黃欣 李欣怡 李成文（西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，瀘州646000）

Graves?。℅raves disease，GD）又稱為毒性彌漫性甲狀腺腫，是碘充足國家甲狀腺功能亢進的最常見原因，約占全部甲狀腺功能亢進癥的80%以上，影響0.5%~2.0%的人口［1-2］。未矯正的甲狀腺功能亢進癥患者死亡風(fēng)險增加，心血管疾病發(fā)病率高，包括心律失常，中風(fēng)和心力衰竭［3］。甲狀腺相關(guān)自身抗體的異常分泌是該病最突出的免疫學(xué)特征。促甲狀腺素受體抗體（thyrotrophin receptor anti‐body，TRAb）是與GD最密切的甲狀腺相關(guān)自身抗體，幾乎在每個該病患者中都可檢測到，但TRAb異常分泌的免疫學(xué)調(diào)控機制仍未完全明確。目前GD治療方法主要包括131I治療，抗甲狀腺藥物治療等，131I治療有效率高，但易發(fā)生甲減副作用不可逆，抗甲狀腺藥物治療治愈率低、易復(fù)發(fā)［4-6］。

黏膜相關(guān)恒定T細胞（mucosal-associated invari‐ant T，MAIT）是最新發(fā)現(xiàn)的一種非傳統(tǒng)T淋巴細胞。文獻報道，MAIT促進炎癥和腸道失調(diào)，導(dǎo)致肥胖期間的代謝功能障礙，促進T1D的發(fā)展，也參與了自身免疫性肝病中肝臟纖維化和SLE的發(fā)病［7-10］。也有文獻報道MAIT參與了抗SARS-CoV-2和抗帶狀皰癥病毒的免疫應(yīng)答［11-13］。但目前尚無研究報道MAIT在GD中的免疫學(xué)作用。本研究初步探討了MAIT在GD中的免疫學(xué)作用，擬為GD的免疫治療提供新靶點。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料GD患者為2019年5月至2020年6月期間在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科和內(nèi)分泌科就診患者。收集30例GD初治患者為治療前組，男、女各15例，平均年齡44.62歲；其中19例131I治療3個月后的GD患者為治療后組，男10例，女9例，平均年齡47.58歲；收集25例該院健康體檢中心的健康體檢者為對照組，男11例，女14例，平均年齡39.80歲。19例131I治療3個月后的GD患者與治療前為同一批患者。治療后組納入標準：符合《中國甲狀腺疾病診治指南》GD疾病診斷標準；自愿參加本試驗，簽署知情同意書，能遵守研究要求的患者。排除標準：腫瘤、傳染病、妊娠期甲亢、炎癥甲亢患者；T1D、SLE等自身免疫性疾病患者；近期內(nèi)用過抗甲狀腺藥物、放射性碘等治療患者；重要臟器嚴重受損者。該研究通過西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批并按要求執(zhí)行。3組臨床資料比較見表1。

表1 3組臨床資料比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics among three groups

1.1.2 試劑APC-CY7-抗CD3、PE-抗CD161、PE-抗Human Invariant NKT（6B11）、APC-抗CD69、PECY7-抗IFN-γ、APC（AF647）-抗GrzB、Human BD Fc Block、Leukocyte Activation Cocktail、Human TGF-β、IFN-γ、IL-17A和IL-4 Flex set購自美國BD公司；LEGENDplexTMMul-Analyte Flow Assay Kit、percpcy5.5-抗TCR Vα7.2、PE-CY7-抗Annexin V、Zombie GreenTMFixable Viability Kit購自美國BioLegend公司；1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；Recombinant Hu‐man IL-12p70購 自Pepro Tech公 司；Recombinant Human IL-18購自R&D Systems公 司；Ficoll-plaque plus購 自GE healthcare公 司；總RNA提 取 試 劑RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標本制備采集健康志愿者及患者EDTA抗凝血，先分離血漿用于測定細胞因子，再用Ficollplaque plus分離余下外周血單個核細胞后計數(shù)，部分細胞用于提取總RNA后測定mRNA，剩余細胞凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多色流式細胞染色PBMCs復(fù)蘇后，按照抗體試劑盒使用說明書進行多色流失細胞染色再用流式細胞儀檢測。

1.2.3 檢測血漿細胞因子采用微量樣本多指標蛋白定量技術(shù)（cytometric bead array，CBA）檢測IFN-γ、IL-4、IL-17A和TGF-β，多細胞因子檢測技術(shù)（LEG‐ENDplex）檢測IL-12p70和IL-18，按照試劑說明書采用流式細胞儀快速測定待檢血漿細胞因子。

1.2.4 細胞因子mRNA檢測

1.2.4.1 總RNA的提取用氯仿提取總RNA，測量OD260/OD280和樣品濃度并用瓊脂糖電泳檢測18 S和28 S條帶的完整性。

1.2.4.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)PCR儀中42℃反應(yīng)2 min去除基因組DNA后，進行反轉(zhuǎn)錄，PCR反應(yīng)條件：37℃15 min；85℃5 s；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束，將cDNA瞬時離心后凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.3 qRT-PCR定量檢測mRNA反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；60℃延伸30 s，循環(huán)40次。采用β-actin作內(nèi)參基因，以公式ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCt（實驗組）-ΔCt（對照組均值）計算細胞因子基因相對表達量。

1.2.5 體外MAIT培養(yǎng)健康對照組和GD患者治療前組PBMCs分別為刺激組和未刺激組，刺激組均加入IL-12p70（10 ng/ml）和IL-18（100 ng/ml），培養(yǎng)24 h后各組均分別取部分細胞檢測細胞表面標志和細胞內(nèi)細胞因子，剩余細胞繼續(xù)培養(yǎng)96 h后流式細胞術(shù)檢測各組凋亡率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理由GraphPad Prism 7.0（Graph‐Pad軟件）分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布、等方差的資料采用t檢驗或one way ANOVA進行組間比較；對于非正態(tài)分布的資料，采用Mann-WhitneyU檢驗或Kruskal-Wallis秩和檢驗進行比較，配對資料采用Wilcoxon配對符號秩和檢驗進行比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GD患者治療前、后組外周血MAIT頻率及表型和功能變化將CD3+TCR Vα7.2+CD161+的細胞認定為MAIT，檢測3組外周血MAIT頻率，與對照組相比，GD患者治療前組MAIT頻率顯著降低（P<0.01）；治療后組也顯著降低（P<0.05）；與治療前組相比，治療后組MAIT頻率輕度升高（P>0.05，圖1）。

圖1 健康對照組和GD患者治療前、后組MAIT頻率Fig.1 Frequency of MAIT of healthy controls，GD pa?tients of before treatment and GD patients of after treatment

檢測3組外周血MAIT的表面標志和胞內(nèi)細胞因子結(jié)果，與對照組相比，GD患者治療前組CD69水平顯著升高（P<0.000 1）；治療后組也顯著升高（P<0.001）；和治療前組相比，治療后組CD69輕度升高（P>0.05），圖2A。經(jīng)PMA和離子霉素刺激后，與對照組相比，GD患者治療前組MAIT胞內(nèi)IFN-γ水平顯著降低（P<0.000 1，圖2B），GrzB水平升高（P<0.05，圖2C）；治療后組MAIT胞內(nèi)IFN-γ水平顯著降低（P<0.001，圖2B），GrzB水平顯著升高（P<0.01，圖2C）。與治療前組相比，治療后組MAIT胞內(nèi)IFN-γ水平升高（P>0.05，圖2B），GrzB水平升高（P>0.05，圖2C）。

圖2 健康對照組和GD患者治療前、后組MAIT表面標志和胞內(nèi)細胞因子頻率Fig.2 Frequency of MAIT and their surface markers and intracellular cytokines in healthy controls，GD pa?tients of before treatment and GD patients of after treatment

將未治療的GD患者外周血中FT3、FT4、TSH和TRAb的濃度與外周血中MAIT頻率、表面標志、胞內(nèi)細胞因子頻率做相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)TRAb的濃度與表達CD69的MAIT頻率呈顯著正相關(guān)（r=0.709 7，P<0.01，圖3K），但其他指標之間無相關(guān)性（P>0.05，圖3）。

圖3 未治療的GD患者外周血中甲狀腺素、TRAb的濃度與外周血中MAIT頻率、表面標志、胞內(nèi)細胞因子頻率的相關(guān)性Fig.3 Correlation between concentrations of thyroxine and TRAb in peripheral blood and frequency of MAIT，surface markers and intracellular cytokines of untreated GD patients

2.2 甲狀腺中重度腫大患者外周血MAIT的頻率與功能變化依據(jù)GD患者甲狀腺的腫大程度，將甲狀腺一度腫大的未治療GD患者設(shè)為甲狀腺輕度腫大組，甲狀腺二度、三度腫大的未治療GD患者分為甲狀腺中重度腫大組，分析兩組間MAIT頻率、MAIT表面CD69的表達、胞內(nèi)IFN-γ和GrzB分泌的差異。與健康對照組相比，中重度組MAIT的頻率顯著降低（P<0.01，圖4A），CD69顯著升高（P<0.001，圖4B），IFN-γ水平顯著降低（P<0.001，圖4C），GrzB水平升高（P<0.05，圖4D）；輕度組MAIT頻率降低（P>0.05，圖4A），CD69水平顯著升高（P<0.01，圖4B），IFN-γ水平顯著降低（P<0.01，圖4C），GrzB水平有所提高（P>0.05，圖4D）。中重度組與輕度組相比，MAIT頻率降低（P<0.05，圖4A），CD69水平升高（P<0.05，圖4B），IFN-γ水平降低（P>0.05，圖4C），GrzB水平升高但無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖4D）。

圖4 健康對照組和GD患者不同病情程度中MAIT、表面標志和胞內(nèi)細胞因子的頻率Fig.4 Frequency of MAIT and their surface markers and intracellular cytokines in healthy controls and patients with different degrees of disease in GD patients

2.3 GD患者存在Th1/Th2、Th17/Treg免疫失衡為探索MAIT在GD中的免疫作用，檢測了3組血漿細胞因子IL-4、IL-17A、IFN-γ、TGF-β含量。與對照組相比，GD患者治療前組血漿IFN-γ顯著升高（P<0.000 1，圖5A），IL-4顯著升高（P<0.01，圖5B），IL-17A顯著升高（P<0.000 1，圖5C），TGF-β降低（P>0.05，圖5D）；GD患者治療后組IFN-γ顯著升高（P<0.001，圖5A），IL-4升高（P>0.05，圖5B），IL-17A顯著升高（P<0.00 1，圖5C），TGF-β顯著升高（P<0.000 1，圖5D）。治療后和治療前組相比，治療后IL-17A顯著降低（P<0.01，圖5C），TGF-β顯著升高（P<0.000 1，圖5D），IFN-γ降低（P>0.05，圖5A），IL-4降低（P<0.05，圖5B）。基因水平檢測了外周血單個核細胞中IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA、IL-17A mRNA和TGF-β mRNA的相對表達，結(jié)果與3組血漿中各種細胞因子蛋白表達水平一致。見圖5E~H。

圖5 健康對照組和GD患者治療前、后組血漿中的IL-4、IL-17A、IFN-γ、TGF-β的 頻 率 和PBMCs中IL-4 mRNA、IL-17A mRNA、IFN-γ mRNA、TGF-β mRNA的相對表達Fig.5 Frequency of IL-4，IL-17A，IFN-γ，TGF-β in plas?ma and relative expression of IL-4 mRNA，IL-17A mRNA，IFN-γ mRNA，TGF-β mRNA in PBMCs in healthy controls，GD patients of before treatment and GD patients of after treatment

2.4 GD患者MAIT的IL-12和IL-18激活途徑及基礎(chǔ)凋亡率檢測檢測三組血漿細胞因子IL-12p70和IL-18發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，GD患者治療前組IL-12p70升高（P<0.05，圖6A），IL-18顯著升高（P<0.01，圖6B）；GD患者治療后組IL-12p70升高（P<0.05，圖6A），IL-18顯著升高（P<0.000 1，圖6B）。治療后與治療前相比，IL-12p70和IL-18輕度升高（P>0.05，圖6A、6B）?；蛩綑z測了外周血單個核細胞中IL-12p70 mRNA和IL-18 mRNA表達，結(jié)果與蛋白水平檢測結(jié)果一致，見圖6C、D。

圖6 健康對照組和GD患者治療前、后組血漿中IL-12p70、IL-18頻 率 和PBMCs中IL-12p70 mRNA、IL-18 mRNA的相對表達Fig.6 Frequency of IL-12p70，IL-18 in plasma and rela?tive expression of IL-12p70 mRNA，IL-18 mRNA in PBMCs in healthy controls，GD patients of be?fore treatment and GD patients of after treatment

GD患者治療前組與對照組的PBMCs分別加IL-12p70和IL-18重組蛋白體外培養(yǎng)24 h后，治療前組和健康人對照組MAIT表面CD69的表達，胞內(nèi)IFN-γ和GrzB的產(chǎn)生均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05，圖7A~C）。提示GD患者MAIT的IL-12和IL-18激活途徑正常。

圖7 健康對照組和GD患者MAIT的凋亡Fig.7 Apoptosis of MAIT cells in healthy controls and GD patients

檢測治療前GD患者組和對照組的基礎(chǔ)凋亡率顯示，治療前GD患者凋亡率顯著高于健康人對照組（P<0.001，圖7D）。將GD患者治療前組分為GD患者刺激組和GD患者未刺激組，對照組分為刺激組和未刺激組，將各組的PBMCs分別加IL-12p70和IL-18重組蛋白體外培養(yǎng)5 d后，結(jié)果顯示對照刺激組凋亡率顯著高于其未刺激組（P<0.05，圖7E），GD患者刺激組凋亡率也顯著高于其未刺激組（P<0.05，圖7F），且對照刺激組培養(yǎng)5 d后，檢測到MAIT的CD69表達顯著高于未刺激組（P<0.01，圖7G）。結(jié)果提示IL-12和IL-18促進了GD患者MAIT的活化和活化后凋亡。

3 討論

研究報道表明MAIT既可致病也可治病［7-13］。目前尚無研究報道MAIT在GD中的免疫學(xué)作用。激活的MAIT主要通過分泌GrzB、IFN-γ和IL-17A發(fā)揮作用。文獻報道體外培養(yǎng)的T1D患者的MAIT可能通過產(chǎn)生GrzB直接殺死胰腺β細胞，MAIT分泌的GrzB在局部抗結(jié)核免疫中也發(fā)揮重要作用［8，14］。GrzB具有誘導(dǎo)細胞凋亡的功能，極低濃度的GrzB即可殺傷細胞［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)離子霉素和PMA刺激培養(yǎng)后，與對照組比較，GD中重度組患者MAIT產(chǎn)生的GrzB顯著增多，輕度組有升高趨勢；GD治療前和治療后患者組MAIT產(chǎn)生的GrzB均顯著升高；治療后組與治療前組比較，GrzB有升高趨勢，圖2C、3D，以上結(jié)果提示MAIT可能通過分泌GrzB殺傷甲狀腺細胞發(fā)揮抗GD作用。

CD69是MAIT的活化標志。本研究發(fā)現(xiàn)GD治療前組和治療后組外周血中MAIT表達的CD69都顯著高于健康人對照組；患者治療后組與治療前組比較，MAIT表達的CD69呈降低趨勢，提示治療有效。GD中重度組和輕度組患者MAIT表達的CD69均顯著高于健康人對照組，且中重度組也顯著高于輕度組。結(jié)果表明GD患者的MAIT處于活化狀態(tài)，且甲狀腺腫大程度越大活化程度越高，圖2A、3B，提示MAIT可能參與了抗GD過程。同時還發(fā)現(xiàn)，未治療的GD患者外周血中表達CD69的MAIT頻率和TRAb濃度呈正相關(guān)。而TRAb濃度越大代表病情越重，即GD患者外周血中的TRAb濃度越大，病情越重，活化的MAIT越多，則會產(chǎn)生的更多的GrzB對甲狀腺細胞產(chǎn)生殺傷作用，有利于減輕甲狀腺功能亢進，進一步提示MAIT參與抗GD。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，GD患者輕度組外周血MAIT頻率呈降低趨勢，中重度組外周血MAIT頻率顯著降低，提示MAIT參與了抗GD作用。GD患者治療后MAIT頻率略高于治療前，提示治療有效；但治療前和治療后組外周血均顯著低于對照組，可能由于一是GD患者外周血活化的MAIT分泌GrzB發(fā)揮抗GD作用后發(fā)生凋亡，因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)GD患者治療前組MAIT凋亡率高于對照組，且兩組MAIT都分別經(jīng)IL-12p70和IL-18刺激培養(yǎng)后，刺激組的凋亡率均高于未刺激組，而且對照組刺激后MAIT表面CD69顯著高于未刺激，提示高水平的IL-12p70和IL-18促進了GD患者MAIT的活化和活化后凋亡。二是GD患者外周血中MAIT可能遷徙到甲狀腺局部參加抗GD，因有研究報道，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者循環(huán)MAIT頻率的減少是由于募集到了具有炎癥的滑膜組織［16］。GD通常選用藥物治療或131I治療，選擇切除甲狀腺組織治療的患者很少，所以本研究未收集到GD患者甲狀腺組織樣本進行分析，尚存在不足。進一步研究可進行小鼠GD造模，取小鼠外周血以及甲狀腺組織進行分析。

MAIT主要通過TCR-MR1-核黃素代謝物的經(jīng)典激活途徑和IL-12、IL-18旁路激活途徑被激活［17］。未見研究報道GD患者體內(nèi)存在微生物群的變化，因此GD患者外周血MAIT的表型、功能變化及MAIT丟失可能與MAIT的IL-12和IL-18途徑激活有關(guān)。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)GD患者血漿IL-12和IL-18顯著升高，IL-12p70 mRNA和IL-18 mRNA水平也顯著升高，提示GD患者MAIT存在IL-12和IL-18激活途徑。但將IL-12p70和IL-18刺激GD患者和健康志愿者外周血PBMC 24 h后，結(jié)果GD患者與健康對照組相比，MAIT表面CD69的表達以及胞內(nèi)IFN-γ和GrzB均差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示GD患者MAIT的IL-12和IL-18激活途徑正常。

IFN-γ是MAIT發(fā)揮作用的另一重要細胞因子。血漿中GD患者治療前、治療后組IFN-γ均顯著高于健康對照組，治療前升高是由于GD是自身免疫病，機體的免疫應(yīng)答過強所致，治療后升高可能是過強的免疫應(yīng)答還未恢復(fù)到正常，也可能是免疫應(yīng)答偏向Th1型，治療后與治療前相比，IL-4顯著降低。但經(jīng)離子霉素和PMA刺激培養(yǎng)后，GD中重度組和輕度組患者MAIT分泌的IFN-γ均顯著低于健康對照組，且中重度組比輕度組有降低趨勢，這與IFN-γ分泌越低，免疫應(yīng)答越偏向于Th2型，病情越重相吻合；且刺激培養(yǎng)后治療前和治療后組MAIT分泌的IFN-γ均顯著低于健康對照組，結(jié)果表明GD患者MAIT分泌IFN-γ功能受損，與文獻報道一致，導(dǎo)致Th2型應(yīng)答增強［13，16］；而治療后組比治療前組的IFNγ分泌有升高趨勢，表明治療有效，免疫應(yīng)答偏向于Th1型。

本研究也發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，GD患者治療前組血漿中IFN-γ和IL-4均顯著升高，且IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA均顯著升高，提示GD患者體內(nèi)的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答都顯著增強；GD患者治療后組IFN-γ顯著升高，IL-4升高無統(tǒng)計學(xué)意義；且治療后組與治療前組比較，IFN-γ降低無統(tǒng)計學(xué)意義，而IL-4顯著降低，這表明治療后Th2應(yīng)答減弱，偏向于Th1應(yīng)答，提示GD患者中存在Th1/Th2失衡。與健康對照組相比，GD患者治療前組血漿中IL-17顯著升高，TGF-β則呈下降趨勢，提示GD患者存在Th17/Treg失衡；治療后組與治療前比較，IL-17顯著降低，TGF-β顯著升高，提示Treg細胞抑制自身免疫和炎癥反應(yīng)，Th17/Treg趨向平衡，表明治療有效。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)GD患者治療前、后組外周血MAIT均顯著降低，活化標志CD69表達均顯著升高，分泌的GrzB顯著升高，且病情越重，MAIT降低越多，以上結(jié)果均提示MAIT發(fā)揮抗GD作用，IL-12和IL-18可能促進了MAIT的活化和凋亡。因此，檢測GD患者MAIT的頻率和功能有助于判斷病情及為GD的免疫治療提供新靶點。