湯恒，韓鑫，鄒樹(shù)平，鄭裕國(guó)

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院手性生物制造國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，浙江 杭州 310014）

1 多酶催化體系

多酶催化體系是指模擬體內(nèi)代謝過(guò)程，在體外將幾種不同功能的酶級(jí)聯(lián)組裝成一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能整體，催化一系列連續(xù)的生化反應(yīng)，將簡(jiǎn)單底物轉(zhuǎn)化為復(fù)雜產(chǎn)物的生物催化反應(yīng)體系。同時(shí)多酶催化體系是一種可調(diào)控的系統(tǒng)，通過(guò)級(jí)聯(lián)酶之間的緊密接觸，形成“底物通道”，避免了細(xì)胞代謝中分子無(wú)規(guī)律運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的中間產(chǎn)物擴(kuò)散損失［1］。在體外可以快速實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)的各種代謝反應(yīng)，克服了傳統(tǒng)發(fā)酵周期長(zhǎng)、生產(chǎn)效率低、易受毒副產(chǎn)物抑制等缺點(diǎn)［2］。

天然的多酶催化體系在細(xì)胞內(nèi)十分常見(jiàn)，如糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)等［3-5］。在代謝過(guò)程中，經(jīng)常通過(guò)形成多酶級(jí)聯(lián)的復(fù)合物，形成“底物通道效應(yīng)”而實(shí)現(xiàn)特定代謝產(chǎn)物的高效合成?！暗孜锿ǖ佬?yīng)”是多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的一種現(xiàn)象，即一個(gè)酶將催化完成的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到下一個(gè)鄰近酶的催化位點(diǎn)，作為另一個(gè)酶的催化底物的過(guò)程，這種現(xiàn)象只有兩個(gè)酶的距離足夠近時(shí)才會(huì)發(fā)生［6］。譬如，上游酶活性中心釋放的中間產(chǎn)物可被下游酶活性中心直接處理，從而避免中間產(chǎn)物的擴(kuò)散，這種通過(guò)連接活性中心的蛋白質(zhì)隧道被稱為“直接底物通道”［圖1（a）］；另一種可能的通道機(jī)制被稱為“鄰近底物通道”，是指兩種酶在沒(méi)有實(shí)際通道的情況下，但活性中心相距足夠近，使得上游酶產(chǎn)生的中間產(chǎn)物在擴(kuò)散之前也可被下游酶捕獲并催化［圖1（b）］；此外，將上游和下游酶的多個(gè)拷貝混合組裝為功能簇，也可有效提高中間體產(chǎn)物被任意下游酶捕獲的概率［圖1（c）］。多酶復(fù)合物底物通道具有保護(hù)不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，調(diào)節(jié)同一底物的競(jìng)爭(zhēng)途徑，消除有毒中間代謝物的抑制作用等功能［7］。由于細(xì)胞中代謝網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，許多代謝調(diào)控還不成熟，產(chǎn)物形成對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，致使胞內(nèi)目標(biāo)產(chǎn)物積累受到極大限制［8］。因此，近年來(lái)體外多酶催化體系越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注［9-10］。

圖1 底物通道效應(yīng)［7］Fig.1 Substrate channel in a two-step metabolic pathway［7］(Different types of intermediate channeling in a two-step metabolic pathway,where a substrate is processed by enzyme E1 and turned into intermediate,which is then processed by enzyme E2 and turned into product)

從單一酶催化反應(yīng)到多酶催化體系，其發(fā)展過(guò)程不是一蹴而就的。多酶催化體系發(fā)展之初只是簡(jiǎn)單模擬天然的代謝過(guò)程，而如今可通過(guò)改造天然代謝途徑甚至設(shè)計(jì)全新的人工途徑［11-12］來(lái)構(gòu)建更高效率的多酶催化體系。不僅可利用不同宿主來(lái)源的天然酶，而且能通過(guò)酶的人工進(jìn)化從而獲得催化特性和環(huán)境適應(yīng)性大幅度提高的人工酶。隨著越來(lái)越多的體內(nèi)多酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制被揭示與深入研究，巨量生物學(xué)數(shù)據(jù)的不斷積累和計(jì)算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展，越來(lái)越多的多酶催化體系正在被設(shè)計(jì)和組裝，并應(yīng)用于化學(xué)品的合成中。本文主要對(duì)多酶催化體系的構(gòu)建及在醫(yī)藥化學(xué)品合成中的應(yīng)用方面進(jìn)行綜述。

2 多酶催化體系的構(gòu)建策略

多酶催化體系的設(shè)計(jì)通常需要對(duì)多個(gè)級(jí)聯(lián)的反應(yīng)過(guò)程和合成路徑進(jìn)行熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)分析，以滿足多酶催化體系組裝的基本要求［13］：級(jí)聯(lián)的總體熱力學(xué)參數(shù)是正向可行的（?Gcascade<0），如最后一步催化為不可逆反應(yīng)則可極大提高產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率；酶的催化反應(yīng)具有高反應(yīng)特異性和官能團(tuán)正交性，以避免不同底物之間不必要的交叉反應(yīng)；整個(gè)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)參數(shù)由酶活性控制，以保證反應(yīng)通量。多酶催化體系設(shè)計(jì)的另一個(gè)重要任務(wù)是對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行逆向合成分析［14］，建立與產(chǎn)物合成有關(guān)的多酶工具箱，對(duì)級(jí)聯(lián)酶的選擇性、相容性及化合物耐受性進(jìn)行篩選［15-16］。由于需要協(xié)調(diào)反應(yīng)體系中多個(gè)酶的理化性質(zhì)、動(dòng)力學(xué)參數(shù)等，所以多酶的協(xié)同作用對(duì)于實(shí)現(xiàn)整個(gè)體系的催化效率和穩(wěn)定性具有影響［17］。此外，多酶催化體系還需要著重考慮體外輔酶的循環(huán)與ATP 的供給，如通過(guò)建立一個(gè)輔酶再生循環(huán)［18］或生物電池［19］等來(lái)解決輔酶循環(huán)問(wèn)題。

在完成多酶催化途徑設(shè)計(jì)后，多酶的組合往往導(dǎo)致通量不平衡，其整體轉(zhuǎn)化效率受到特定酶的限制。瓶頸效應(yīng)可能導(dǎo)致某種中間產(chǎn)物的積累，降低了整體轉(zhuǎn)化效率，還會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。除了研究酶的內(nèi)在性質(zhì)以尋求更好的突變體外，設(shè)計(jì)合理的多酶組裝策略也被證明是提高整體途徑效率的有效途徑，即將多個(gè)酶催化反應(yīng)按照一定層次與空間結(jié)構(gòu)組裝起來(lái)，使催化連續(xù)反應(yīng)的酶彼此相距更近。多酶催化體系組裝策略不僅限于酶融合技術(shù)［20］與共固定化技術(shù)［21］，還包括蛋白質(zhì)和DNA 支架技術(shù)［22］（圖2），此外還有部分研究采用了RNA 支架和基于病毒結(jié)構(gòu)蛋白的脂質(zhì)支架［23-24］。各類(lèi)支架技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，但仍需要更多的研究?jī)?yōu)化其構(gòu)型。

除了基于合成支架構(gòu)建酶復(fù)合物的策略，酶的限域固定化策略是另一種將酶限制于亞細(xì)胞空間的方法［圖2（d）］，通過(guò)蛋白融合和超分子組裝區(qū)室［17，25-27］形成不同層次和空間結(jié)構(gòu)。例如，模擬微區(qū)室（mimicking bacterial microcompartment，bmc）是一種與殼亞基組裝的大型蛋白質(zhì)復(fù)合物［28］，羧酶體是典型的bmc，它通過(guò)對(duì)代謝途徑酶進(jìn)行限域以提高易逃逸底物和有毒中間體的轉(zhuǎn)化率［29］，典型的例子包括二氧化碳固定和1，2-丙二醇降解催化體系［30-31］。部分其他類(lèi)型的bmc可形成更小的多面體蛋白復(fù)合物以適應(yīng)不同的多酶催化體系［28］。但對(duì)其組裝和功能化機(jī)制的有限了解，如結(jié)構(gòu)蛋白過(guò)表達(dá)的細(xì)胞負(fù)擔(dān)、細(xì)胞內(nèi)bmc 的物理空間擠占、中間體的選擇性滲透以及外源酶和殼蛋白之間的相互作用等問(wèn)題，阻礙了bmc 在生物合成中的應(yīng)用。然而，酶的限域固定化具有很大的潛力，因?yàn)樗峁┝艘粋€(gè)大且相對(duì)穩(wěn)定的亞細(xì)胞空間，可容納高濃度的局部代謝物，同時(shí)最大限度地減少對(duì)宿主細(xì)胞的破壞。

圖2 多酶催化體系的組裝技術(shù)［32］Fig.2 Assembly technology of multi-enzyme catalytic system［32］

現(xiàn)階段組裝復(fù)雜的多酶催化過(guò)程仍是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，目前化學(xué)品合成中應(yīng)用較多的多酶催化體系大多采用多酶共反應(yīng)或共固定化技術(shù)，如采用“一鍋法”反應(yīng)，將分離純化的多酶經(jīng)過(guò)載體結(jié)合或者直接于單個(gè)反應(yīng)容器中與底物混合，優(yōu)化協(xié)調(diào)各酶的反應(yīng)條件，最終獲得需要的高純度或單一立體選擇性的產(chǎn)品。相對(duì)于一般化學(xué)品，醫(yī)藥化學(xué)品對(duì)于立體選擇性和對(duì)映選擇性有著更高的要求，因此在多酶催化體系的構(gòu)建和組裝策略上其精準(zhǔn)度和嚴(yán)密性要求遠(yuǎn)高于一般化學(xué)品［32］。同時(shí)鑒于醫(yī)藥化學(xué)品需進(jìn)入人體或動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，其在生產(chǎn)方面的安全性要求更高，多酶催化反應(yīng)后的分離與提純的要求也更為復(fù)雜。

在一種人工多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，酶可能不會(huì)共享相似的最佳溫度，最佳pH 和其他條件，在相似濃度的試劑下可能不會(huì)具有相似的反應(yīng)速率。因此，需要對(duì)多酶催化反應(yīng)進(jìn)行測(cè)試，并進(jìn)行適配性優(yōu)化［33］。如Wahl 等［34］在構(gòu)建核苷酸糖多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系時(shí)，通過(guò)建立核苷酸糖的高通量的多重毛細(xì)管電泳分析方法（MP-CE），實(shí)現(xiàn)了6 個(gè)不同酶模塊的產(chǎn)物的快速分析檢測(cè)，解決了常規(guī)分析方法耗時(shí)、效率低的難題，提高了各酶促反應(yīng)適配性優(yōu)化效率。此外，可采用數(shù)學(xué)模型對(duì)每個(gè)反應(yīng)的條件（例如介質(zhì)、溫度、pH 和催化劑穩(wěn)定性）進(jìn)行平衡與優(yōu)化，并結(jié)合快速檢測(cè)方法尋找最佳的控制條件［35］。

綜上，各種方法已被開(kāi)發(fā)用于酶固定化，包括酶融合、支架基絡(luò)合和限域固定化，隨著對(duì)這些方法的進(jìn)一步理解，在構(gòu)建多酶催化體系時(shí)，要綜合考慮各酶促反應(yīng)熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)特性，合理設(shè)計(jì)層次結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)，以便突破反應(yīng)限速步驟與合成產(chǎn)率瓶頸，使更復(fù)雜的組裝技術(shù)助力更多產(chǎn)物的生物合成。

3 多酶催化體系在醫(yī)藥化學(xué)品合成中的應(yīng)用

3.1 多酶催化體系在抗生素類(lèi)藥物合成中的應(yīng)用

頭孢菌素類(lèi)抗生素的品種數(shù)量是各類(lèi)抗生素之首［36］，約占全球抗感染類(lèi)藥物的50%市場(chǎng)份額［37］。脫?；?7-氨基頭孢烷酸（D-7-ACA）是一種重要的醫(yī)藥中間體，一般用于內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的合成［38-41］。如圖3所示，Wei等［42］采用“兩酶一鍋法”替代傳統(tǒng)的“三酶三鍋法”，通過(guò)耦合固定化頭孢菌素C ?；福–PCA）和固定化頭孢菌素C去乙酰化酶（CAH）進(jìn)行反應(yīng)，最終獲得的D-7-ACA 產(chǎn)率為78.39%，比產(chǎn)率達(dá)到10.85 g/（g·h·L），比傳統(tǒng)方法的比產(chǎn)率提高了約4倍。

圖3 脫?；?7-氨基頭孢烷酸新舊合成路線比較［42］Fig.3 Comparison of two deacetyl-7-aminocephalosporanic acid synthetic routes［42］

D-2-氨基丁酸（D-2-aminobutyric acid）是一種非天然氨基酸，在藥物生產(chǎn)中起著重要的中間體的作用［43］，能夠合成抗生素［44-45］、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑［46-49］和抗增殖藥［50］等。目前對(duì)α-氨基酸外消旋體進(jìn)行拆分是獲得光學(xué)純D-氨基酸的主要方法，由于原子經(jīng)濟(jì)性低和排放量大等問(wèn)題，工業(yè)上迫切需要開(kāi)發(fā)出一種原料較為便宜且副產(chǎn)物少的生產(chǎn)方法。Chen等［50］在體外構(gòu)建了一種新的多酶催化體系（圖4），由L-蘇氨酸脫氨酶、D-氨基酸脫氫酶和甲酸酯脫氫酶組成，以容易獲得的L-蘇氨酸為底物，通過(guò)兩步酶促反應(yīng)，首先由L-蘇氨酸脫氨酶催化生成2-氧代丁酸，然后結(jié)合輔因子被D-氨基酸脫氫酶還原胺化獲得D-2-氨基丁酸，過(guò)程中無(wú)需額外添加氨，副產(chǎn)物只有水和二氧化碳，同時(shí)D-2-氨基丁酸的產(chǎn)率高于90%且純度大于99%。該系統(tǒng)能通過(guò)易獲得的L-α-氨基酸合成D-α-氨基酸，該方法原子經(jīng)濟(jì)性高，具有良好的發(fā)展前景。

圖4 多酶催化合成D-2-氨基丁酸［50］Fig.4 Synthesis of D-2-aminobutyric acid catalyzed by multi-enzyme［50］［L-threonine deaminase catalyzes production of 2-oxobutyric acid,which is combined with cofactors to be reductively amination by D-amino acid dehydrogenase to obtain D-2-aminobutyric acid,and at same time combined with formate dehydrogenase(FDH)to achieve NADPH of recycling]

聚酮化合物是臨床上重要的天然產(chǎn)物［51］，由于其復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)，常常需要步驟煩瑣的有機(jī)合成［52］。腸球菌素（enterococcin）作為一種關(guān)鍵的聚酮化合物，是由人或動(dòng)物腸道中的腸球菌在代謝過(guò)程中合成并分泌的一類(lèi)具有抑菌作用的細(xì)菌素［53］。Moore 課題組［54］首次在體外構(gòu)建了Ⅱ型聚酮類(lèi)化合物的酶促合成途徑，該體系利用單個(gè)反應(yīng)容器及苯甲酸及丙二酰CoA 作為反應(yīng)底物，設(shè)計(jì)了由酮合成酶鏈延長(zhǎng)因子的異源二聚體（EncA-EncB），?；d體蛋白（ACP）和ACP 轉(zhuǎn)?；附M成的聚酮化合物合酶，并耦聯(lián)聚酮化合物生物合成必需的ACP 連接酶（EncN）和酮還原酶（EncD）、黃素蛋白（EncM）和甲基轉(zhuǎn)移酶（EncK），通過(guò)外源補(bǔ)加ATP 及NADPH 及相應(yīng)輔因子（SAM），最終抗生素腸球菌素的總收率達(dá)到了25%（圖5）。

圖5 腸球菌素的體外多酶催化合成途徑［54］Fig.5 Multienzyme catalyzed synthesis pathway of enterococcin in vitro［54］

3.2 多酶催化體系在抗癌藥物合成中的應(yīng)用

L-酪氨酸（L-tyrosine）衍生物是一些生化標(biāo)記物和抗癌藥物的重要前體，同時(shí)還是合成生物學(xué)中重要的非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸［55-63］，特別是3-甲氧基-L-酪氨酸，不僅是左旋多巴的前體［64］，還是人類(lèi)L-氨基酸脫羧酶缺乏癥的重要生化指標(biāo)［57，65］。如果通過(guò)化學(xué)法從頭合成酪氨酸衍生物，不僅需要多個(gè)步驟，而且還會(huì)產(chǎn)生外消旋物質(zhì)，需要進(jìn)行后續(xù)的分離。為了更高效地合成L-酪氨酸衍生物，Dennig 等［66］設(shè)計(jì)了一種通過(guò)一鍋兩步法進(jìn)行合成的多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)（圖6），利用了單加氧酶和C—C裂解酶的聯(lián)合活性，以有取代基的苯、丙酮酸和氨氣為起始底物，在級(jí)聯(lián)過(guò)程中成功去除了抑制性酚類(lèi)反應(yīng)中間體，可以獲得純度大于97%的L-酪氨酸衍生物。以含甲苯的粗芳香族汽油共混物為底物，可制得3-甲基-L-酪氨酸2 g/L，產(chǎn)率為97%。時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到0.19 g/（L·h）。

圖6 一鍋法多酶級(jí)聯(lián)催化合成L-酪氨酸衍生物［66］Fig.6 Synthesis of L-tyrosine derivatives by one-pot multi-enzyme cascade catalysis［66］[Regioselective and chemoselective hydroxylation of aromatics(1a-f)is catalyzed by highly selective P450 BM3 mutant to generate o-phenol intermediates(3a-f)and p-phenol intermediates(2a-f).In second step,under condition of consuming NH3,tyrosine phenol lyase(TPL)catalyzes C-C coupling of 3a-f to generate pyruvate to obtain L-4a-f]

2'-脫氧鳥(niǎo)苷酸（deoxyguanosine-2'-monophosphate，dGMP）是合成寡脫氧核苷酸等抗病毒、抗腫瘤核酸藥物的重要原料，可直接用于制備組合脫氧核苷藥物或者作為化學(xué)試劑用于生化研究［67-68］。同時(shí)又可作為中間體用于合成一些抗病毒核苷類(lèi)藥物以及分子標(biāo)記物［69］。傳統(tǒng)上，dGMP 是從DNA 降解產(chǎn)物分離出來(lái)的，這表示其是低產(chǎn)且耗時(shí)的。Li 等［70］研究了一種新型的一鍋多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)以生產(chǎn)dGMP（圖7）。該反應(yīng)涉及來(lái)自大腸桿菌的嘌呤核苷磷酸化酶（PNPase）和乙酸激酶（ACKase），來(lái)自德氏乳桿菌的N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶Ⅱ（NDT-Ⅱ）和來(lái)自枯草芽孢桿菌的脫氧鳥(niǎo)苷激酶（dGKase）。最初的鳥(niǎo)苷底物首先被PNPase裂解為鳥(niǎo)嘌呤和1-磷酸核糖。隨后NDT-Ⅱ催化鳥(niǎo)嘌呤和胸苷反應(yīng)生成脫氧鳥(niǎo)苷（dGR）。最后，通過(guò)dGKase 和ACKase 利用乙酰磷酸的胞苷三磷酸（CTP）再生系統(tǒng)將中間體dGR 磷酸化為dGMP。在反應(yīng)過(guò)程中，最初的鳥(niǎo)苷底物被PNPase切割成鳥(niǎo)嘌呤和核糖-1-磷酸。然后，dGR 隨后由鳥(niǎo)嘌呤和胸苷之間的反應(yīng)產(chǎn)生，NDT-Ⅱ催化反應(yīng)進(jìn)行。最后，中間體脫氧核糖核酸通過(guò)脫氧葡萄糖苷酶和CTP磷酸化生成dGMP。在反應(yīng)過(guò)程中，添加了非常少量的CTP，因?yàn)镃TP 再生可有效地將磷酸基團(tuán)從乙酰磷酸酯轉(zhuǎn)移至dGR。孵育12 h 后，基于添加5 mmol/L 鳥(niǎo)苷和5 mmol/L 胸苷，獲得的最高dGMP產(chǎn)率高達(dá)76%。這是一種綠色高效生產(chǎn)dGMP的新型生物合成途徑，選用了低成本的環(huán)保試劑并減少了中間產(chǎn)物的積累。

圖7 一鍋法多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)生產(chǎn)2'-脫氧鳥(niǎo)苷酸路線［70］Fig.7 One-pot multi-enzyme cascade production route of deoxyguanosine-2'-monophosphate［70］［Original guanosine substrate is first cleaved by PNPase into guanine and 1-phosphate ribose.Subsequently，NDT-Ⅱcatalyzes reaction of guanine and thymidine to produce deoxyguanosine（dGR）.Finally，dGKase and ACKase utilize cytidine triphosphate（CTP）regeneration system of acetyl phosphate to phosphorylate intermediate dGR into dGMP.During reaction，original guanosine substrate is cleaved by PNPase into guanine and ribose-1-phosphate.Then，dGR is subsequently produced by reaction between guanine and thymidine，and NDT-Ⅱcatalyzes reaction to proceed.Finally，intermediate deoxyribonucleic acid is phosphorylated by deoxyglucosidase and CTP to generate deoxyribonucleic acid polysaccharide］

3.3 多酶催化體系在心血管疾病、肝病和精神疾病藥物合成中的應(yīng)用

他汀類(lèi)藥物是合成降膽固醇藥物的活性成分［71-72］，阿托伐他汀與同類(lèi)藥物相比在降低膽固醇方面具有強(qiáng)大的效力，故被認(rèn)為是超級(jí)他汀類(lèi)藥物［73-74］。?varc 等［75］采用多酶2-脫氧核糖-5-磷酸醛縮酶（DERA）催化雙醛醇加成生產(chǎn)阿托伐他汀側(cè)鏈前體（圖8），通過(guò)DERA 將乙醛連續(xù)雙醛加成于苯乙酰胺的氨基保護(hù)丙醛上，經(jīng)NADPH依賴型脫氫酶（KRED）脫氫，脂肪酶催化?；嗝顾谿-?；该摪被Ｗo(hù)，最終獲得目的產(chǎn)物，在補(bǔ)料式反應(yīng)器中獲得最高的最終產(chǎn)物濃度為124 g/L。

圖8 阿托伐他汀側(cè)鏈前體生產(chǎn)路線［75］Fig.8 Atorvastatin side chain precursor production route［75］DERA—2-deoxyribose-5-phosphate aldolase；KRED—NADPH-dependent dehydrogenases；PGA—penicillin G-acylase

熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid）常用于治療各型肝類(lèi)與眼部疾病等［76-80］。但是其化學(xué)合成方法多以動(dòng)物膽酸為原料，存在步驟多、分離困難、收率低等問(wèn)題［81］。Monti 等［82］首先篩選了酶的可用性（從商業(yè)來(lái)源或?qū)嶒?yàn)室生產(chǎn)），并通過(guò)動(dòng)力學(xué)測(cè)量評(píng)估了它們的底物和輔酶的特異性，之后利用“一鍋法”將細(xì)菌來(lái)源獲得的各類(lèi)羥基類(lèi)固醇脫氫酶（HSDHs）與輔酶再生結(jié)合，交替進(jìn)行氧化步驟和還原步驟，開(kāi)發(fā)出耦合的原位再生系統(tǒng)，為作用在底物分子不同部位上的氧化反應(yīng)和還原反應(yīng)提供了必要的驅(qū)動(dòng)力，催化膽酸合成熊去氧膽酸的關(guān)鍵中間體12-酮基熊去氧膽酸（12-ketoursodeoxycholic acid）。將6 種最終反應(yīng)物混合，通過(guò)酸沉淀分離出關(guān)鍵中間體產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化率為73%。該混合反應(yīng)存在3 種可能路徑：第1 條路徑膽酸先被NADPH 依賴型7α-HSDH 氧化為3α，12α-二羥基-7-氧代-5β-膽烷酸（3α，12α-dihydroxy-7-oxo-5β-cholanoic acid），再被12α-HSDH氧化為3α-羥基-7，12-二氧代-5β-膽烷酸（3α-hydroxy-7，12-dioxo-5β-cholanoic acid），最后通過(guò)7β-HSDH催化生成關(guān)鍵中間體12-酮基熊去氧膽酸；第2 條路徑，膽酸7 號(hào)位羥基首先被7α-HSDH 氧化為酮基，但此后則被7β-HSDH 立體選擇性還原生成熊果膽酸（ursocholic acid），最后通過(guò)12α-HSDH 氧化為關(guān)鍵中間體；第3 條路徑膽酸先被12α-HSDH 氧化為12-酮基熊果膽酸（12-ketoursocholic acid），再被7α-HSDH 氧化為3α-羥基-7，12-二氧代-5β-膽烷酸，最后通過(guò)7β-HSDH 催化生成關(guān)鍵中間體12-酮基熊去氧膽酸（圖9）。

圖9 合成熊去氧膽酸的關(guān)鍵中間體途徑［82］Fig.9 Key intermediate synthesis pathway of ursodeoxycholic acid［82］

R-1-苯 基-1，2-乙二醇［（R）-1-phenyl-1，2-ethanediol］通常用于合成R-去甲氟西?。?3］、R-氟西?。?4］和β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素［85］，可以用來(lái)治療精神疾病和相關(guān)的新陳代謝問(wèn)題［86］。通過(guò)氧化還原反應(yīng)去消旋化是獲得對(duì)映體純化合物的最具吸引力的方法之一，但目前可用的酶促系統(tǒng)均受限于去消旋化的效率。Li等［87］評(píng)估了20種具有立體選擇性的氧化還原酶，篩選出了一種酮還原酶和一種立體特異性羰基還原酶，將這兩種酶組合為多酶催化體系并與輔因子再生系統(tǒng)結(jié)合（圖10）。外消旋PED 消旋為R-對(duì)映體，通過(guò)Enzyme 1，（S）-PED 被氧化成2-羥基磷灰石，同時(shí)NADP+被還原成NADPH。隨后，通過(guò)Enzyme 2，2-羥基磷灰石被還原為（R）-PED，同時(shí)還將NADPH 氧化為NADP+。利用這種“一鍋法”生產(chǎn)R-1-苯基-1，2-乙二醇，產(chǎn)率達(dá)到91.62%，光學(xué)純度為95.50%，該系統(tǒng)為今后構(gòu)建體外無(wú)細(xì)胞多酶催化去消旋化體系提供了策略。

圖10 體外多酶催化去消旋化體系生產(chǎn)（R）-1-苯基-1，2-乙二醇［87］Fig.10 (R)-1-Phenyl-1,2-ethanediol were produced by in vitro multi-enzyme catalytic de-racemization system［87］［Racemic PED is reduced to(R)-enantiomer through selective oxidation and asymmetric reduction involving self-circulation of cofactor.Enzyme 1 oxidizes(S)-PED to 2-HAP and reduces NADP+to NADPH.Subsequently,by enzyme 2,2-HAP is reduced to(R)-PED,while NADPH is oxidized to NADP+]

3.4 多酶催化體系在其他活性成分合成中的應(yīng)用

D-葡萄糖二酸（D-gluconic acid）是一種重要的增值化學(xué)品原料和添加劑，在制藥行業(yè)中也有廣闊的應(yīng)用前景［88］。但是葡萄糖酸在生物體內(nèi)由于代謝物競(jìng)爭(zhēng)等原因，生產(chǎn)效率并不高，這促使人們尋求更高效、生產(chǎn)成本更低的途徑。傳統(tǒng)的葡萄糖酸的生產(chǎn)方法是離子交換法［89］，樹(shù)脂的再生、鹽污染的處理都大大增加了生產(chǎn)成本，人們轉(zhuǎn)而利用生物多酶催化的方法，Su 等［90］開(kāi)發(fā)了一種新型的多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，利用單個(gè)容器“一鍋法”結(jié)合7種酶有效地將蔗糖轉(zhuǎn)化為D-葡萄糖二酸，將50 mmol/L 的蔗糖轉(zhuǎn)化為34.8 mmol/L 的D-葡萄糖二酸，達(dá)到了理論收率的75%。也有研究者通過(guò)非共價(jià)鍵將多種酶共固定在氧化石墨烯上，用于從淀粉中一鍋生產(chǎn)葡萄糖酸［91］。此外，Petroll等［92-93］在體外構(gòu)建了一種以葡萄糖為底物多酶催化生產(chǎn)D-葡萄糖酸的平臺(tái)，整個(gè)過(guò)程一共有6種酶參與，其中NADH 氧化酶（Nox）用于NAD+的再生，將熱穩(wěn)定酶和嗜溫酶融合提高穩(wěn)定性（圖11），并對(duì)途徑中的酶進(jìn)行固定化和回收利用，將途徑分為兩個(gè)反應(yīng)（“兩鍋法”），生產(chǎn)率達(dá)到（0.170±0.004）g/（h·L），是迄今為止報(bào)道的最高生產(chǎn)率。

圖11 多酶催化生產(chǎn)D-葡萄糖二酸［90］Fig.11 Production of D-gluconic acid by multi-enzyme catalysis from glucose［90］[Conversion of G1P to GlucA was achieved by six enzymes:i)a phosphoglucomutase(PGM)which catalyses intermolecular phosphate transfer of G1P to G6P,ii)a myo-inositol-3-phosphate synthase(IPS)which catalyses multi-step oxidation,cyclisation and reduction of G6P to I1P,iii)a inositol-1-monophosphatase(IMP)which catalyses dephosphorylation of I1P to myo-inositol,iv)a myo-inositol oxygenase(MIOX)which mediates oxygen-catalysed oxidation of myo-inositol to GA,v)uronate dehydrogenase(Udh)which catalyses oxidation of GA to glucaro-1,4-lactone(GlucA lactone)under reduction of NAD+to NADH and vi)a NADH oxidase(Nox)for NAD+regeneration to minimise supply of expensive coenzyme for continuous GlucA production.GlucA lactone ring is mostly stable in neutral solutions and is hydrolysed to GlucA with heating in alkaline conditions]

萜類(lèi)化合物（terpenoids）是與工業(yè)相關(guān)的天然產(chǎn)物中具有生物活性的最大類(lèi)別之一，并被廣泛應(yīng)用于生物燃料、日用化學(xué)品、維生素、藥物等相關(guān)產(chǎn)業(yè)中［94-98］。目前通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)萜類(lèi)化合物已經(jīng)得到了應(yīng)用，大腸桿菌和釀酒酵母均已成功工程化能夠生產(chǎn)單萜、二萜等化合物［99-101］。但是大批量生產(chǎn)工業(yè)用的萜類(lèi)化合物還尚未實(shí)現(xiàn)，產(chǎn)品或中間體的毒性、相互競(jìng)爭(zhēng)的內(nèi)源途徑、難以分離產(chǎn)物等問(wèn)題限制了工程菌的高產(chǎn)量生產(chǎn)。Korman 等［102］試圖通過(guò)無(wú)細(xì)胞生產(chǎn)的方法來(lái)解決上述問(wèn)題并成功提高了產(chǎn)量。首先使用CoPASI38 開(kāi)發(fā)了計(jì)算機(jī)模型探索整個(gè)系統(tǒng)設(shè)計(jì)的基本特征。在獲得合理模型的情況后，利用“一鍋法”構(gòu)建了一個(gè)含有27 種酶的系統(tǒng)可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為單萜（圖12），轉(zhuǎn)化率＞95%，產(chǎn)物濃度＞15 g/L，遠(yuǎn)高于細(xì)胞系統(tǒng)，表現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力。

圖12 多酶催化生產(chǎn)單萜［102］Fig.12 Production of monoterpenes from glucose by multi-enzyme catalysis［102］(Enzymes in each sub-module are marked with colored boxes,and steps of consuming and generating ATP are shown in purple and blue respectively.Purge valve that produces NADPH is shown in red,while top of mevalonate pathway that consumes NADPH is shown in orange.Solid arrow represents flow of cofactor,and dotted arrow emphasizes cycle of each step in pathway)

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA）作為一種環(huán)境相容性及選擇性很高的新型光活化農(nóng)藥［103］，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛［104］，其合成方法主要通過(guò)化學(xué)合成［105］和微生物發(fā)酵生產(chǎn)［106］?；瘜W(xué)合成以乙酰丙酸為原料，但是3 位和5 位在溴代中選擇性接近，致使5 位分離產(chǎn)率較低。Meng 等［107］使用熱穩(wěn)定酶開(kāi)發(fā)無(wú)細(xì)胞多酶催化過(guò)程用于5-氨基乙酰丙酸的生產(chǎn)。以廉價(jià)的琥珀酸和甘氨酸為底物，開(kāi)發(fā)了通過(guò)3 種酶，即來(lái)自糖醋桿菌的5-氨基乙酰丙酸合酶（LS-ALAS），來(lái)自大腸桿菌的琥珀酰CoA 合酶（Suc）和多磷酸鹽激酶（Ppk）生產(chǎn)ALA 的無(wú)細(xì)胞催化過(guò)程。該過(guò)程中通過(guò)Ppk 再生ATP，而CoA 通過(guò)ALAS 和Suc 催化的兩個(gè)反應(yīng)進(jìn)行再循環(huán)（圖13）。琥珀酰CoA 的前體琥珀酸酯以分批補(bǔ)料的方式加入到反應(yīng)體系中，避免其對(duì)Suc 的抑制作用。反應(yīng)160 min 后，5-氨基乙酰丙酸濃度最終增加到5.4 mmol/L（0.7 g/L），這是生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的首次無(wú)細(xì)胞研究，也是對(duì)未來(lái)高效經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的一種嘗試。

圖13 無(wú)細(xì)胞多酶催化合成5-氨基乙酰丙酸［107］Fig.13 Synthesis of 5-aminolevulinic acid catalyzed by cell-free multi-enzyme［107］[(Succinyl-CoA synthase catalyzes succinate to produce succinyl-CoA,and CoA can be catalyzed by two reactions catalyzed by 5-aminolevulinic acid synthase and succinyl-CoA synthase recycling is carried out,and another required substrate,ATP,provides required ATP from polyphosphate through polyphosphate kinase regenerationsystem)]

4 多酶催化體系存在的問(wèn)題

雖然蛋白質(zhì)模擬和設(shè)計(jì)的新興技術(shù)已經(jīng)取得長(zhǎng)足進(jìn)展，使得工藝設(shè)計(jì)定制特定的酶成為可能，但對(duì)酶動(dòng)力學(xué)及其構(gòu)效關(guān)系仍缺乏完整而深刻的認(rèn)識(shí)。首先，從環(huán)境動(dòng)力學(xué)角度出發(fā)，環(huán)境因素（例如特定的化學(xué)物質(zhì)、pH、溫度等）會(huì)顯著影響多酶系統(tǒng)的相互作用，因此最佳的酶催化條件通常不適合多酶的組裝［108］。同時(shí)由于大分子相互作用的復(fù)雜性，在分子水平上實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)多酶體系的組裝過(guò)程和探索組裝機(jī)理是一個(gè)挑戰(zhàn)，所以為了揭示多酶復(fù)合物受控組裝的機(jī)理，可以開(kāi)發(fā)更高級(jí)的動(dòng)態(tài)模擬組裝過(guò)程中涉及多級(jí)相互作用的構(gòu)象變化的策略。如在Qiu 等［109］的研究中開(kāi)發(fā)了基于量子點(diǎn)（QDs）的納米探針（圖14），它能夠檢測(cè)彎曲的毛細(xì)管內(nèi)兩種酶的相互作用，然后通過(guò)監(jiān)測(cè)原始Cy5-LEVLVP-QD 復(fù)合物產(chǎn)生的峰和顯著的熒光變化，對(duì)兩種不同的酶進(jìn)行了靈敏的分析。

圖14 Cy5-LEVLVP-QD納米探針多酶檢測(cè)原理［109］Fig.14 Schematic representation of multi-enzyme detection using Cy5-LEVLVP-QD nanoprobe［109］

同樣在Xiang 等［110］的研究中使用多層酶逐層組裝的單壁碳納米管（SWCNT）復(fù)合標(biāo)簽技術(shù)放大檢測(cè)的靈敏度，捕獲抗體和次級(jí)信號(hào)抗CEA/酶-LBL/SWCNT生物綴合物之間的相互作用（圖15）。

圖15 SWCNT-（PDDA/ALP）n-PDDA-PSS-Ab2生物偶聯(lián)物的制備［110］Fig.15 Illustration of preparation of SWCNT-(PDDA/ALP)n-PDDA-PSS-Ab2 bioconjugates［110］

其次，所謂的從頭設(shè)計(jì)仍然停留在非常基礎(chǔ)的階段，基于此設(shè)計(jì)的酶活性差、穩(wěn)定性低，因此，不得不使用天然的酶結(jié)構(gòu)作為蛋白質(zhì)進(jìn)化研究的起點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)和高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，相對(duì)從頭設(shè)計(jì)而言，酶的結(jié)構(gòu)改造已經(jīng)較為成熟，獲得具有更多特性不同的酶突變體，如提高工業(yè)酶底物活性和穩(wěn)定性，已是生物制造行業(yè)較為常見(jiàn)的步驟。大量突變體的獲得及改造思路的完善，使得生物催化劑庫(kù)得到擴(kuò)充，在體內(nèi)和體外構(gòu)建多酶催化體系也因此變得更為簡(jiǎn)單易行。在Lim 等［111］的研究中開(kāi)發(fā)了一種通用的基于CRISPR/Cas 的策略，來(lái)構(gòu)建可編程模式的多酶復(fù)合物（圖16），催化無(wú)活性的dCas9 核酸酶與SpyCatcher-SpyTag 化學(xué)結(jié)合使用，以高度模塊化的方式組裝酶。

圖16 DNA支架組裝CRISPR/Cas定向多酶復(fù)合物［111］Fig.16 General scheme of CRISPR/Cas-directed programmable assembly of multienzyme complexes on a DNA scaffold［111］

5 結(jié)語(yǔ)

隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，環(huán)保綠色等概念的提出，對(duì)化學(xué)品的生產(chǎn)要求也越來(lái)越高，而且手性化學(xué)品與結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化學(xué)品利用化學(xué)合成難度較大。酶被用來(lái)代替化學(xué)催化劑轉(zhuǎn)化有機(jī)化合物，并具有更高的反應(yīng)效率、區(qū)域選擇性和立體選擇性等優(yōu)點(diǎn)。因此，生物催化劑現(xiàn)在被廣泛用于生產(chǎn)有價(jià)值的商品化學(xué)品、藥品和燃料。此外，生物催化反應(yīng)通常在較溫和的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)所需的能量較低，生物催化反應(yīng)可以在水環(huán)境中進(jìn)行，降低了溶劑的使用和處理/回收成本，而能源消耗和產(chǎn)物分離成本是影響產(chǎn)品最終價(jià)格的重要因素。

由于多酶催化體系高度可控，以及模式化工具箱的出現(xiàn)和人工多酶合成途徑的增多，一般僅利用常見(jiàn)的起始原料，即可生產(chǎn)各類(lèi)代謝中間體，并轉(zhuǎn)化為更為復(fù)雜的目標(biāo)化合物。與傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵生產(chǎn)相比，多酶催化系統(tǒng)具有許多優(yōu)勢(shì)，體外構(gòu)建多酶催化體系復(fù)雜程度較低，反應(yīng)條件易于控制，通常可以獲得一些純度更高的產(chǎn)物，甚至能夠構(gòu)建一些新型的多酶催化體系來(lái)完成一些生物體內(nèi)本來(lái)不存在的反應(yīng)［112］。隨著不同生物催化劑的使用范圍的不斷擴(kuò)大，這些多酶級(jí)聯(lián)催化可能會(huì)變得更加普遍，但在構(gòu)建多酶催化體系時(shí)，不僅要考慮到總體催化效率，還需要對(duì)體系中的介質(zhì)和每種酶的催化活性進(jìn)行評(píng)估和選擇，從而避免競(jìng)爭(zhēng)途徑、毒性效應(yīng)和宿主與工業(yè)條件的不相容等問(wèn)題。

然而多酶催化體系仍有許多不足之處，如需要生產(chǎn)和純化各個(gè)生物酶，并構(gòu)建空間復(fù)合體系，導(dǎo)致時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本的提高，且沒(méi)有類(lèi)似于積木一樣隨取隨用的模塊酶，生產(chǎn)特定產(chǎn)物需要構(gòu)建特定的體系，隨著多酶體系的復(fù)雜程度提高，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的變化也不可忽視，此外產(chǎn)物抑制和酶催化劑的不穩(wěn)定等問(wèn)題，使多酶催化體系的構(gòu)建技術(shù)仍不適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。多酶催化體系雖然更易于控制，但需要對(duì)生物催化劑進(jìn)行生產(chǎn)和純化，并將其組裝成空間結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)，這就又為工業(yè)應(yīng)用增加了成本。未來(lái)多酶催化體系的構(gòu)建應(yīng)與計(jì)算機(jī)模擬和許多新興技術(shù)與材料相結(jié)合，研究設(shè)計(jì)出可重復(fù)使用，耐受性強(qiáng)和實(shí)用方便的多酶反應(yīng)系統(tǒng)，使其越來(lái)越多地應(yīng)用于生物材料與化工產(chǎn)品的生產(chǎn)上。