cè)量腫瘤長(zhǎng)度和寬度，按公式計(jì)算體積。體積=長(zhǎng)×寬2/2實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，剖出腫瘤組織拍照稱重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s表示，組間樣本比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同的小分子抑制劑與VSVΔ51聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制加入4種小分子抑制劑M3814、OSI-420、ZSTK474、SGX523。選 擇 極 低 劑 量 的VSVΔ51 OV（0.01 PFU/個(gè)），確保單獨(dú)的OV對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性很小。不同藥物與VSVΔ51的組合與Huh-7共孵育后檢測(cè)細(xì)胞存活。結(jié)果表明，隨著小分子藥物劑量的提升，M3814與VSVΔ51的組合與M3814單藥比較對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力顯著提高，而VSVΔ51與其他藥物的組合較單藥并無明顯的增效作用。結(jié)果表明M3814可以協(xié)同增強(qiáng)VSVΔ51的腫瘤殺傷能力。見圖1。

圖1 VSVΔ51與抗腫瘤藥物聯(lián)合對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性Fig.1 Cytotoxicity of VSVΔ51 combined with anti-tumor drugs to target cells

2.2 敲低DNA-PK對(duì)溶瘤病毒抗腫瘤能力的影響實(shí)驗(yàn)表明DNA-PK抑制劑可以增強(qiáng)溶瘤病毒的腫瘤抑制能力，接下來探索了敲低Hun-7的DNAPK對(duì)溶瘤細(xì)胞抗腫瘤活性的影響。結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的兩種siRNA都能有效降低DNA-PKcs的表達(dá)。細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)表明，敲低DNA-PKcs可以有效增強(qiáng)VSVΔ51對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。見圖2。這些結(jié)果表明，抑制DNA-PK的確可以增強(qiáng)VSVΔ51對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷活性。

圖2 VSVΔ51對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞毒作用Fig.2 Cytotoxicity of VSVΔ51 to siRNA transfected cells

2.3 M3814聯(lián)合VSVΔ51增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激OV裂解腫瘤細(xì)胞的一個(gè)主要機(jī)制是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此檢測(cè)了M3814是否通過該途徑增強(qiáng)抗腫瘤活性。將M3814與VSVΔ51單獨(dú)或聯(lián)合與Huh-7共孵育，通過電鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹程度來反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)。結(jié)果表明，M3814與VSVΔ51聯(lián) 合 給 藥 組 較M3814單 用 或VSVΔ51單用而言，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腫脹程度都顯著增強(qiáng)。結(jié)果表明，M3814與VSVΔ51聯(lián)合給藥可以顯著增強(qiáng)Huh-7細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)。見圖3。

圖3 DNA-PK抑制增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激Fig.3 DNA-PK inhibition enhances ER stress

2.4 M3814聯(lián)合VSVΔ51增強(qiáng)腫瘤抑制活性建立裸鼠皮下移植瘤模型來驗(yàn)證M3814聯(lián)合VSVΔ51的體內(nèi)抗腫瘤活性。通過檢測(cè)治療后腫瘤體積的變化，結(jié)果表明，M3814聯(lián)合VSVΔ51治療組可以顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)，而M3814或VSVΔ51單獨(dú)給藥組腫瘤抑制能力明顯弱于聯(lián)合治療組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后觀察腫瘤大小及稱量瘤重，結(jié)果表明，聯(lián)合治療組的腫瘤質(zhì)量明顯低于單獨(dú)給藥組。以上實(shí)驗(yàn)說明，M3814聯(lián)合VSVΔ51可以抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。見圖4。

圖4 體內(nèi)抗腫瘤作用Fig.4 Anti-tumor effects in vivo

2.5 M3814聯(lián)合VSVΔ51增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡收集治療后的腫瘤組織，進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明，VSVΔ51治療組中病毒蛋白E1含量明顯升高，說明VSVΔ51可以在腫瘤部位聚集。此外，較其他組別而言，p-JNK及c-caspase 12蛋白表達(dá)水平在聯(lián)合治療組中表達(dá)量顯著提高，說明腫瘤細(xì)胞的凋亡增加。結(jié)果說明，M3814聯(lián)合VSVΔ51可以有效增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而更好地發(fā)揮VSVΔ51的抗腫瘤功能。見圖5。

圖5 腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白的Western blot分析Fig.5 Western blot analysis of apoptosis-related proteins in tumor tissues

3 討論

OV作為一種新型抗癌藥物近年來發(fā)展迅速［13］。最著名的例子是美國食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的用于治療黑色素瘤的OV T-VEC［14］。然而，OV作為單一藥物在患者中的治療效果是有限的，因此有必要開發(fā)新的方案來最大限度地發(fā)揮OV治療的潛力［15］。

VSVΔ51因其在腫瘤細(xì)胞中特異性復(fù)制、良好的體內(nèi)穩(wěn)定性和良好的人體安全性而成為一個(gè)極具吸引力的OV候選物。尋找與VSVΔ51協(xié)同作用的小分子可能是優(yōu)化其腫瘤細(xì)胞殺傷的有效策略［16-17］。在這項(xiàng)研究中，通過基于不同信號(hào)通路的抗癌藥物的篩選，發(fā)現(xiàn)DNA-PK抑制劑可以與VSVΔ 51發(fā)揮協(xié)同作用。通過抑制腫瘤細(xì)胞中DNA-PK的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞對(duì)VSVΔ51的殺傷效果更加敏感，同時(shí)還探究了這種協(xié)同增效作用是因?yàn)镈NAPK抑制劑加劇了VSVΔ51誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中也證明這種聯(lián)合療法具有更強(qiáng)的腫瘤抑制能力。

靶向DNA-PK作為治療人類惡性腫瘤的干預(yù)手段，特別是增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療或放療的敏感性，具有 臨 床意義［18-20］。CC-122是 一 種DNA-PK抑制劑，處于Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT01421524），用于實(shí)體瘤、非霍奇金淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤。CC-115是一種DNA-PK和mTOR的雙重抑制劑，目前正處于治療晚期實(shí)體瘤和血液惡性腫瘤的Ⅰ期試驗(yàn)（NCT-01353625）。目前正在進(jìn)行結(jié)合放射治療，DNA-PK抑制劑MSC2490484A治療晚期實(shí)體腫瘤或慢性淋巴細(xì)胞白血病的Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT02516813和NCT02316197）。DNA-PK抑制劑VX-984聯(lián)合化療（NCT02644278）的安全性、耐受性和藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)研究已經(jīng)完成。臨床相關(guān)的DNA-PK抑制劑可能為OV的聯(lián)合治療提供很好的機(jī)會(huì)。

總體而言，研究表明，DNA-PK抑制劑與OV VSVΔ51聯(lián)合治療肝癌可以顯著提高治療效果，非常有希望在今后的臨床上為肝癌的治療提供新的方案。