王俊婷，郭瀟佳，李青，萬里，趙宗保

（1 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 116023；2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

甲醇是大宗有機一碳化合物，全球年產(chǎn)量達6000 萬噸，有望成為未來生物煉制產(chǎn)業(yè)的重要原料［1-2］。煤、天然氣、頁巖氣和CO2等通過化學(xué)法可規(guī)?；苽浼状迹趶U物處理和垃圾填埋場中，厭氧消化產(chǎn)生的甲烷和合成氣，也可進一步轉(zhuǎn)化為甲醇［3］。通過改造甲基營養(yǎng)型微生物或重建甲基利用途徑，構(gòu)建了一系列以甲醇為原料的微生物細胞工廠［4-5］。甲醇氧化酶將甲醇氧化為甲醛為代謝提供碳源，同時產(chǎn)生過氧化氫，后者需要消耗額外能量予以清除［6］。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，圖1）依賴型甲醇脫氫酶（MDH）也可氧化甲醇合成甲醛，同時生成化學(xué)計量的NADH 可作為代謝的還原力［7］。來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌Bacillus stearothermophilusDSM2334 的NAD 依賴型MDH（BsMDH，UniProt：P42327.1）對甲醇親和力較高［8］，Km為20 mmol/L［7］。目前文獻中研究較多的NAD 依賴型MDH 包括BsMDH 和Bacillus methanolicus（BmMDH）［6］，而BmMDH對甲醇的Km為132 mmol/L［1，9］，其對甲醇的親和力比BsMDH 更低。除此之外，還有來源于谷氨酸棒桿 菌Corynebacterium glutamicum的MDH 的Km也在97 mmol/L 左右；來源于鉤蟲貪銅菌Cupriavidus necatorN-1 的MDH 與BmMDH 相似，對甲醇的親和力在132 mmol/L 左右，且對ACT 不敏感；來源于解木糖賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillus xylanilyticus的MDH 的Km在3 mmol/L 左右，雖然對甲醇的親和力相對較高，但其最適反應(yīng)條件為pH9.5 和55 ℃，不符合大腸桿菌的最適生長條件［10］。研究表明，BsMDH 易于在大腸桿菌中過量表達，已成功用于構(gòu)建利用甲醇的工程菌株［11-12］或基于甲醇的胞外氧化還原體系［13］。

圖1 NAD及NCD的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of NAD and NCD

NAD 及其還原型NADH 是胞內(nèi)重要的輔因子，廣泛參與氧化還原代謝反應(yīng)［14］。NAD（H）還可以參與其他生物學(xué)過程如細胞繁殖、生長、分化和凋亡等［15］。調(diào)控胞內(nèi)NAD（H）水平是代謝工程及合成生物研究中改善宿主性能的常用手段，獲得過大量成功案例［16］。然而，NAD（H）水平擾動可對胞內(nèi)代謝反應(yīng)產(chǎn)生復(fù)雜且難以預(yù)測的影響［17-18］。利用NAD 類似物，可提高催化效率、促進輔因子循環(huán)再生或提高生物催化反應(yīng)［19-20］。雖然一些結(jié)構(gòu)簡化的NAD 類似物可用于體外酶催化，但在胞內(nèi)應(yīng)用需特別考慮生物兼容性，如氧化還原電位、溶解性以及結(jié)構(gòu)單元是否易于生物合成等［21］。此外，也有研究嘗試將NAD 生物合成前體如煙酰胺單核苷酸（NMN）和化學(xué)修飾的NAD 類似物用做非天然氧化還原輔酶［22-23］。本課題組早期合成了一系列具有生物活性的NAD 類似物［24-26］，其中煙酰胺胞嘧啶二核苷酸（NCD，圖1）與NAD 在結(jié)構(gòu)上存在一個堿基差異。以NAD 依賴型蘋果酸酶為模型，改造篩選獲得了系列偏好NCD 的蘋果酸酶突變體［27］，通過改造亞磷酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的輔酶結(jié)合口袋，均得到了偏好NCD 的突變體，并成功構(gòu)建了NCD 介導(dǎo)的、正交于內(nèi)源氧化還原輔酶的代謝線路［28-29］。最近，也有研究嘗試構(gòu)建基于NMN［30］及其他煙酰胺衍生物［21］的氧化還原催化體系，并取得了有價值的成果［31］。這些研究不斷豐富氧化還原催化元件，對合成生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展具有重要意義。

本研究的目的是改造BsMDH 的輔酶結(jié)合口袋，篩選獲得偏好NCD 的突變體，為構(gòu)建利用甲醇的新型氧化還原催化體系及微生物細胞工廠提供功能元件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

構(gòu)建文庫及蛋白質(zhì)表達及純化時所用宿主為大腸桿菌BL21（DE3）。密碼子優(yōu)化的BsMDH 編碼基因［8］由Synbio Technologies合成，并已克隆在表達質(zhì)粒pTrc99K-MDH［32］。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L。

TB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨12 g/L，酵母提取物24 g/L，甘油4 mL/L，磷酸二氫鉀0.017 mol/L，磷酸氫二鉀0.072 mol/L。

1.1.3 主要試劑和儀器

試劑：NBT（硝基四氮唑藍）、PMS（酚嗪硫酸甲酯）、溶菌酶、MTT（噻唑藍）、PES（酚嗪硫酸乙酯）、NAD 等購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司。NCD由本實驗室合成［6］。

儀器：全波長酶標掃描儀（PowerWave XS，Bio-Tek Instruments Inc.，USA）；蛋白結(jié)構(gòu)模擬工具Swiss model和MOE（CCG，Montreal，Canada）；高通量細胞培養(yǎng)與活性分析系統(tǒng)（Beckman）。

1.2 文庫構(gòu)建及篩選

1.2.1 結(jié)構(gòu)模擬及分子對接

以序列相似度58% 的醇脫氫酶（PDB ID：3s2e）的晶體結(jié)構(gòu)為模板，用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源性模型服務(wù)器（SWISS-MODEL）模擬BsMDH 的結(jié)構(gòu)［33］，用軟件PyMOL 分析結(jié)構(gòu)確定突變氨基酸殘基的空間位置并作圖［34］。用MOE 進行分子對接和結(jié)構(gòu)分析。分子對接：BsMDH 為受體，NCD 為配體，NAD 空腔為配體結(jié)合位點，對接選擇默認方法，其中放置方法為Triangle Matcher，優(yōu)化方法為Rigid Recepter，打分方法為London dG 和GbBVI/WSA dG，pose 值分別設(shè)置為300 和50，虛擬篩選設(shè)計方法選擇Residue Scan，篩選方法選擇LowMode，突變位點選擇1個。

突變體的分子對接利用MOE 進行，分別將BsMDH、突變體3-1 和9D1 與NAD 和NCD 對接。首先利用BsMDH 的晶體結(jié)構(gòu)（PDB：6IQD）對接NAD 和NCD。參照來源于Pseudomonas aeruginosa的醇脫氫酶（PDB：1LLU）中NAD 的結(jié)合區(qū)域，對接BsMDH 和NAD、NCD，配體放置方法為Triangle Matcher，優(yōu)化方法為Rigid Recepter，打分方法為London dG 和GbBVI/WSA dG，pose 值分別設(shè)置為100 和20。對于突變體，首先利用SWISS-MODEL 對突變體3-1 和9D1 建模，然后按照類似的方法與NAD和NCD對接。

1.2.2 突變位點選擇

基于NCD 與NAD 的結(jié)構(gòu)差異，推測通過改變氧化還原酶NAD 腺嘌呤結(jié)合空腔大小來實現(xiàn)輔酶偏好性的改變，選擇輔酶腺嘌呤0.8 nm 范圍內(nèi)的氨基酸殘基，進行單獨或組合突變。

1.2.3 文庫構(gòu)建

利用96 孔板的篩選技術(shù)構(gòu)建飽和突變文庫［35］，由于密碼子的簡并性，選擇NNK（N 為A，G，T，C；K為G，T）代替原來的3個堿基覆蓋所有可能的氨基酸，即用32 個密碼子可代表20 種氨基酸。使用不依賴于限制性內(nèi)切酶的克?。≧F 克隆）方法［36］構(gòu)建文庫，對于單位點突變，設(shè)計具有簡并密碼子NNK的引物，然后進行RF克?。粚τ诙辔稽c突變，首先擴增具有簡并密碼子的片段，然后進行RF 克隆。構(gòu)建文庫時，以攜帶野生型MDH 的質(zhì)粒用作模板，將PCR 產(chǎn)物在37 °C 用DpnI 處理2 h，然后將其轉(zhuǎn)化進大腸桿菌BL21（DE3）細胞中，待轉(zhuǎn)化子長出。

1.2.4 文庫篩選

為提高獲得最優(yōu)結(jié)果的概率，構(gòu)建在每個位點都覆蓋所有氨基酸的突變體文庫，然后進行篩選［37-38］。利用NBT-PMS 偶聯(lián)用方法，根據(jù)570 nm光吸收變化測定甲醇脫氫酶的活性［39-40］。按文獻方法估算擬篩選的轉(zhuǎn)化子數(shù)目［41］，保證覆蓋相應(yīng)文庫理論值的95%。

初篩在96孔板（每孔400 μL培養(yǎng)液），復(fù)篩在24孔板（每孔2.5 mL菌液），25 ℃培養(yǎng)48 h；離心去上清，每孔加入細胞裂解液100 μL，在-80 ℃凍17～18 h，然后37 ℃裂解2 h。顯色體系為HEPES（pH7.5）50 mmol/L，異丙醇13 mmol/L 或甲醇50 mmol/L，NBT 100 μmol/L，PMS 30 μmol/L，上清液10 μL。顯色時，初篩體系中添加NCD，復(fù)篩時設(shè)置2 個體系，分別加NCD 和NAD。輔酶濃度在0.1 mmol/L以上，根據(jù)文庫及活性情況而調(diào)整。

1.2.5 粗酶活測定

取上清粗酶液10 μL，在酶標板上分別進行與NAD 和NCD 的反應(yīng)，在570 nm 下測定光密度變化［28］。測定結(jié)果以每分鐘光密度的變化表示粗酶活（mOD570/min）。每個樣品3 個平行。體系為HEPES（pH7.5）50 mmol/L，NAD、NCD 的濃度根據(jù)酶對輔因子的活性而調(diào)整，異丙醇13 mmol/L或甲醇50 mmol/L，MTT 400 μmol/L，PES 1 mmol/L，粗酶液10 μL。鑒于MDH 以異丙醇為底物時催化活性更高［32］，在MDH活性篩選時，均首先以異丙醇為底物，再以甲醇進行復(fù)篩和驗證。

1.3 動力學(xué)測定

1.3.1 蛋白純化

突變體用LB 培養(yǎng)，WT 用TB 培養(yǎng)，添加50 μg/mL 卡那霉素，9D1 添加0.05 mmol/L IPTG，3-1 及其他突變體都添加0.1 mmol/L IPTG。純化（采用Invitrogen 的Ni-NTA 純化系統(tǒng)）時，菌體加入NBB 緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4，0.5 mol/L NaCl，pH8.0）超聲破碎，14 000 r/min離心30 min，上清液移到再生好的柱中，過夜靜置結(jié)合，用NWB緩沖液洗出雜蛋白，NEB 緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4，0.5 mol/L NaCl，250 mmol/L 咪 唑，pH8.0）洗出目的蛋白，將目的蛋白洗脫液用10 kDa超濾管超濾濃縮，保存在20%甘油中，-80 ℃保存。

1.3.2 酶動力學(xué)測定

酶循環(huán)法測定MDH 突變體的動力學(xué)，檢測條件為25 ℃，檢測波長570 nm［40］。酶活測定體系：HEPES（pH7.5）50 mmol/L，甲醇800 mmol/L，MTT 400 μmol/L，PES 1 mmol/L，NAD 或NCD 的濃度呈梯度變化，加超純水至100 μL，每個樣品3 個平行。分別將各酶稀釋不同的倍數(shù)用于NAD或NCD 檢測［28］。利用Origin8.5 擬合米氏方程。根據(jù)kcat=Vm/［E］（［E］為酶濃度）計算kcat。

酶活力單位定義為每分鐘產(chǎn)生1 μmol NADH或NCDH所需的酶量。比酶活按以下公式計算：

式中，Vt為反應(yīng)總體積，mL；L為光程，cm；Vs為加入酶的體積，mL；c為反應(yīng)體系中酶的濃度，mg/mL。

實驗用酶標掃描儀測酶循環(huán)法產(chǎn)生的甲?，其消光系數(shù)為16.2 L/（mmol·cm）。生成甲?的量與產(chǎn)生的NADH或NCDH存在嚴格的計量關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 虛擬篩選

分析MDH 結(jié)構(gòu)［圖2（a）］，NAD 腺嘌呤0.8 nm 范圍內(nèi)氨基酸位點有21 個，分別是I170、Y171、G172、I173、G174、V194、D195、I196、K200、L216、I235、S236、V237、A238、V239、N240、K241、K242、A243、F244、Q246。在篩選前，先使用MOE軟件進行了虛擬篩選［圖2（b）、（c）］，當?Affinity 大于0 時，表明親和力降低，當?Affinity小于0時，表明親和力提高。其中對NAD親和力下降的包括：G172、I196、V237、A238、V239、N240、A243；而對NCD 親和力上升的包括Y171、S197、K200、V237、A238、N240、K242、A243、F244。顯然，V237、A238、N240和A243可能在降低對NAD親和力的同時，提升對NCD的親和力。

圖2 BsMDH結(jié)構(gòu)模擬及輔酶結(jié)合性能虛擬篩選結(jié)果Fig.2 Structural modelling of MDH and virtual screening results with different cofactors

2.2 文庫構(gòu)建及篩選

對MDH 位點的選擇主要依賴于分析晶體結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基與NAD 腺嘌呤的空間相對位置［42］，再結(jié)合晶體中氨基酸殘基與NAD 腺嘌呤相互作用分析，采用迭代飽和突變和組合突變等方法對突變文庫進行半理性設(shè)計［43-44］。

對2.1 中所述位點進行飽和突變，按照流程［圖3（a）］構(gòu)建11 個單位點文庫及4 個雙位點文庫，從第1 輪文庫篩選中得到4C1 和3D2。經(jīng)過測序，4C1攜帶K242H/A243S突變；3D2攜帶V237T突變。粗酶活結(jié)果（圖3）中，以異丙醇為底物時3D2 的NCD/NAD 值提高了2 倍，而以甲醇為底物時提高了50%。所得結(jié)果包括V237和A243位點突變，與虛擬篩選結(jié)果相符。

繼續(xù)以4C1 和3D2 為模板，選取NAD 腺嘌呤周圍0.8 nm的其他位點，構(gòu)建突變體文庫。然而以4C1為模板構(gòu)建3個雙位點文庫和11個單位點文庫，并沒有得到更偏好NCD 的突變體；而在以3D2 為模板構(gòu)建3個雙位點文庫和10個單位點文庫時，得到兩個更好的突變體：3F1和5D3。其中，3F1攜帶V237T/N240E 突變，5D3 攜帶V237T/N240V 突變。粗酶活分析表明，3F1 和5D3 相比于3D2，其對NAD的活性降低了50%［圖3（b）、（c）］。3F1 和5D3均在相同位點突變，表明V237和N240位點對于輔酶偏好性有重要貢獻。

圖3 文庫篩選及粗酶活分析結(jié)果Fig.3 Library screening and activities of crude extracts

2.3 輔酶結(jié)合空腔改造

2.3.1 MDH輔酶結(jié)合空腔結(jié)構(gòu)分析

分析MDH 的結(jié)構(gòu)表明，V237 和N240 分別處于NAD 腺嘌呤平面的兩個方向。鑒于NAD 和NCD 的重要區(qū)別在于腺嘌呤比胞嘧啶基團空間更大，如果在腺嘌呤周圍選擇3個方向的位點進行突變，就可能更好地改變輔酶結(jié)合空腔大小，獲得輔酶結(jié)合空腔縮小不利于NAD 結(jié)合但適合NCD 的突變體。通過分析MDH 結(jié)構(gòu)，并根據(jù)已有篩選經(jīng)驗［27］，推測第3個方向的位點可能是Y171或I196。

2.3.2 單位點突變優(yōu)化輔酶結(jié)合空腔

根據(jù)上述推測和篩選的初步結(jié)果，基于位點Y171、I196、V237 和N240，設(shè)計了8 種MDH 突變體，即1-1～1-4 和2-1～2-4，以引入體積相對較大、極性的氨基酸側(cè)鏈［圖4（a）］。在大腸桿菌中表達這些突變體，并分別以異丙醇和甲醇為底物，以NAD 和NCD 為輔酶，進行了粗酶活分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除1-3 外，這些突變體與WT 比利用NAD和NCD的活性均降低到20%以下［圖4（b）、（c）］，暗示所引入的突變可能導(dǎo)致輔酶結(jié)合空腔過于擁擠，不利于NAD 或NCD 結(jié)合。因此，選擇具有大側(cè)鏈的K241 位點，將其突變?yōu)閭?cè)鏈較小的丙氨酸A，構(gòu)建了5種組合突變，即3-1、3-2、3-3、3-4和3-5。幸運的是，以異丙醇為底物時，突變體3-1利用NCD的粗酶活顯著高于其他突變體，而利用NAD 的粗酶活很低，表現(xiàn)出明顯的NCD 偏好性［圖4（b）］。以甲醇為底物時，3-1 利用NCD 比NAD具有稍高的粗酶活。

圖4 BsMDH及突變體粗酶活分析結(jié)果Fig.4 Results of activity assay of crude extracts of BsMDH and its variants

雖然粗酶活分析表明突變體3-1已具有NCD 偏好性，但其I196 位點尚未優(yōu)化。因此，以突變體3-1 為模板，構(gòu)建了I196 飽和突變文庫，篩選得到突變體9D1，其NCD/NAD 粗酶活比進一步提高，而對NAD 的活性顯著降低。測序分析表明，9D1攜帶5 個位點突變，即Y171R/I196V/V237T/N240E/K241A。

2.4 突變體的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1BsMDH突變體偏好NCD

在大腸桿菌中表達MDH WT 及突變體3D2、3F1、3-5、3-1 和9D1，純化得到重組蛋白。以甲醇為底物，分別以NAD 和NCD 為輔酶，分別進行酶催化反應(yīng)動力學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)見表1。

表1 MDH及突變體催化甲醇氧化的動力學(xué)數(shù)據(jù)Tab.1 Kinetic data of methanol oxidation catalyzed by MDH variants

首先分析以NAD 為輔酶的催化性能。除突變體3D2 和3-5 外，其他3 個突變體比WT 有更高的Km值，表明其對NAD 的親和力降低；而所有突變體均比WT 具有更低的kcat值，表明突變體的催化速率下降?？傮w上，以NAD 為輔酶時，突變體的催化效率（kcat/Km）最低降到WT 的0.1%以下。以NCD 為輔酶的催化性能變化趨勢相反。突變體比WT有更低的Km值，表明其對NCD 的親和力增強；但突變體的催化速率與WT 的相當，均在10-2s-1量級。但由于Km值降低較多，突變體9D1利用NCD的催化效率比WT提高仍然達10倍以上。突變體9D1對NAD 的Km值約1.0 mmol/L，對NCD 的Km值約為30 μmol/L；利用NCD 的催化效率為858 L/（mol·s），是利用NAD 的300 倍。用（kcat/Km）NCD/（kcat/Km）NAD來表示酶的NCD 偏好性，WT 與9D1 的NCD 偏好性分別為3.2×10?2和4.3×102，提高了13 000 倍；而突變體3-1 的NCD 偏好性則相對提高了740 倍。更重要的是，突變體9D1和3-1利用NCD的催化速率與WT 利用NAD 的催化速率均在10?2s?1量級，表明它們不僅具有很好的NCD 偏好性，還保留了較高的催化活性。總體而言，成功獲得了NCD 偏好型MDH突變體9D1。

2.4.2BsMDH突變體的穩(wěn)定性

初步比較了WT和突變體9D1在不同條件下的酶活性。結(jié)果表明，WT 與9D1 在25 ℃環(huán)境下酶活性呈現(xiàn)相同的變化趨勢，5 h 后均能保持55%以上活性［圖5（a）］。在37 ℃，pH9.0 的條件下孵育2 h 后，WT 和9D1 均能保留酶活60%以上。此外，它們在37 ℃下比30 ℃或25 ℃下具有更高活性［圖5（b）］；在pH9.0 比pH5.0 或7.0 的緩沖體系中活性更高［圖5（c）］，即環(huán)境因素對酶活性的影響趨勢相同?？梢?，突變體9D1 除輔酶偏好性改變外，穩(wěn)定性基本未受到影響。

圖5 不同條件下BsMDH及突變體9D1的活性Fig.5 Enzymatic activity of BsMDH(WT)and variant 9D1 under different conditions.

2.5 輔酶結(jié)合空腔結(jié)構(gòu)變化

對BsMDH 和突變體3-1、9D1 進行分子對接，分別對接NAD 和NCD，并分析輔酶結(jié)合空腔大小。從圖6 可以看出，BsMDH 中Y171、I196 和N240形成的空腔遠大于突變體3-1和9D1中相應(yīng)殘基形成的空腔。BsMDH 中Y171 和I196 之間的距離為0.81 nm，而突變體3-1 中R171 和I196 之間的距離縮短到0.38 nm，突變體9D1 中R171 和V196之間的距離為0.37 nm。此外，Y171R 突變是輔酶結(jié)合空腔變小的主要原因。由于NAD 的腺嘌呤結(jié)構(gòu)在空間上大于NCD 的胞嘧啶結(jié)構(gòu)，突變體輔酶結(jié)合空腔變小導(dǎo)致難以結(jié)合NAD，而有利于結(jié)合NCD。初步說明輔酶結(jié)合空腔變小是MDH 突變體偏好非天然輔酶NCD 的主要原因。這較好地吻合了亞磷酸脫氫酶輔酶偏好性改造研究中通過突變體-NCD復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)分析觀察到的現(xiàn)象［45］。

圖6 不同酶-輔酶組合的分子對接結(jié)果Fig.6 Docking results of different enzyme-cofactor pairs binding pocket

3 結(jié)論與展望

本文以NAD 依賴型甲醇脫氫酶BsMDH 為模板，模擬并分析了MDH 結(jié)構(gòu)后，借助虛擬篩選參考了一部分會對其輔酶偏好性產(chǎn)生影響的位點，而后通過對腺嘌呤0.8 nm 范圍的位點進行了文庫構(gòu)建及篩選，確定了V237和N240位點對輔酶偏好性的影響，從而進一步分析MDH 結(jié)構(gòu)，對Y171、I196 等位點進行了定點突變，最終成功得到偏好非天然輔酶NCD 的突變體。通過分析實驗數(shù)據(jù)，得到以下結(jié)論：

（1）鑒于NCD 的結(jié)構(gòu)小于輔酶NAD，將改造MDH 輔酶偏好性的重點放在縮小MDH 輔酶結(jié)合空腔上。通過模擬BsMDH 的結(jié)構(gòu)并確定NAD 的結(jié)合模式，從而確定了與腺嘌呤相距0.8 nm 范圍內(nèi)氨基酸位點；通過構(gòu)建突變體文庫、篩選和理性預(yù)測指導(dǎo)定點突變，最終得到偏好NCD 的突變體。通過對突變體9D1 和3-1 與NAD 和NCD 的分子對接，發(fā)現(xiàn)BsMDH 中Y171、I196 和N240 形成的空腔遠大于突變體3-1 和9D1 中相應(yīng)殘基形成的空腔，進一步說明改造輔酶結(jié)合空腔對輔酶偏好性的重要性。

（2）酶催化反應(yīng)動力學(xué)數(shù)據(jù)表明，以NAD 為輔酶時，突變體3F1、3-1 和9D1 比WT 有更高的Km值和更低的kcat值，表明這3 種突變體對NAD 的親和力降低和催化速率下降。WT 與9D1 對NCD的偏好性分別為3.2×10-2和4.3×102，酶的NCD 偏好性提高達13000 倍；同樣，與WT 比，突變體3-1 的NCD 偏好性提高了740 倍。此外，突變體利用NCD 的催化速率與WT 利用NAD 的催化速率均在10-2s-1量級，表明它們保留了較高催化活性。

基于本文成果，未來可開展以下更深入的研究：

（1）改造其他氧化還原酶的輔酶偏好性。本文改造MDH 輔酶偏好性的經(jīng)驗和流程，可能應(yīng)用于其他NAD 依賴型氧化還原酶如甲醛脫氫酶等。事實上，本文及前期改造蘋果酸酶［27］、亞磷酸脫氫酶［45］和甲酸脫氫酶［46］的系列研究表明，在結(jié)構(gòu)分析和半理性設(shè)計指導(dǎo)下，在輔酶結(jié)合空腔選擇位點，構(gòu)建突變體文庫并篩選，并最終得到具有高NCD 偏好性的突變體，通常均包含一些新引入的大側(cè)鏈極性氨基酸突變。本研究的中后期，采用單位點突變方法構(gòu)建13 種突變體的實驗，正是基于上述經(jīng)驗。因此，預(yù)計未來將其他NAD 依賴型氧化還原酶改造為NCD 偏好性的研究進程將變得更加有效和精準。

（2）構(gòu)建基于甲醇的新型氧化還原催化體系。甲醇可分3 步逐級生物氧化為CO2，每步反應(yīng)均有相應(yīng)輔酶依賴型氧化還原酶從而產(chǎn)生計量的還原型輔酶。本研究得到NCD偏好型MDH將甲醇氧化為甲醛，而此前的研究已獲得NCD 偏好型甲酸脫氫酶［29，46］。未來如果將甲醛脫氫酶的輔酶偏好性也予以改造并獲得NCD 偏好型突變體，即可構(gòu)建以甲醇為還原性底物的NCDH 供給體系，用于選擇性為特定代謝反應(yīng)或途徑提供還原力。本課題組認為，這種基于甲醇的NCDH 供給體系，與此前構(gòu)建的基于亞磷酸［7］和甲酸［8］的體系相比，更加綠色并具有更好的經(jīng)濟性。

總之，NCD偏好型MDH 突變體將可作為獨特的合成生物學(xué)功能元件，用于構(gòu)建新型氧化還原催化體系和先進微生物細胞工廠。