徐鵬

（1廣東以色列理工學院化學工程系，廣東 汕頭 515063；2馬里蘭大學巴爾的摩分?；瘜W、生化與環(huán)境工程系，馬里蘭州 巴爾的摩21250，美國）

1 追憶王義翹教授

王義翹先生出生于1936 年的南京，時值日軍全面侵華前夕，風雨飄搖的故國六朝之都也給先生少年階段的成長烙下了家國的印記。他的父親王守競先生（1904—1984）早年留學美國，是近代史上最早從事量子物理研究的中國人，1926年在哥倫比亞大學取得理論物理博士學位。1929 年夏，王守競先生學成歸國，擔任國立浙江大學教授、物理系主任，隨后組建中國物理學會。1936年，王守競先生被國民政府任命為少將專員，負責籌建中央機器廠，主要研發(fā)大型發(fā)電機和大型汽輪機等軍工裝備。抗戰(zhàn)勝利后，少年的王義翹也隨家人僑居美國馬塞諸塞州的波士頓，其父親加入了美國國防部與麻省理工學院共建的林肯國家實驗室，任職科學家。隨后王先生入讀MIT，1959 年和1961 年分別取得化學工程的學士學位和碩士學位。1963 年在賓夕法尼亞大學取得化學工程博士學位，師從生化工程先驅Arthur Humphrey 教授。王先生早期著述集中于抗生素通風發(fā)酵過程的物質傳遞、過程放大及生化動力學等工程學領域，為Merck制藥早期抗生素工藝的開發(fā)奠定了基礎。1965 年起，王先生開始在麻省理工學院化學工程系和生物工程系任教，于1985 年創(chuàng)建了生物工程技術中心（Biotechnology Process Engineering Center，BPEC），擔任中心主任。1986 年當選美國國家工程院院士，1996 年成為麻省理工學院資深學院教授（MIT Institute Professor）之一（麻省理工學院最高榮譽）。

王先生一生在MIT 從教、授業(yè)55 余年，兢兢業(yè)業(yè)，幾乎從未退休。我2013 年開始在MIT 的化工系從事博士后課題研究，經(jīng)常與王先生課題組的博士后研究員交流。我的課題研究也受益于王先生早年創(chuàng)建的生物工程技術中心。我有幸擔任過MIT 暑期課程“發(fā)酵工程”的助教（當時王先生年事已高，由MIT 其他老師授課），王先生的“發(fā)酵工程”開課50 余年來，其學術思想也浸潤了幾千位生物制藥領域的前沿科學家和精英工程師。在MIT 56 號樓和一些校內(nèi)報告廳，以及美國化學工程師學會（AIChE）年會期間，我有幸與王先生有過幾次偶遇，王先生講話幽默風趣，熱愛中華傳統(tǒng)文化和中式美食，對晚輩后生愛護有加。猶記得，2015 年夏天，“發(fā)酵工程”課程結業(yè)時，王先生坐著輪椅，與來自世界各地的50 多位畢業(yè)學員親切交談，對晚輩后生愛護之情溢于言表。傍晚的查爾斯河畔涼風習習，楊柳依依，畢業(yè)晚宴上大家暢談學術理想，共享中式美食和波士頓龍蝦……

1985 年后，王先生的主要研究方向由微生物研究轉入了動物細胞培養(yǎng)，成為了最早研究動物細胞培養(yǎng)和生物大分子制藥（抗體蛋白等）的先驅科學家之一。王先生一生桃李滿天下，其弟子門生遍布美國和東亞地區(qū)，很多人都成為業(yè)界翹楚，創(chuàng)建了各種類型的生物科技公司，比如Biogen、Moderna、義翹神州科技、Genentech 的創(chuàng)立都與王先生及其弟子的指導密切相關，王先生也受聘于50 多家生物制藥公司擔任科技咨詢顧問。王先生的學生Noubar B.Afeyan 博士目前擔任旗艦先鋒創(chuàng)投（Flagship Pioneering Venture）公司的總裁，是生物制藥新銳Moderna 及其他38 家生物科技公司的創(chuàng)始人；Johnathan Dordick 博士是倫斯勒理工學院的講席教授（美國工程院院士），創(chuàng)立了三家生物科技公司（EnzyMed、Solidus Biosciences Inc、Redpin Therapeutics）；陳超群博士（Chen Chau-Chyun）目前擔任得州理工大學的講席教授（美國工程院院士），是Aspen 公司的創(chuàng)始人及副總裁；謝良志博士是義翹神州科技的創(chuàng)始人及總裁。

王先生一生著述豐厚，發(fā)表了230余篇科技論文［1］，每一篇論文都腳踏實地，注重工程實踐與基礎理論的結合，為我們后世生物工程學者之楷模。鑒于王先生對生物工程技術的開創(chuàng)性工作，美國化學工程師學會（AIChE）、美國化學學會（ACS）以及MIT 都設立了以王義翹先生名字命名的生化工程論壇，用以紀念王先生的卓越貢獻。本人有幸蒙先生教誨，被提名并獲取了2020 年“生物工程與生物技術王義翹獎”（Biotechnology&Bioengineering Daniel IC Wang Award），于8月初在ACS 年會發(fā)表獲獎報告感言并回顧先生貢獻，不想先生8 月29 日仙逝，心中無限悲戚，生化工程領域隕落了一位世界級的學者和先驅，我們也痛失了一位學貫中西、德高望重的師長。王先生高風亮節(jié)，治學嚴謹，心懷家國，提攜后進，為我后輩楷模。此文總結的工作，很大程度上受益于王先生在MIT 創(chuàng)建的生物工程技術中心；謹以此文，總結并展望我和同事在MIT 所從事的主要工作，以寄托對先生的哀思，紀念先生的貢獻。愿我們傳承先生遺風，肩負先生的治學理念，解決關系國計民生的實際問題，為國為民，腳踏實地地推進生化工程領域的工作，不負先生的教誨。繆改前人詩作一首，以作對先生家世的感懷，與讀者共勉：

不堪風雨亂紅塵，

入山何處白云深。

故園咫尺千山路，

天涯猶有未歸人。

（作者注：前兩句出自國學大師南懷瑾的詩集，第三句源于清代詞人鄭板橋的《酷相思》，第四句出自明代文人徐熥的《寄弟》。）

2 引言

功能性油脂化合物與我們的日常生活息息相關。常見的功能性油脂化合物包括脂肪酸、羥基脂肪酸、脂肪醇、甘油三酯和磷酸甘油酯等（圖1）。其結構共性為含有一個長鏈的脂肪酸骨架，由于碳鏈長度、不飽和度以及所攜帶的功能基團的差異，進而產(chǎn)生了油脂化合物獨特的雙親特性（amphiphilic）、凝固點（freezing point）和熱力學自組裝（thermodynamic self-assembly）特性。眾所周知，生物膜磷脂雙分子層提供了生命存在的原始屏障和生物膜的流體動力學特性，使得細胞個體能夠在不同環(huán)境條件下，與外界保持動態(tài)的物質交換平衡；不同溫度和培養(yǎng)環(huán)境下，生物膜磷脂中脂肪酸的組分也迥異（在古菌等極端微生物中，細胞膜脂肪鏈以甘油醚的形式存在）。

圖1 油脂的分子結構及重要脂肪酸分子Fig.1 The basic structure of triglyceride and the four impor?tant fatty acids:palmitic acid(C16∶0),oleic acid(C18∶1),linoleic acid(C18∶2),eicosapentaenoic acid(EPA,C20∶5)and α-linolenicacid(ALA,C18∶3).

功能性油脂廣泛應用于食品營養(yǎng)、醫(yī)藥保健、美容護膚、動物飼料以及農(nóng)業(yè)環(huán)保等諸多領域。ω-3 和ω-6 多不飽和脂肪酸，主要應用于嬰幼兒奶粉，并有抗衰老、促進心血管健康等保健功效［2］；羥基脂肪酸可以用于藥物傳遞載體以及聚合物單體；脂肪醇可用于保護涂層、潤滑劑、乳化劑和化妝洗護用品領域。各種植物果實中的油脂（主要以甘油三酯的形式存在，比如棕櫚油、大豆油、可可脂、橄欖油、葵花籽油和花生油等），由于其獨特的結晶溫度和凝固點，賦予了其獨特的質地（texture）和口感（mouthful feeling），廣泛用于食品、糖果、巧克力點心和美容護膚等領域。動物的結構性油脂（structuring fat）決定了大多數(shù)美食細膩豐富的口感，比如西班牙火腿、北京烤鴨、神戶牛排和法國鵝肝等（圖2），被視為肉類中的珍品，油脂對這些美食的風味及口感起到了不可替代的作用。黃油（butter）主要提煉自奶油，含有較多的短鏈脂肪酸，成為人們?nèi)粘ｏ嬍持斜貍涞牟牧?。臨床測試及運動醫(yī)學表明，健康的脂肪酸飲食，尤其是多不飽和脂肪酸中ω-3 與ω-6 脂肪酸的比例，與抗炎、皮膚健康、增肌減肥和免疫等機體功能有直接的關聯(lián)［3］。

圖2 油脂決定了一些肉類食物的口感Fig.2 Lipids determine the mouthful feeling of major meat products:Iberico ham,Peking roasted duck,Kobe beef and Foie gras.

植物油脂的大量需求造成了熱帶雨林破壞，氣候變遷、生態(tài)多樣性的流失以及其他諸多環(huán)境和社會問題［4-5］。微生物發(fā)酵不依賴于耕地和環(huán)境氣候，能夠高效轉化農(nóng)業(yè)廢棄可再生資源（比如生物質纖維素等原材料），因此構建可持續(xù)性油脂微生物發(fā)酵平臺是目前亟待解決的關鍵技術［6-7］。產(chǎn)油解脂耶氏酵母近來備受代謝工程領域的青睞，其原因如下：培養(yǎng)條件簡單，能夠利用多種底物（包括揮發(fā)性有機酸及脂肪烴和石蠟等化合物）快速生長［8-9］，無Crabtree效應（不產(chǎn)乙醇）［10］，基因組中內(nèi)含子密度低，便于遺傳操作，遺傳工具特別是近年來基于Cas9［11］或者Cpf1［12-15］的基因編輯工具以及Golden-gate［16-19］和YaliBrick［20-21］克隆方法的開發(fā)，眾多分子轉錄元件的鑒定［22-23］，以及基于Cre-LoxP 位點的多輪基因整合技術的實現(xiàn)［24］，使得解脂耶氏酵母成為了微生物油脂積累研究工作的新寵，解脂耶氏酵母也成為了生產(chǎn)單細胞油脂及衍生物的首選底盤宿主［25-26］。本文將從植物油脂的市場近況出發(fā)，引導讀者認識到目前油脂供應鏈所面臨的可持續(xù)發(fā)展等嚴峻問題，以及發(fā)展微生物油脂轉化平臺的嚴重性和迫切性；圍繞產(chǎn)油酵母的高通量篩選及表型鑒定、碳源轉化率（yield）、發(fā)酵滴度（titer）、生產(chǎn)速率（productivity）、菌體生長適用性（fitness）、代謝調控和生化動力學模型等方面，作者將闡述關鍵的代謝工程及合成生物學策略，并對利用解脂耶氏酵母生產(chǎn)高附加值植物油脂的經(jīng)濟可行性與技術可行性進行展望。

3 棕櫚油和可可脂需求激增所帶來的負面環(huán)境效應及可持續(xù)發(fā)展問題

根據(jù)美國農(nóng)業(yè)部的報道，全球每年的植物油需求量達到了2 億噸，并且每年以3%～4.5%的比例增長。棕櫚油占據(jù)了全球植物油脂總量的40%，2020 年全球棕櫚油的需求量為8000 萬噸，主要用于食品飲料、能源、個人護理、化工原料以及醫(yī)藥等領域。棕櫚油原材料的年銷售額達到了800億美元（棕櫚油的價格大致為1000 美元/噸）。其他大宗植物油包括菜籽油、花生油、玉米油和葵花籽油等。全球3/4 的棕櫚油產(chǎn)自東南亞地區(qū)的馬來西亞以及印度尼西亞，棕櫚油及棕櫚園的開發(fā)成為當?shù)氐闹饕?jīng)濟來源。自1985 年以來，全球棕櫚油的需求每年以6%～7%的比例增長，棕櫚園的過分開發(fā)造成了熱帶雨林的破壞（deforestation）［4-5］，例如加里曼丹島（馬來西亞稱為婆羅洲島，面積為75萬平方公里，亞洲第一大島，世界第三大島）65%的熱帶雨林已經(jīng)消失，進而導致當?shù)貧夂蜃兓徒涤隃p少，生態(tài)多樣性的喪失、氣候的變遷以及棕櫚油產(chǎn)業(yè)帶來的環(huán)境污染進而惡化當?shù)氐淖貦皥@經(jīng)濟，目前的農(nóng)耕和育種技術僅能保證2%～3%的棕櫚油產(chǎn)量增長，現(xiàn)實中一個嚴峻的問題是，全球每年仍有4%的棕櫚油缺口（市值大概32億美元）亟需用可替代的生物技術加以解決。

與棕櫚油經(jīng)濟極為相似，全球可可脂的供應鏈也受到了極大的影響。全球80%的可可脂產(chǎn)自非洲中西部國家，包括科特迪瓦、加納、喀麥隆和尼日利亞等?？煽晒╟oconuts）中提取的可可脂是制造巧克力的主要成分，全球可可果（cocoa beans）目前年均采集量為500 萬噸，每噸可可果的價值在3300 美元，可可果原材料市場價值為165億美元，而成品巧克力銷售額已經(jīng)達到1310億美元，到2025 年，成品巧克力的市場預期在1800 億美元左右，目前可可果原材料的供應遠不能達到市場的增量需求，造成了大約500億美元成品巧克力的市場缺口。經(jīng)營可可園也成為非洲中西部地區(qū)農(nóng)民的主要經(jīng)濟來源，同樣由于氣候的變遷、降雨的減少，農(nóng)耕技術的停滯不前，造成當?shù)責釒в炅值倪^量砍伐［27-28］，進而導致當?shù)亟?jīng)濟與環(huán)境的惡化以及諸多社會倫理問題（比如因貧困導致的兒童失學以及雇傭童工、奴工與男權盛行等社會問題）。為達成可持續(xù)性的發(fā)展目標，世界主要巧克力生產(chǎn)商，包括瑪氏（Mars）、雀巢（Nestlé）、德芙（Dove）、費列羅（Ferrero Rocher）、好時（Hersey’s）、歌帝梵（Godiva）等公司均提出了未來5～10年用可持續(xù)性的可可脂完全替代傳統(tǒng)可可脂的發(fā)展藍圖。

從上述棕櫚油和可可脂的產(chǎn)量及未來市場預期，我們可以得出如下結論：植物油脂的供應已經(jīng)成為了全球經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展的瓶頸之一。為了保證經(jīng)濟的可持續(xù)性發(fā)展及解決當?shù)氐沫h(huán)境資源問題，解脂耶氏酵母優(yōu)良的產(chǎn)油性能，將為我們實現(xiàn)高效細胞農(nóng)業(yè)經(jīng)濟（cellular agriculture economy）提供可能。因此，揭示產(chǎn)油酵母油脂合成的生化過程及代謝調控機制，構建可持續(xù)的微生物油脂平臺，將能使我們較少依賴棕櫚園與可可園農(nóng)業(yè)經(jīng)濟，進一步遏制熱帶雨林的濫伐以及降低溫室氣體的排放，由此將會帶來巨大的環(huán)境和生態(tài)效益，促進可持續(xù)性的細胞農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展，也能夠促進當?shù)孛裆睒s和早日實現(xiàn)全球碳達峰以及碳中和（carbon-neutrality）的目標。

4 構建解脂耶氏酵母油脂細胞工廠的代謝工程與生化工程策略

由于解脂耶氏酵母獨特的乙酰輔酶A 供應模式和不同代謝途徑的精細分區(qū)，其合成malonyl-CoA 和HMG-CoA的效率很高。以解脂耶氏酵母為平臺，經(jīng)代謝工程改造后，該酵母已經(jīng)被用來生產(chǎn)一系列化合物，包括三乙酸內(nèi)酯（triacetic acid lactone）［29-30］、赤蘚糖醇［31］、脂肪醇［32-33］、脂肪烴［34］、ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸［35］、黃酮［36-38］、角鯊烯（squalene）［39-41］、青蒿二烯（amorphadiene）［42］、白藜蘆醇（resveratrol）［43-44］、對香豆酸（pcoumaric acid）［44］以及具有玫瑰香味的2-苯乙醇［44-45］、具有桃子香味的丁位癸內(nèi)酯（δdecalactone或γ-decalactone）［46-48］、具有抗腫瘤化療價值的紫桿菌素（violacein）［21，44］、具有抗病毒作用的天然產(chǎn)物［49］等高附加值化合物。由于細胞內(nèi)獨特的油脂疏水環(huán)境和代謝途徑的分區(qū)定位，解脂耶氏酵母尤其適合表達植物次級代謝產(chǎn)物的代謝途徑［10，50］，例如萜烯類化合物的合成需要特異性的細胞色素P450 氧化還原酶，解脂耶氏酵母內(nèi)質網(wǎng)和脂質體為P450 的區(qū)位選擇性和立體選擇性以及高效電子傳遞提供了獨特的微環(huán)境［10，50］。南京師范大學的黃和課題組［51］、馬里蘭大學徐鵬課題組［10］和清華大學的李春課題組［52］已經(jīng)對此內(nèi)容進行了詳細的總結，在此不做贅述。本文將對碳源與油脂轉化率的關鍵因素，以及涉及解脂耶氏酵母代謝分區(qū)特異性的代謝工程策略進行討論，闡明高產(chǎn)油脂解脂耶氏酵母的科學問題所在，以期廣大代謝工程學者一起突破這一技術瓶頸，實現(xiàn)微生物油脂的可持續(xù)化生產(chǎn)。

4.1 胞質NADPH 的供應決定了碳源轉化率與油脂的產(chǎn)量

不同于釀酒酵母，解脂耶氏酵母細胞質中乙酰輔酶A 主要來源于ATP：檸檬酸裂解酶。在碳源充足氮源饑餓狀態(tài)下，細胞為了充分回收利用氮源，AMP 脫氨酶活性增強，將細胞內(nèi)AMP 轉化為肌苷單磷酸（IMP）。AMP 為三羧酸循環(huán)中異檸檬酸脫氫酶（IDH）的天然變構激活因子，由于AMP 水平的降低，IDH 的活性降低，將使得線粒體內(nèi)積累異檸檬酸。異檸檬酸經(jīng)順烏頭酸酶逆向反應，轉變?yōu)闄幟仕?，過量的檸檬酸將被排出線粒體，經(jīng)ATP 檸檬酸裂解酶，轉化為乙酰輔酶A和草酰乙酸。乙酰輔酶A 經(jīng)羧化后形成malonyl-CoA，轉?；?反應后，malonyl-CoA 主要以malonyl-ACP 的形式存在（圖3）。β-酮酰-ACP（n）合成酶（β-ketoacyl-ACP synthase）將把malonyl-ACP 裝載到延伸的碳鏈上，依次形成β-酮酰-ACP（n+2）、β-羥酰-ACP（n+2）、β-烯酰-ACP（n+2）和β-脂酰-ACP（n+2）［7］。每兩個碳原子的添加，需要2 個分子的還原性輔因子NADPH，依次參與β-酮酰-ACP 還原酶與β-烯酰-ACP還原酶所催化的反應（圖3）。比如硬脂酸的合成需要8 輪malonyl-ACP 的縮合反應，共計需要16 分子的NADPH 來完成還原反應。由于解脂耶氏酵母細胞質中不具有NADH 激酶或者NADH-NADPH 轉氫酶，NADH 并不能自由轉換為NADPH，在葡萄糖作為碳源情況下，解脂耶氏酵母主要的NADPH 來源為磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway）［53］。在磷酸戊糖途徑中，葡萄糖被磷酸化后，分別經(jīng)由6-磷酸葡萄糖脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，就會產(chǎn)生2 分子的NADPH。這一獲取還原力的途徑并非最佳選擇，原因在于6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶具有脫羧功能并產(chǎn)生CO2，解脂耶氏酵母每產(chǎn)生2 分子NADPH 以消耗1 分子CO2為代價。因此每合成1 分子硬脂酸（C18：0），細胞需要16 分子的NADPH，需要額外消耗4/3 分子的葡萄糖（C6H12O6）來提供這些還原力［54-55］。硬脂酸骨架中18 個碳原子，來源于9 個乙酰輔酶A 分子，相對應于4.5 分子的葡萄糖（1/3 的碳原子經(jīng)過丙酮酸脫氫酶復合體脫羧后丟失）。因此，每合成1 分子硬脂酸（C18：0），需要4.5 分子葡萄糖提供碳原子骨架，另外需要4/3 分子葡萄糖提供NADHP 還原力，對應的化學計量關系為，對應于每消耗5.83（4.5+4/3）分子葡萄糖，產(chǎn)生1 分子硬脂酸。理論硬脂酸的得率為0.271 g 硬脂酸/g 葡萄糖［54，56］。理論得率越高，消耗的起始碳源越少；原材料通常占據(jù)生產(chǎn)成本的50%，選取高效的NADPH 替代途徑，將對提高碳源轉化率、降低碳源消耗和壓縮生產(chǎn)成本，起到至關重要的作用。

圖3 脂肪酸碳鏈延伸過程需要還原性輔因子NADPH（n表示碳鏈長度）Fig.3 The enzymatic elongation cycle of fatty acids needs reducing equivalents NADPH(n is the chain-length of carbon backbones)

從以上分析可知，輔酶NADPH 的供應效率，決定了脂肪酸的理論得率。產(chǎn)油酵母細胞中存在了諸多NADPH 的替代途徑，作者在此已將可能的替代途徑及其對應的化學計量關系歸納，并計算了各自替代途徑的脂肪酸得率。為了提高解脂耶氏酵母產(chǎn)油的得率，Stephanopoulous 課題組系統(tǒng)地測試了不同還原型輔酶（NADPH）替代途徑對解脂耶氏酵母合成甘油三酯的影響，通過NADPH的化學計量關系的理論計算并探索最佳的NADPH替換途徑［56］。作者系統(tǒng)性地分析比較了磷酸戊糖途徑，NADPH-特異性的3-磷酸甘油醛脫氫酶（NADPHspecific 3-phosphoglyceraldehyde dehydrogenase），丙酮酸-草酰乙酸-蘋果酸轉氫反應（pyruvateoxaloacetate-malate transhydrogenase cycle），以及非氧化性糖酵解途徑（non-oxidative glycolysis pathway）產(chǎn)生還原性輔因子NADPH 效率的差異（圖4），構建了一系列重組解脂耶氏酵母，發(fā)現(xiàn)NADPH-特異性的3-磷酸甘油醛脫氫酶（NADPHspecific GAPDH）與異源表達的蘋果酸酶（malic enzyme），能夠高效地彌補磷酸戊糖途徑NADPH還原力的不足，改造后的解脂耶氏酵母能夠高效地整合乙酰輔酶A（acetyl-CoA）和NADPH，其產(chǎn)油量高達99.7 g/L，油脂的過程得率達到了0.27 g脂肪酸甲酯/g 葡萄糖，油脂積累速度達到了1.2 g/（L·h）［56］。這一結果使我們朝向構建可持續(xù)性的微生物油脂平臺邁進了一大步。

圖4 不同還原性輔因子替代途徑對脂肪酸合成效率的影響［56］（圖示中包含了以下四種途徑：①磷酸戊糖途徑；②NADPH-特異性的3-磷酸甘油醛脫氫酶；③丙酮酸-草酰乙酸-蘋果酸轉氫反應；④非氧化性糖酵解途徑）Fig.4 Carbon conversion efficiency from NADPH for fatty acids synthesis pathways[56](OxPP—oxidative pentose phosphate pathway;GAPHD—NADPH-specific glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase;POM cycle—pyruvate-oxaloacetate-malate transhydrogenase cycle;NOG—non-oxidative glycolytic pathway)

基于解脂耶氏酵母的氧化應激防御機制（oxidative stress defense pathway），Jayakody 等發(fā)現(xiàn)該酵母積累過多的親核的負電自由基，包括脂質過氧化物、超氧化物和自由醛基等，這些負電陰離子損傷蛋白質催化功能，影響DNA 復制的保真性［57］，并促使細胞凋零，菌體呈現(xiàn)假菌絲狀（hyphae）。為克服這一缺陷，該課題組加強了氧化還原的保護力，過表達了NADPH 途徑以及谷胱甘肽還原酶和過氧化酶，改造后的解脂耶氏酵母能夠更好地抵抗氧化壓力，細胞形態(tài)呈現(xiàn)單細胞、圓球形，細胞的甘油三酯含量顯著提高至81.4%，甘油三酯的生產(chǎn)速率提高至0.97 g/（L·h）［58］。

4.2 解脂耶氏酵母脂肪酸合成酶的改造以及基于酶活分區(qū)的代謝工程策略

解脂耶氏酵母能夠高效合成油脂的生物基礎在于其胞內(nèi)高度特異性的功能化分區(qū)［59］，其中脂肪酸的合成效率高度依賴于脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A 羧化酶以及蘋果酸酶所形成的超酶復合體（lipid metabolon）［60-61］，甘油三酯的合成與組裝需要內(nèi)質網(wǎng)與脂質體的協(xié)同作用。酶分子的空間定位及細胞內(nèi)生化反應的分區(qū)，能夠大大增加中間底物傳遞和轉化的效率，同時能夠有效地降低不穩(wěn)定底物的流失，自然界廣泛存在的亞細胞水平超酶復合體，包括糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)以及脂肪酸合成等，均已被細胞成像技術證實。為了充分配置并利用亞細胞水平的不同功能分區(qū)，Stephanopoulos 課題組首次在解脂耶氏酵母中，將具有脂酰輔酶A（acyl-CoA）和脂酰ACP（acyl-ACP）還原以及水解功能等特異性的酶定位表達于線粒體、脂質過氧化物體（peroxisome）和內(nèi)質網(wǎng)（ER）等亞細胞器中，改造了產(chǎn)油酵母的生產(chǎn)性狀，并配合脂肪醛脫羰酶（aldehyde decarbonylase）或者脂酰輔酶A 還原酶（fatty acyl-CoA reductase），使得遺傳改造后的酵母產(chǎn)生成了具有生物燃料特征的烷烴類、烯烴類和脂肪醇等化合物［32］。釀酒酵母，經(jīng)代謝工程改造后，能夠生成10.4 g/L 的游離脂肪酸和1.5 g/L 的脂肪醇［62］。另外通過表達異源脂肪酸合成酶，于濤等在釀酒酵母中成功表達了分枝桿菌的脂肪酸合成體系，結合acyl-CoA 還原酶，生成了24 個碳原子的脂肪醇［63］。通過表達脂酰輔酶A 光脫羧酶（fatty acyl-CoA photodecarboxylase），改造后的解脂耶氏酵母能夠利用葡萄糖合成將近1.5 g/L 的脂肪烷（烯）烴［34］。

脂肪酸碳鏈長度，決定了生物柴油的理化性質和燃燒性能，比如凝固點和揮發(fā)性等；短鏈功能性油脂分子，易于被動物和人體吸收，通常營養(yǎng)價值也高。因此，控制脂肪酸碳鏈長度，成為代謝工程研究的熱點之一。細菌的脂肪酸合成酶由5 個單體亞基構成，每個蛋白亞基負責不同的催化功能，其不同亞基間結合松散，易于工程改造；與細菌不同，真菌中脂肪酸合成酶由兩條肽鏈編碼，每條肽鏈大概有2000 個氨基酸，分別編碼脂肪酸合成酶的不同功能域。蛋白晶體結構分析表明，真菌脂肪酸合成酶兩條肽鏈組成一個多聚體的分子籠狀結構，不同碳鏈長度的脂酰-ACP（四碳到十四碳）中間體被包裹在脂肪酸合成酶分子籠內(nèi)部［64］，直至棕櫚酰-ACP，碳鏈增加到16才能被脂肪酸合成酶釋放，并經(jīng)過MPT 結構域（malonyl/palmitoyl transacylase）將棕櫚酰-ACP 轉變?yōu)樽貦磅?CoA（C16∶0），所生成的棕櫚酰-CoA通過脂肪酸延長酶（elongase）和去飽和酶（desaturase）依次生成硬脂酰-CoA（C18∶0）和油酰-CoA（C18∶1），并依次加載到3-磷酸甘油骨架上，合成各種脂類化合物（圖5）。在真菌中，通過直接表達脂酰-ACP 硫解酶（fatty acyl-ACP thioesterase）來生產(chǎn)短鏈脂肪酸的效率低。通過蛋白質的理性設計，Xu 等［32］將解脂耶氏酵母中脂肪酸合成酶的 MPT（malonyl/palmitoyl transacylase）結構域替換為具有acyl-CoA 水解功能的結構域，改造后的酵母能夠生產(chǎn)具有不同碳鏈長度的脂肪酸分子（C12、C14和C16等），提高了解脂耶氏酵母的工業(yè)利用價值。另外通過蛋白工程手段，定向改造ACP 結構域［65］、酮脂酰ACP合成酶結構域和MPT 轉?；Y構域，能夠使釀酒酵母生產(chǎn)短鏈的脂肪酸，C6和C8脂肪酸的產(chǎn)量達到了100～250 mg/L［66］。由此看出，蛋白理性改造能夠有效控制脂肪酸合成過程碳鏈的延伸，德國Max Planck Institute 的Ashwin Chari 課題組以及法蘭克福大學Eckhard Boles 課題組對此進行了詳細的結構生物分析［66-67］，進一步闡釋了脂肪酸的碳鏈長度調控機制，為定向改造產(chǎn)油酵母生產(chǎn)短鏈和中等碳鏈長度脂肪酸和油脂化合物提供了理論基礎。

圖5 解脂耶氏酵母合成功能性油脂的生化過程Fig.5 The biochemical scheme of synthesizing triglycerides in Y.lipolytica

4.3 解脂耶氏酵母油脂合成的分子調控機制

氮源饑餓（nitrogen starvation）所造成的異檸檬酸脫氫酶活性減弱和ATP：檸檬酸裂解酶活性增強是產(chǎn)油酵母開啟油脂合成的重要生化特征。其中一個重要前提是，AMP 脫氨酶活性增強，從而導致細胞內(nèi)AMP 水平下降，進而導致異檸檬酸脫氫酶活性減弱［68］。雖然目前學術界缺乏氮源饑餓導致AMP 脫氨酶活性增強的直接生化證據(jù)，過量表達AMP 脫氨酶后能夠使細胞內(nèi)產(chǎn)生更多的乙酰輔酶A，進而使得解脂耶氏酵母積累較多番茄紅素（lycopene）［69］。然而直接過表達AMP 脫氨酶，似乎并不能顯著提高產(chǎn)油酵母油脂的積累，表明產(chǎn)油酵母油脂的積累存在其他關鍵調控位點，或者AMP 脫氨酶的調控有可能發(fā)生在蛋白翻譯后修飾（post-translational modification）水平上［70］。最近也有其他報道，比如過表達AMP 脫氨酶后能夠使產(chǎn)油真菌Mortierella alpina中油脂含量提高15%～34%［71］。

Snf1/AMPK 是真核生物中高度保守的碳源與能量調控蛋白。有關真菌中碳源代謝，主要涉及Snf1/AMPK 相關的應激活化蛋白激酶，近來成為了研究解脂耶氏酵母油脂積累機理的調控熱點［72］。SNF1/AMPKs 通常以異三聚體復合物（heterotrimeric complex）的形式存在，主要由具催化功能的α-亞基（Snf1）和兩個調控亞基組成，調控亞基包含了β-亞基（Sip1、Sip2 或Gal83）和γ-亞基（Snf4），解脂耶氏酵母中含有高度保守的Snf1/AMPK 系統(tǒng)，經(jīng)過Blast分析，Snf1、Snf4、Gal83和Sip2分別對應于解脂耶氏酵母的YALI0D02101g、YALI0C03421g、YALI0E13926p 和YALI0C00429p 等編碼序列［72］。杜邦的科學發(fā)現(xiàn)Snf1 缺失的解脂耶氏酵母能夠高效積累油脂，包括EPA 等不飽和脂肪酸，進一步經(jīng)過基因芯片和實時定量PCR 分析，他們發(fā)現(xiàn)Snf1活性缺失，能夠激活油脂積累代謝途徑［72］。

近年來，系統(tǒng)水平的多組學分析手段，包括蛋白組、磷酸蛋白組和代謝組學分析，已經(jīng)被廣泛用于研究解脂耶氏酵母的碳源、能量代謝以及油脂積累的積累。其中，美國西北太平洋國家實驗室的Scott Baker課題組發(fā)現(xiàn)氮源氨基酸代謝，與解脂耶氏酵母脂肪酸的積累息息相關。比如，在氮源饑餓狀態(tài)下，核糖體結構相關基因的表達高度下調，預示油脂積累階段蛋白表達的減弱［73］；細胞為了回收利用含氮化合物，包括丙氨酸、腐胺（putrescine）、亞精胺（spermidine）和尿素（urea）等化合物將會被分解，進而導致細胞內(nèi)產(chǎn)生糖醇和三羧酸循環(huán)代謝相關的溢出代謝物，包括甘露醇、赤蘚糖醇以及檸檬酸、富馬酸和蘋果酸等副產(chǎn)物。在氮源限制情況下，該課題組通過磷酸蛋白組學分析，發(fā)現(xiàn)了1219 個新的磷酸化位點，其中133 個磷酸化位點與氮源饑餓顯著關聯(lián)［73］，這些磷酸化位點主要集中于蛋白激酶和具DNA 結合活性的轉錄因子。在酶學水平，磷酸化主要修飾脂肪合成途徑的ATP：檸檬酸裂解酶和乙酰輔酶A 羧化酶，同時磷酸化導致了脂肪酸氧化降解途徑的減弱，這一研究表明磷酸化調控是油脂積累的關鍵成因。

通過不同碳氮比條件下的恒化器培養(yǎng)，Nielsen 課題組對解脂耶氏酵母積累油脂的調控機理進行了研究。通過全基因組規(guī)模的RNAseq 測序，該課組發(fā)現(xiàn)油脂的積累，不依賴于轉錄水平的調控；脂肪酸碳流的代謝調控主要發(fā)生在氨基酸代謝途徑［74］，由此發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成前體acetyl-CoA，很大一部分來源于氨基酸的代謝氧化，這一結論與Alper課題組發(fā)現(xiàn)的亮氨酸/異亮氨酸代謝參與解脂耶氏酵母脂肪酸合成相互佐證［75］。有關解脂耶氏酵母中氮源代謝調控，Pomraning 等［76］最近揭示了氮源代謝阻遏（nitrogen catabolite repression）與GATA 家族鋅指蛋白轉錄因子（GATA zinc finger transcription factors）之間的關聯(lián)。比如刪除鋅指轉錄因子gzf3和gzf2，會造成細胞氮源特異性的生長缺陷和油脂的大量積累。另外碳源代謝阻遏因子mig1 也與鋅指蛋白轉錄因子的活性相關［76］。揭示碳源與氮源代謝調控因子將會加深我們對解脂耶氏酵母積累油脂的分子機理的認識。未來5～10年，我們期望解脂耶氏酵母領域的科學工作者，將會描繪一幅更加清晰的碳源/氮源調控網(wǎng)絡，為我們構建可持續(xù)性的細胞油脂工廠奠定基礎。

4.4 產(chǎn)油酵母合成油脂的生化過程動力學建模

在生物加工制造過程中，生化過程動力學建模能夠給我們提供最優(yōu)化的發(fā)酵控制參數(shù)。對生物過程的動態(tài)分析，有助于我們根據(jù)細胞的生理狀態(tài)，制定最優(yōu)化的細胞生長和控制參數(shù)，從而最大限度地提高碳源的利用率，增加細胞強度，降低生產(chǎn)成本與提高經(jīng)濟可行性［77］。油脂分子屬于胞內(nèi)積累的代謝產(chǎn)物，油脂的過量積累會對細胞生長的適應性（growth fitness）產(chǎn)生負面影響，目前常用的動力學模型主要考慮胞外產(chǎn)物、酶蛋白活性、或者次級代謝產(chǎn)物的積累，比如檸檬酸［78］、納豆激酶［79］和靈芝酸［80］等的動力學，此類生化過程建模相對簡單。有關油脂化合物積累的動力學模型已經(jīng)擴展到微藻［81］和解脂耶氏酵母［82］，所構建的模型并沒有考慮油脂合成對細胞生長的影響、過程得率等經(jīng)濟指標。為了進一步加深對解脂耶氏酵母積累油脂發(fā)酵過程的認識，作者將細胞總生物量（Xtotal）分為油脂（P）和非油脂生物量（oil-free biomass，X），并引入一個負擔系數(shù)（γ）來描述油脂積累對細胞生長的影響。根據(jù)生化反應動力學原則，分批培養(yǎng)條件下，油脂積累的非結構動力學模型可以歸納如表1。

表1 產(chǎn)油酵母胞內(nèi)積累油脂的分批發(fā)酵動力學描述Tab.1 Fermentation kinetics of the oil accumulation process in oleaginous yeast in batch culture

方程（1）描述細胞的生長適應性受到油脂積累的影響，負擔系數(shù)（0<γ<1）越大，油脂積累（P）越多，細胞比生長速率越小。負擔系數(shù)取決于菌株表達的基因多少。方程（2）描述細胞的生長取決于比生長速率和比死亡速率。方程（3）描述胞內(nèi)產(chǎn)物油脂的積累取決于生長相關的因子（α）和非生長相關的因子（β）。方程（4）則描述底物的消耗取決于細胞的生長與油脂的積累，其中細胞得率系數(shù)由YX/S給出，油脂得率系數(shù)由YP/S給出。方程（5）描述總的生物量（Xtotal）由油脂（P）和非油脂生物量（oil-free biomass，X）構成。方程（6）給出了細胞的動態(tài)含油量。方程（7）描述了動態(tài)過程得率（Yprocess），由初始和終態(tài)的底物濃度（S0、Sf）和產(chǎn)物濃度（Pf、P0）決定。方程（8）描述了細胞發(fā)酵過程的生產(chǎn)強度。通常過程得率（Yprocess）、生產(chǎn)強度（r）和產(chǎn)量（P）具有復雜的關聯(lián)，細胞內(nèi)油脂含量越高，對細胞的負荷也越重，但產(chǎn)物的分離提取也越容易；生產(chǎn)強度越高，設備的利用率就越大，越容易降低生產(chǎn)成本；過程得率越高，單位糖耗產(chǎn)生的油脂越高，原材料成本就越低。在分批發(fā)酵下，發(fā)酵時間的優(yōu)化取決于最優(yōu)的含油量和含油組分，這種多產(chǎn)物多組分系統(tǒng)將會動態(tài)影響終端產(chǎn)物的成本。獲取實罐動態(tài)發(fā)酵數(shù)據(jù)，包括菌體濃度、含油量、底物消耗和油脂產(chǎn)量，進一步可以通過最小二乘非線性回歸（least square nonlinear regression）求得各個發(fā)酵參數(shù)，進而可以模擬不同碳源流加速率情況下，探索最優(yōu)化的發(fā)酵控制策略。在連續(xù)培養(yǎng)的恒化器中，上述動力學模型可能存在解析解，獲取解析解，將會為我們優(yōu)化脂類化合物生產(chǎn)和控制發(fā)酵過程產(chǎn)生有益的指導。

5 產(chǎn)油酵母的高通量篩選及表型鑒定技術

發(fā)展微生物單細胞油脂，構建高效的底盤微生物轉化平臺，需要與之相匹配的油脂化合物高通量篩選及微生物表型鑒定技術。傳統(tǒng)的油脂分析和微生物代謝物篩選平臺，很大程度上依賴于有機溶劑萃?。ū热缃?jīng)典的Folch 方法），轉酯化反應，最終油脂以脂肪酸甲酯的形式存在，須經(jīng)氣相色譜-質譜（GC-MS）聯(lián)用，借此分析脂肪酸的組分（碳鏈長度和不飽和鍵等位置）。此方法需要去除水分，機械振蕩破裂細胞，在堿性溶液中利用皂化反應水解細胞內(nèi)的甘油三酯，去除細胞膜和雜蛋白等干擾，進一步以無水硫酸為催化劑，催化游離脂肪酸與甲醇縮合，產(chǎn)生脂肪酸甲酯，脂肪酸甲酯經(jīng)疏水溶劑萃取后（一般用正己烷），經(jīng)過氣質聯(lián)用分析。此法樣品回收率低，準確度依賴于皂化反應、轉酯化反應和萃取效率，反應時間過長，不足以滿足產(chǎn)油酵母高通量篩選的要求。

高通量篩選及表型鑒定是構建微生物油脂平臺的核心技術?；谟椭奶禺愋詿晒馊旧珓?、近紅外光譜、拉曼光譜，結合流式細胞儀與微流體技術，將會為構建高效的油脂細胞工廠提供一把利刃。所謂“工欲善其事，必先利其器”。近年來，一些學者開發(fā)了油脂分子探針（Bodipy，Invitrogen公司），能夠在活體細胞內(nèi)特異性地與長鏈油脂分子結合，受到480 nm 激發(fā)，進而釋放510 nm 波段特異性的熒光。與傳統(tǒng)的尼羅河紅染色劑（Nile red）相比，Bodipy 具有靈敏度高、樣品處理簡單等優(yōu)點。另外，Bodipy 可用于解脂耶氏酵母脂質體（lipid droplet 或者lipid body）的染色，用于細胞生物學和油脂積累的研究［83］。基于尼羅河紅和Bodipy，近來學者開發(fā)了快速、簡易的微藻中油脂定量方法，作者總結了兩種染色劑的應用范圍，特別提到了各自染色劑的準確性受到光譜特性、熒光染色劑濃度、有機溶劑、細胞濃度、溫度以及反應時間的影響［84］。需要特別指出的是，經(jīng)過優(yōu)化后的Bodipy 方法，可以準確快速地用來篩選高產(chǎn)油脂的解脂耶氏酵母［85］，篩選出的解脂耶氏酵母，產(chǎn)油量高達85 g/L，細胞含油量達到了77%，產(chǎn)油速率達到了0.73 g/（L·h）。

除了熒光劑以外，一些在線油脂檢測手段，比如近紅外光譜（infrared spectra）和拉曼光譜（Raman spectra），成為了研究胞內(nèi)油脂積累的新型分析工具。脂類分子中的酯鍵含有甲氧基和羰基，脂分子中交替的亞甲基以及不飽和雙鍵，以及稀有的羥基都會產(chǎn)生特征性的紅外光譜吸收。基于此，可以采用傅里葉變換近紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy）來檢測細胞組分的動態(tài)變化，特別是胞內(nèi)油脂含量、胞內(nèi)碳源與氮源變化的比例，基于脂質/氨氮和碳源/氨氮的比例，作者進而確定了利用紅外光譜進行精確油脂定量和微藻細胞篩選的方法［86］。為了精確確定產(chǎn)油酵母胞內(nèi)油脂積累的動力學，近來一些學者建立了基于傅里葉變換近紅外光譜的脂類定量模型［87］。作者選取了3 種產(chǎn)油酵母（Rhodotorula toruloidesCBS 14，Lipomyces starkeyiCBS 1807 和Yarrowia lipolyticaCBS 6114），利用偏最小二乘回歸（partial least squares regression），進而確定了對應3 種酵母的油脂含量定量模型，經(jīng)過試驗驗證，混合樣品油脂含量與模型預測達到了高達90.5%的相關性，單一產(chǎn)油酵母模型預測的相關性高達96%～98%，這一方法的建立，將會極大簡化產(chǎn)油酵母高通量篩選。

拉曼光譜主要來研究晶格中分子的振動頻率或者轉動頻率，其發(fā)射光源可以為可見光、近紅外光和近紫外光等。拉曼光譜，已經(jīng)用來定量檢測脂質分子的脂肪酸組成，包括碳鏈長度以及不飽和度等關鍵數(shù)據(jù)［88］，其精度也達到了傳統(tǒng)的氣質聯(lián)用方法。此外，拉曼光譜具有不破壞細胞體、樣品處理簡單等優(yōu)勢。根據(jù)激發(fā)態(tài)拉曼散射光譜技術（stimulated Raman scattering microscopy），哈佛大學謝曉亮課題組在單細胞水平對3種產(chǎn)油酵母積累油脂的過程進行了分子表征（美國能源部報告https：//doi.org/10.2172/1418344），結合微流體技術，該課題組能夠分離出高產(chǎn)油脂的酵母菌株，進一步通過單細胞轉錄組分析，確定了產(chǎn)油基因調控的關鍵位點，該研究為產(chǎn)油酵母的油脂積累機理、表型及基因型高通量鑒定提供了基礎。另外，最新發(fā)展的微流體微滴技術［89］也為產(chǎn)油酵母的表型快速鑒定與細胞分離提供了可能。通過光化學和級聯(lián)質譜（photochemistry and tandem MS），最近學者也可以精確測定C==C 雙鍵的位置以及甘油三酯sn1、sn2和sn3位置的脂肪酸類型［90］。

6 解脂耶氏酵母生產(chǎn)棕櫚油脂和可可脂的經(jīng)濟與技術可行性分析

以下我們將對解脂耶氏酵母生產(chǎn)植物油脂的經(jīng)濟可行性進行分析。世界主要油料作物包括黃豆、葵花籽、油菜、可可果和棕櫚果等（表2）。根據(jù)主要油料作物每公頃的產(chǎn)出及其含油量，我們大致可以推算出每公頃油料作物每年的產(chǎn)油得率［t/（hm2·a）］。依據(jù)單位面積的產(chǎn)油得率（表2），棕櫚樹拔得頭籌，具有最高的產(chǎn)油率，1 hm2的棕櫚樹每年可以產(chǎn)出3.69 t棕櫚油；相比而言，1 hm2油菜和葵花每年的產(chǎn)油得率分別為0.9 t和0.85 t；其中可可樹的產(chǎn)油得率最低，1 hm2的可可樹每年可以產(chǎn)約0.4 t 可可脂。單位面積可可樹的產(chǎn)油脂率低，造成了可可脂的高價（6000～8000 美元/t，干燥可可果的價格在3000 美元/t），相比而言，棕櫚油的價格僅為900 美元/t。從這些數(shù)據(jù)，我們大致可以看出這些油料作物的產(chǎn)率及相對經(jīng)濟價值。更為重要的是，棕櫚樹和可可樹主要種植在熱帶雨林氣候（東南亞、拉丁美洲和非洲西部），中國的氣候不適宜種植熱帶雨林作物，這種結構性的短缺，也會因為地域及政治的影響加劇此類油料作物價格的波動，因此，我們亟需找到可替代的生物制造途徑，以彌補國內(nèi)原材料供應的短缺。

假定可以用產(chǎn)油酵母轉化淀粉質或者蔗糖類作物生產(chǎn)功能性油脂，解脂耶氏酵母生產(chǎn)油脂的極限得率為0.271 g 油脂/g 葡萄糖，根據(jù)主要糖料作物單位面積的產(chǎn)量和含糖量，我們可以大致推算出，1 hm2糖料作物經(jīng)酵母轉化后的最大產(chǎn)油得率（表3）。在常用的糖料作物中，種植1 hm2甘蔗，其中蔗糖經(jīng)解脂耶氏酵母轉化后，最大產(chǎn)油得率可以達到3.07 t/（hm2·a），接近于1 hm2棕櫚樹的產(chǎn)油率［3.69 t/（hm2·a）］（表2）；而種植1 hm2玉米，其中淀粉經(jīng)解脂耶氏酵母轉化后，最大產(chǎn)油得率可以達到2.15 t/（hm2·a）（表3）；甘蔗和玉米作為原材料的產(chǎn)油得率遠遠大于紅薯［1.36 t/（hm2·a）］。巴西的甘蔗年產(chǎn)量已達6.7 億噸（670 000 000 t，濕重），為產(chǎn)油酵母的工業(yè)化生產(chǎn)提供了極為廉價的原料底物?？紤]到生物轉化和發(fā)酵中其他成本（比如淀粉水解，原材料預處理，氮源消耗，水電，人工以及油脂的提取分離）占理論轉化成本的50%，利用甘蔗作為原材料的油脂得率為1.54 t/（hm2·a），假定碳源轉化率占理論轉化率（0.271 g/g）的75%，實際的功能性油脂的真實得率為1.16 t/（hm2·a）。考慮到終端產(chǎn)物的價值鏈，棕櫚油主要用于工業(yè)加工，其他植物油（玉米油、花生油和菜籽油等）主要用于食品烹炸，可可脂的主要用途是制作巧克力，以可可脂的售價為7000 美元/t 計，種植1 hm2甘蔗，所產(chǎn)蔗糖作為底物經(jīng)產(chǎn)油解脂耶氏酵母轉化后的毛利潤可以達到8120 美元/（hm2·a）；玉米等主要糧食作物的價格在210 美元/t，種植1 hm2玉米的毛利潤在2247 美元/（hm2·a），與1 hm2甘蔗的毛收益［2100 美元/（hm2·a）］相近，就價值而言，利用解脂耶氏酵母生產(chǎn)可可脂，可以將原材料（甘蔗）的經(jīng)濟價值提高2.86 倍，將玉米的經(jīng)濟價值提高2.6 倍。目前Nielsen 課題組已經(jīng)在釀酒酵母中嘗試表達可可脂合成的關鍵化學步驟，所產(chǎn)的油脂成分接近于可可脂，但產(chǎn)量與工業(yè)化大規(guī)模化生產(chǎn)還有一定差距［91-93］。宋元達課題組利用了解脂耶氏酵母中的sn2 特異性的脂肪酶，將羊油脂中sn2 位置的飽和脂肪酸替換為油酸，得到了更加健康且脂肪酸組成接近可可脂的組分［94］；另外該課題組也優(yōu)化了解脂耶氏酵母生產(chǎn)可可脂的發(fā)酵條件，確定了以甘油和酒石酸氨為發(fā)酵原料，并發(fā)現(xiàn)升高發(fā)酵溫度有助于促進可可脂的生成［95］。

表2 世界主要油料作物的單位面積產(chǎn)量及產(chǎn)油得率Tab.2 The unit area output and maximal oil yield from major oil crops.

表3 以糖料作物為原料經(jīng)解脂耶氏酵母轉化后的產(chǎn)油得率Tab.3 The maximal oil yield from Y.lipolytica converting sugar feedstock from corn,sweet potato or sugarcane.

更為有利的是，相比于棕櫚樹，解脂耶氏酵母所產(chǎn)油脂的結構和功能更加多樣化，例如解脂耶氏酵母的油脂，含有高達55%的油酸（C18∶1），20%左右的棕櫚酸（C16∶0），13%的硬脂酸（C18∶0），7%的棕櫚油酸（C16∶1）以及5%左右的多不飽和脂肪酸（主要為亞麻酸C18∶3），其營養(yǎng)和經(jīng)濟價值遠高于單一的棕櫚油（C16∶0）?？煽芍闹饕M分為：油酸（C18∶1）和硬脂酸（C18∶0）各占35%，棕櫚酸23%（C16∶0），其他不飽和脂肪酸（棕櫚油酸和亞麻酸）占7%，這一組分與解脂耶氏酵母的油脂組分較為接近。在技術角度，我們僅需將解脂耶氏酵母中一部分單不飽和脂肪酸轉變?yōu)轱柡椭舅?，比如?0%的油酸（C18∶1）轉化為硬脂酸（C18∶0），并 將5% 的棕櫚油酸（C16∶1）轉變?yōu)樽貦八幔–16∶0），經(jīng)改造后產(chǎn)油酵母的油脂組分將變?yōu)?5%的油酸（C18∶1）、33%的硬脂酸（C18∶0）、25%的棕櫚酸（C16∶0）以及7%左右的其他不飽和脂肪酸（主要為棕櫚油酸和亞油酸），這一脂肪酸組分與可可脂的成分極為接近，從生物技術而言，僅需控制單不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸的相對比例，利用CRISPRi 介導的轉錄水平抑制（transcriptional repression），進而減弱去飽和酶（desaturase）的活性就可以實現(xiàn)這一技術指標。除了不飽和度決定熔點以外，可可脂細膩豐富的質地和入口即化的口感也取決于甘油三酯sn1、sn2 和sn3 的三個酯鍵所連接的脂肪酸類型。脂酰輔酶A 轉移酶（圖5，GPAT，LPAT 和DAGT）依次將3 個脂酰輔酶A 裝載到甘油上，因此，如果我們對脂酰輔酶A轉移酶的底物特異性和催化活性進行相應的工程改造，比如大規(guī)模的酶學篩選，或者直接從可可果中挖掘相應的酶，將會使得改造后的解脂酵母產(chǎn)出類似于可可脂的甘油三酯。這一工程實踐將能提供大約100 萬噸可可脂原材料，進而填補大概500 億美元的巧克力市場缺口。

7 結論

利用解脂耶氏酵母生產(chǎn)高附加值功能性油脂具有巨大的經(jīng)濟效益。植物油脂和動物脂肪大體上有4000 億美元的年均市場需求。植物油脂的獲取依賴于農(nóng)業(yè)技術、育種、氣候狀況和病蟲害等因素，熱帶雨林地域的棕櫚園和可可園提供了大量的植物性油脂，廣泛用于食品、飲料、醫(yī)藥和化工等領域。棕櫚油和可可脂也成為了東南亞、非洲西部和近赤道南美國家的主要經(jīng)濟作物。近年來，由于植物油脂市場需求的激增，造成了熱帶雨林過度砍伐、植被破壞以及環(huán)境氣候的變遷和生態(tài)多樣性的喪失。為了解決可持續(xù)發(fā)展的問題，降低二氧化碳排放，保護地球環(huán)境，利用微生物細胞工廠生產(chǎn)功能性油脂為解決油脂的短缺提供了廣闊的前景。

本文從植物油脂的市場需求出發(fā)，分析了目前植物油脂的市場供應現(xiàn)狀，探討了構建高效產(chǎn)油解脂耶氏酵母細胞工廠的主要技術瓶頸，其中包括產(chǎn)油菌株的高通量篩選和表型鑒定技術、代謝工程遺傳改造策略和產(chǎn)油酵母的發(fā)酵動力學模型等，并進一步探討了以主要糖料作物為原材料，生產(chǎn)功能性油脂的經(jīng)濟可行性和技術可行性。高效的油脂轉化率主要取決于解脂耶氏酵母內(nèi)還原性輔酶NADPH 的供應、碳代謝流和酶生化反應的細胞內(nèi)分區(qū)、在磷酸激酶（snf1/MAPK）作用下的脂肪酸代謝調控，利用分子遺傳學或者合成生物學手段，將會幫助我們進一步理解產(chǎn)油酵母積累油脂的分子機制，促進我們構建高效可行的微生物細胞油脂工廠，朝向工業(yè)應用邁出堅實的一步。經(jīng)過經(jīng)濟和技術可行性分析，利用蔗糖作為原材料，可以預測，解脂耶氏酵母具有極大的潛力，能夠解決當前高附加值油脂（比如可可脂）的市場缺口問題。

健康的功能性油脂主要是含有多不飽和鍵的亞麻酸（α-linolenic acid，C18∶3）和EPA（eicosapentaenoic acid，C20∶5）等，主要有益智、降血脂、抗血栓和抗炎等功效，是人類必需的營養(yǎng)素之一，其中亞麻酸主要來源于植物提取，EPA主要源于深海藻類或者魚類。其生物合成涉及多步去不飽和酶，在微生物中合成效率較低。研究發(fā)現(xiàn)，一些微藻中多不飽和脂肪酸合成酶為一個復雜的聚酮酶復合物（polyketide synthase，PKS）結構［96］，其合成過程不同于一般的脂肪酸合成酶。在解脂耶氏酵母中異源表達微藻類的PKS，提高其功能活性，利用產(chǎn)油酵母的產(chǎn)油特性，將有利于我們構建高效合成EPA 或者DHA 的酵母。微藻與解脂耶氏酵母共培養(yǎng)或許也能解決脂肪酸前體供應的難題，從而提高多不飽和脂肪酸合成的效率。開發(fā)產(chǎn)油酵母微生物資源，提供健康的功能性油脂，將會解決一系列能源、健康食品和環(huán)境資源等問題，促進我們向可持續(xù)性的低碳經(jīng)濟模式轉變。

致謝：感謝美國得州理工大學陳超群教授（美國工程院院士）校讀對王教授回憶部分的記述；感謝YaliBio 總裁CEO 陸玉麟博士關于功能油質化合物市場前景及應用的討論。