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        合成生物學(xué)研究中的微生物啟動(dòng)子工程策略

        2021-09-24 01:19:34于慧敏鄭煜堃杜巖王苗苗梁有向
        合成生物學(xué) 2021年4期
        關(guān)鍵詞:誘導(dǎo)型誘導(dǎo)劑生物學(xué)

        于慧敏,鄭煜堃,杜巖,王苗苗,梁有向

        (清華大學(xué)化學(xué)工程系,教育部工業(yè)生物催化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100084)

        近年來,致力于對(duì)生物學(xué)元器件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)構(gòu)建,使其未來可以在新型人工生物系統(tǒng)中進(jìn)行常規(guī)重復(fù)使用的合成生物學(xué)研究在全球范圍內(nèi)方興未艾[1-2]。利用合成生物學(xué)理論與工具,對(duì)生物體尤其是微生物及其相關(guān)蛋白(酶)、基因元件與線路等,進(jìn)行目標(biāo)明確的設(shè)計(jì)、重組改造乃至重新合成,對(duì)于解決我國(guó)與國(guó)計(jì)民生相關(guān)的生物醫(yī)藥、材料、環(huán)境、能源等重大問題,實(shí)現(xiàn)綠色制造和可持續(xù)發(fā)展、實(shí)現(xiàn)大健康戰(zhàn)略具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

        在合成生物學(xué)研究中,基因的精細(xì)表達(dá)調(diào)控是決定研究進(jìn)程的關(guān)鍵因素;而對(duì)于原核微生物,影響基因表達(dá)水平的最重要因素則是決定RNA 聚合酶(RNA polymerase,RNAP)轉(zhuǎn)錄機(jī)器識(shí)別效率的基因啟動(dòng)子序列。不同種屬微生物中的不同啟動(dòng)子序列決定了下游基因的表達(dá)強(qiáng)度及表達(dá)模式(組成型、誘導(dǎo)型),因此成為驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)、調(diào)控基因線路、賦能微生物功能、獲得高產(chǎn)酶與高性能細(xì)胞工廠的合成生物學(xué)核心元件[3]。通過啟動(dòng)子工程策略對(duì)微生物啟動(dòng)子特征及功能、全新的基因誘導(dǎo)表達(dá)模式進(jìn)行發(fā)掘與進(jìn)化改造,使其響應(yīng)不同的物理、化學(xué)信號(hào),實(shí)現(xiàn)精細(xì)、動(dòng)態(tài)、按需調(diào)控目標(biāo)基因(群)表達(dá),已經(jīng)成為目前合成生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。

        1 啟動(dòng)子識(shí)別與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的一般規(guī)律

        啟動(dòng)子是一段位于目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄區(qū)上游、能夠與RNA 聚合酶結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄起始的DNA 序列。在原核微生物中,負(fù)責(zé)執(zhí)行轉(zhuǎn)錄功能的轉(zhuǎn)錄機(jī)器——RNA 聚合酶全酶(包含α2、β、β'、ω、σ等亞基)依賴于其中的σ因子,特異性地識(shí)別具有特定序列特征的啟動(dòng)子區(qū)域并與之結(jié)合,從而引發(fā)轉(zhuǎn)錄的開始[4]。為了更好地闡明后文針對(duì)啟動(dòng)子工程研究的各種策略與前沿研究的設(shè)計(jì)思想,有必要從啟動(dòng)子識(shí)別與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基本規(guī)律說起。

        以大腸桿菌為例,其σ 因子有7 種,分別為:σ70(σD)、σ54(σN)、σ38(σS)、σ32(σH)、σ28(σF)、σ24(σE)和σfecI[5]。其中,σ70被稱為看家σ 因 子(housekeeping σ factor),它負(fù)責(zé)起始細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)的高達(dá)1 000多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄;σ54、σ38與σ32分別調(diào)控細(xì)胞的N 代謝基因、細(xì)胞穩(wěn)定期相關(guān)基因以及熱應(yīng)激響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。其他σ因子則分別調(diào)控極端熱應(yīng)激響應(yīng)及外細(xì)胞質(zhì)基因、鞭毛以及檸檬酸鐵代謝相關(guān)等基因[6]。不同的σ因子,對(duì)應(yīng)識(shí)別不同的目標(biāo)基因啟動(dòng)子。

        狹義的啟動(dòng)子通常是指在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)上游大約10 個(gè)及35 個(gè)核苷酸(nt)處的兩段DNA短序列(也稱為?10 區(qū)與?35 區(qū);或啟動(dòng)子核心區(qū)),它們對(duì)于不同σ 因子的識(shí)別具有決定性的作用[7]。以大腸桿菌啟動(dòng)子為例,對(duì)所有σ70因子識(shí)別基因啟動(dòng)子區(qū)域的統(tǒng)計(jì)分析表明,?10 區(qū)與?35區(qū)的一致序列為TATAAT 與TTGACA。這兩段序列之間通常被17 nt 的間隔序列所隔開。17 nt 的間隔序列長(zhǎng)度對(duì)于大腸桿菌基因的轉(zhuǎn)錄水平十分重要。當(dāng)間隔區(qū)長(zhǎng)度長(zhǎng)于18 nt或短于16 nt時(shí),RNA聚合酶與啟動(dòng)子的親和性都會(huì)顯著降低,從而調(diào)低基因轉(zhuǎn)錄[7]。此外,有些?35 區(qū)的上游序列能夠與RNA 聚合酶的α 亞基結(jié)合從而影響轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度——這些序列被稱作UP元件(UP element)[6,8]。

        以大腸桿菌典型的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)為例,其Plac和Ptrp啟動(dòng)子、σ70因子識(shí)別保守序列、σ54與σ32因子識(shí)別保守序列特征如圖1所示[6-11]。

        圖1 大腸桿菌代表性啟動(dòng)子及幾種σ因子的識(shí)別保守序列Fig.1 Representative promoters in E.coli and conserved sequences for RNA polymerase sigma factors

        再以另一種模式微生物——枯草芽孢桿菌為例,其看家σ 因子識(shí)別的啟動(dòng)子的?10 區(qū)與?35 區(qū)保守序列以及優(yōu)選的間隔區(qū)長(zhǎng)度都與大腸桿菌相同[8-9]。但與大腸桿菌不同的是,枯草芽孢桿菌的啟動(dòng)子還存在一些統(tǒng)計(jì)學(xué)特殊規(guī)律,比如,其?48 位大多為保守的T 堿基,?43 位附近富含A 堿基,而?17~?14 位的特征序列則通常為TNTG 等。在其他一些革蘭氏陽(yáng)性菌中該規(guī)律也存在。此外,枯草芽孢桿菌中還存在特定的、負(fù)責(zé)控制與芽孢形成相關(guān)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子σG,其靶基因的保守?10 區(qū)與?35 區(qū)一致序列變更為CATACTA 與TGAATA,優(yōu)選的間隔區(qū)長(zhǎng)度可為17~18 nt[10-11]。

        需要進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)的是,對(duì)于不同的非模式微生物,由于其看家σ 因子(以及其他σ 因子)可識(shí)別的啟動(dòng)子序列經(jīng)常并不相同,這就決定了在不同微生物種屬之間,乃至同一菌屬但不同種的微生物之間,很多啟動(dòng)子都無法通用,或者其轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)效果在不同菌種中呈現(xiàn)顯著差異。表1列出了幾種典型模式微生物與非模式微生物的σ70因子偏愛的?35 與?10 核心區(qū)序列。由表可見,盡管大腸桿菌與枯草芽孢桿菌的核心區(qū)保守序列具有相同的序列特征,但其他幾種微生物的核心區(qū)序列均存在一個(gè)或多個(gè)堿基的差異。

        表1 幾種模式/非模式微生物看家σ因子識(shí)別的啟動(dòng)子保守序列比較Tab.1 Some promoter consensus sequences for housekeep?ing σ factors of model/non-model microorganisms

        上述不同σ因子特異識(shí)別的保守序列差異與微生物細(xì)胞內(nèi)成百上千不同基因的啟動(dòng)子序列差異,就導(dǎo)致不同微生物基因在表達(dá)時(shí)可以形成各自的表達(dá)時(shí)間模式與強(qiáng)度模式,這些表達(dá)模式對(duì)于合成生物學(xué)研究至關(guān)重要。因此,針對(duì)不同微生物尤其是重要的非模式工業(yè)微生物,其σ 因子種類、數(shù)量與特征、受不同σ因子識(shí)別調(diào)控從而起始轉(zhuǎn)錄過程的新型啟動(dòng)子的特征、功能與調(diào)控規(guī)律研究正在受到越來越多的關(guān)注。

        此外,按作用強(qiáng)度區(qū)分,啟動(dòng)子可以分為強(qiáng)啟動(dòng)子(strong promoter)、中等強(qiáng)度啟動(dòng)子(moderate promoter)和弱啟動(dòng)子(weak promoter),其實(shí)質(zhì)就是其上述核心區(qū)特征序列與RNA 聚合酶σ 因子的特異性結(jié)合能力存在差異。通常,強(qiáng)啟動(dòng)子和中強(qiáng)啟動(dòng)子常用于目標(biāo)基因的高表達(dá),而弱啟動(dòng)子則用于特定基因的弱化表達(dá),以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和能量的代謝平衡[17]。

        按作用方式區(qū)分,啟動(dòng)子又可以分為組成型啟動(dòng)子(constitutive promoter)和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(inducible promoter)兩大類。其中,組成型啟動(dòng)子調(diào)控的基因,不需要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的參與,在細(xì)胞生長(zhǎng)過程中即可實(shí)現(xiàn)基因的正常轉(zhuǎn)錄與翻譯表達(dá)。而誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,則必須要正調(diào)控或負(fù)調(diào)控蛋白與誘導(dǎo)物(外加化學(xué)試劑或代謝物分子等化學(xué)信號(hào)或溫度、光、金屬離子等物理信號(hào))組合的共同作用,才能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程的順利進(jìn)行。鑒于合成生物學(xué)研究需要對(duì)細(xì)胞工廠中錯(cuò)綜復(fù)雜的代謝途徑與多目標(biāo)基因進(jìn)行差異化精準(zhǔn)調(diào)控,誘導(dǎo)型啟動(dòng)子受到更多的關(guān)注,現(xiàn)有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的按需進(jìn)化改造、新型誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)、誘導(dǎo)機(jī)制解析以及新誘導(dǎo)方式的普適化拓展應(yīng)用等已經(jīng)成為合成生物學(xué)領(lǐng)域的研究前沿與熱點(diǎn)。

        誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的負(fù)調(diào)控與正調(diào)控機(jī)理以及大腸桿菌最典型的β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的負(fù)調(diào)控誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的典型結(jié)構(gòu)特征如圖2所示[6]。

        在啟動(dòng)子的負(fù)調(diào)控方式中,負(fù)調(diào)控蛋白(也稱作阻遏蛋白或抑制子等)對(duì)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起負(fù)面的阻遏作用;它通常會(huì)結(jié)合到啟動(dòng)子下游、目標(biāo)基因上游的一段被稱為操縱序列的小DNA 片段上,從而阻止RNA 聚合酶對(duì)目標(biāo)基因的正常轉(zhuǎn)錄。而當(dāng)添加外源誘導(dǎo)劑后,誘導(dǎo)劑與負(fù)調(diào)控蛋白具有更強(qiáng)的結(jié)合作用,使其從操縱序列上脫離,繼而基因的正常轉(zhuǎn)錄被開啟[圖2(a)、(b)]。在啟動(dòng)子的正調(diào)控模式中,情況則恰好相反。調(diào)控蛋白對(duì)于目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄起正向的激活或促進(jìn)作用(因此有時(shí)也稱作activator)。只有當(dāng)誘導(dǎo)劑加入時(shí),誘導(dǎo)劑與調(diào)控蛋白結(jié)合后的復(fù)合物才能夠結(jié)合到操縱序列上,激活或促進(jìn)下游目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。

        圖2 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的負(fù)調(diào)控與正調(diào)控誘導(dǎo)機(jī)制以及大腸桿菌乳糖操縱子負(fù)調(diào)控的典型序列(a)無誘導(dǎo)劑條件下的基因調(diào)控;(b)誘導(dǎo)劑加入條件下的基因調(diào)控;(c) β-半乳糖苷酶(LacZ)啟動(dòng)子的乳糖操縱子負(fù)調(diào)控區(qū)域DNA序列。LacI—阻遏蛋白;lacO—操縱序列;SD序列—基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(也稱為RBS);Inducer—乳糖操縱子的lacI-lacO體系誘導(dǎo)劑,通常為異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)或乳糖(實(shí)際為1,6-別乳糖,乳糖的代謝物)Fig.2 Negative and positive regulation mechanism of inducible promoters and the partial sequence of lactose operon(lacO)of E.coli.(a,b)gene regulation mode under inducer-free or inducer-present condition,respectively.(c)partial DNA sequence of inducible promoter of β-galactosidase(LacZ)with negative regulation.LacI—inhibitor(repressor)protein;lacO—operator sequence for repressor binding;SD—Shine-Dalgarno sequence as ribosome biding site(RBS);Inducer—for lacI-lacO system,common inducer is isopropyl-β-Dthiogalactopyranoside(IPTG)or lactose(1,6-allolactose in fact,a metabolite of lactose),respectively

        除了上述的正調(diào)控機(jī)制和負(fù)調(diào)控機(jī)制分別單獨(dú)發(fā)揮作用的情況外,原核生物中也有許多誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的調(diào)控作用需要正調(diào)控與負(fù)調(diào)控因子共同作用完成。其中,有的調(diào)控機(jī)制只需要2個(gè)調(diào)控因子合作,而有的則需要多個(gè)正負(fù)調(diào)控因子一起協(xié)作完成。

        2 啟動(dòng)子改造的常用策略

        為了實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵目標(biāo)基因的優(yōu)化表達(dá),經(jīng)常需要對(duì)核心啟動(dòng)子進(jìn)行遺傳改造,以實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄水平的可控調(diào)節(jié)乃至表達(dá)強(qiáng)度的精細(xì)調(diào)控。一般采用如下兩種策略:一是對(duì)靶基因自身的內(nèi)源啟動(dòng)子進(jìn)行突變改造,或者將啟動(dòng)子與特定的轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合,從而改變啟動(dòng)子的強(qiáng)度[18];另一種方式則是將原有的啟動(dòng)子替換成其他啟動(dòng)子,從而徹底改變受控基因的表達(dá)譜,實(shí)現(xiàn)對(duì)關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的人工控制[19]。如圖3所示。

        圖3 啟動(dòng)子改造的常用有效策略?35和?10—啟動(dòng)子核心區(qū);+1—轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn);RBS—核糖體結(jié)合位點(diǎn);ATG—翻譯起始密碼子Fig.3 Common efficient strategies for promoter engineering?35 and ?10—core elements of promoter;+1—transcription initiation site;RBS—ribosome binding site;ATG—start codon of enzyme translation

        在啟動(dòng)子突變方面,常用方法包括隨機(jī)突變與定點(diǎn)突變。例如,可以通過易錯(cuò)PCR、定點(diǎn)飽和突變乃至創(chuàng)制合成等方式對(duì)啟動(dòng)子的UP 區(qū)或間隔區(qū)進(jìn)行隨機(jī)突變,創(chuàng)制不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子庫(kù),或者創(chuàng)制合成啟動(dòng)子庫(kù)(synthetic promoter libraries,SPL),用于代謝工程中多基因的差異表達(dá)調(diào)控;再結(jié)合高通量篩選方法獲得優(yōu)選的啟動(dòng)子[19-20]。隨機(jī)突變方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠得到不同性質(zhì)及強(qiáng)度存在梯度分布的啟動(dòng)子;其缺點(diǎn)則是工作量大,需要結(jié)合合適的高通量篩選方法才能實(shí)現(xiàn)。也可以將目標(biāo)啟動(dòng)子的核心?10 區(qū)、?35 區(qū)等關(guān)鍵區(qū)域序列向著σ因子識(shí)別一致序列的方向突變,從而顯著改變啟動(dòng)子的活性[14,21-22]。例如,Jiao等通過對(duì)枯草芽孢桿菌Pg2 啟動(dòng)子的核心?10 區(qū)、?35 區(qū)分別進(jìn)行面向σ因子識(shí)別保守序列的單點(diǎn)突變,突變啟動(dòng)子的強(qiáng)度提高了15 倍[21];在紅色紅球菌啟動(dòng)子的研究中,同樣獲得了類似的研究結(jié)果[14]。

        在啟動(dòng)子的替換策略中,可供選用的啟動(dòng)子既可以是自身或者一些種屬相近微生物中已被報(bào)道的或被廣泛使用的啟動(dòng)子(如大腸桿菌中普遍使用的Ptac強(qiáng)啟動(dòng)子以及枯草芽孢桿菌中常用的P43 啟動(dòng)子等);也可以通過報(bào)告基因表達(dá)的方式對(duì)一組候選啟動(dòng)子的強(qiáng)度進(jìn)行對(duì)比分析,從而得到可以使用的優(yōu)選啟動(dòng)子[23-24];還可以選用一些噬菌體啟動(dòng)子、人工構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子等外源啟動(dòng)子。其中,優(yōu)選的噬菌體啟動(dòng)子,例如來自T7 噬菌體的T7啟動(dòng)子、來源于噬菌體SPO-1的Pspac啟動(dòng)子[25],往往具有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄特性。2013 年,Yang等[26]進(jìn)一步從B.licheniformis基因組中篩選獲得了PluxS 啟動(dòng)子,活性是P43 啟動(dòng)子的8 倍。將PluxS 與枯草芽孢桿菌Papr的?10 區(qū)結(jié)合,構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子PlapS,具有更高的轉(zhuǎn)錄活性。尤其是這些外源啟動(dòng)子不僅可以提高目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度,還可以利用大腸桿菌負(fù)調(diào)控蛋白-操縱子序列(LacI-lacO)等的引入,成功實(shí)現(xiàn)人工強(qiáng)啟動(dòng)子從組成型到誘導(dǎo)型的轉(zhuǎn)變。例如,LacI-T7 系統(tǒng)誘導(dǎo)型雜合啟動(dòng)子插入枯草芽孢桿菌基因組,能夠?qū)崿F(xiàn)高達(dá)10 000 倍的啟動(dòng)強(qiáng)度動(dòng)態(tài)調(diào)控范圍[27]。將紅球菌Rhodococcus rhodochrousJ1中的腈水解酶誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與NitR正調(diào)控蛋白組合成PnitA-NitR雜合元件,成功構(gòu)建了鏈霉菌高效表達(dá)啟動(dòng)子——以ε-己內(nèi)酰胺為誘導(dǎo)劑,鏈霉菌蛋白表達(dá)量可以達(dá)到可溶蛋白的40%[28]。啟動(dòng)子替換改造的優(yōu)勢(shì)在于針對(duì)性強(qiáng),有時(shí)可以大大減少篩選工作量。但另一方面,可供選用的啟動(dòng)子仍然非常有限,遠(yuǎn)不能滿足快速發(fā)展的合成生物學(xué)研究的需求。

        此外,啟動(dòng)子改造研究也經(jīng)常與核糖體結(jié)合位點(diǎn)RBS的序列優(yōu)化相結(jié)合。例如,通過3條枯草芽孢桿菌內(nèi)源組成型強(qiáng)啟動(dòng)子序列與3條優(yōu)選RBS序列的隨機(jī)突變庫(kù),研究人員篩選獲得了基因表達(dá)水平達(dá)到約14 000 倍動(dòng)態(tài)調(diào)控區(qū)間的基因工具箱[29]?;诋愒处?0依賴的啟動(dòng)子可以被鏈霉菌的“看家”σhrdB因子有效識(shí)別,Zhao等[30]將大腸桿菌啟動(dòng)子Ptac的核心區(qū)與變青鏈霉菌啟動(dòng)子PkasO*R15 的5′-非翻譯區(qū)(5′-UTRs)融合,獲得了改造啟動(dòng)子Ptac*,其在鏈霉菌S.lividansTK24中的啟動(dòng)強(qiáng)度達(dá)到Ptac的8.1 倍,以及PkasO*R15的1.7倍。進(jìn)一步耦合RBS優(yōu)化,優(yōu)選啟動(dòng)子-RBS組合Ptac*RBS3對(duì)報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度達(dá)到Ptac啟動(dòng)子的17.6倍。

        近年來,隨著合成生物學(xué)的興起以及組學(xué)分析、高通量篩選、人工智能等新興技術(shù)的快速發(fā)展,啟動(dòng)子改造的新思路和新方法也不斷涌現(xiàn)。Li 等[31]及Shen 等[32]發(fā)現(xiàn),針對(duì)啟動(dòng)子核心區(qū)的間隔序列進(jìn)行隨機(jī)突變或飽和突變,可以獲得具有310倍轉(zhuǎn)錄活性差異的啟動(dòng)子庫(kù),從而獲得優(yōu)選強(qiáng)啟動(dòng)子并顯著提高目標(biāo)產(chǎn)物PHB以及P(3HB-co-4HB)的產(chǎn)量。類似地,啟動(dòng)子上游序列突變對(duì)合成啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度的影響也不容忽視[33]。而針對(duì)鏈霉菌啟動(dòng)子調(diào)控序列進(jìn)行隨機(jī)突變構(gòu)建不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子庫(kù),也成功篩選獲得了一系列強(qiáng)、中、弱轉(zhuǎn)錄活性的鏈霉菌啟動(dòng)子[34]。進(jìn)一步地,除了啟動(dòng)子核心區(qū)序列、上游序列及間隔序列以外,研究人員還發(fā)現(xiàn),位于SD 序列上游的5′-UTR序列結(jié)構(gòu)對(duì)于轉(zhuǎn)錄及翻譯效率也具有顯著影響;研究表明,相對(duì)于PBAD啟動(dòng)子,大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)104 個(gè)天然5′-UTR 序列的啟動(dòng)子強(qiáng)度在轉(zhuǎn)錄水平上從0.007%到4630%之間變化,而在翻譯水平上則從0.1%到137%之間變化[35]。此外,基于單個(gè)啟動(dòng)子改造研究的突破,串聯(lián)的雙啟動(dòng)子組合策略也受到重視。研究發(fā)現(xiàn),兩個(gè)啟動(dòng)子之間的間隔序列長(zhǎng)度對(duì)組合啟動(dòng)子活性的影響很大,其中80 bp 是優(yōu)選長(zhǎng)度[36]。最后,利用組學(xué)數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)工具進(jìn)行啟動(dòng)子序列識(shí)別與改造[37]、強(qiáng)度預(yù)測(cè)與RBS 序列優(yōu)選[38]并指導(dǎo)新啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)、高強(qiáng)度新組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子改造以及目標(biāo)基因的高效表達(dá)等研究策略,已經(jīng)成為今后在合成生物學(xué)等生物技術(shù)領(lǐng)域開展啟動(dòng)子研究的必要工具。

        3 不同類型誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的研究進(jìn)展

        鑒于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在合成生物學(xué)、代謝工程和工業(yè)生物發(fā)酵中的重要地位,針對(duì)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的專門研究越來越多,啟動(dòng)子元件在生物技術(shù)研究與生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用前景非常廣闊。研究人員不僅關(guān)注經(jīng)典強(qiáng)啟動(dòng)子的進(jìn)一步改造和新用途,比如,T7 轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)與T7 噬菌體啟動(dòng)子在邏輯門與基因線路中的應(yīng)用[39],還關(guān)注各種新型誘導(dǎo)劑的發(fā)現(xiàn)(化學(xué)分子)以及新誘導(dǎo)方式的開發(fā)(物理信號(hào)),以滿足日益增長(zhǎng)的工程生物學(xué)研究的迫切需要。

        迄今為止,從不同微生物來源的菌株中,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量的新類型誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,受不同化學(xué)誘導(dǎo)劑分子或物理誘導(dǎo)信號(hào)的調(diào)控,對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行不同強(qiáng)度的表達(dá)。相關(guān)研究進(jìn)展總結(jié)見表2。

        由表2可見,化學(xué)誘導(dǎo)劑的種類目前已經(jīng)增加到了幾十種。但在工業(yè)生產(chǎn)中真正實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用的,還比較少??傮w而言,IPTG 類誘導(dǎo)劑仍然最為高效、嚴(yán)謹(jǐn)且應(yīng)用最為廣泛。但I(xiàn)PTG 的高成本問題已經(jīng)稱為制約其進(jìn)一步推廣的核心因素。有鑒于此,研究者們致力于開發(fā)全新的,兼具高效、嚴(yán)謹(jǐn)且低成本優(yōu)勢(shì)的新型誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,目前已經(jīng)取得較好進(jìn)展。例如,對(duì)異丙苯甲酸酯誘導(dǎo)啟動(dòng)子、ε-己內(nèi)酰胺誘導(dǎo)啟動(dòng)子等。本文作者課題組正在致力于解析紅色紅球菌中獨(dú)特的尿素誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子的誘導(dǎo)機(jī)理,一旦獲得成功,有望推廣到其他宿主菌株中獲得普適性應(yīng)用。而營(yíng)養(yǎng)源饑餓誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如氮饑餓、磷酸鹽饑餓)、低溶氧誘導(dǎo)啟動(dòng)子等,也具有工業(yè)化的應(yīng)用潛力與優(yōu)勢(shì)。

        表2 近年來報(bào)道的一些不同微生物來源、不同類型的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Tab.2 Some inducible promoters reported recently from different microorganisms with diverse mechanisms

        物理信號(hào)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子也吸引了大量研究者的關(guān)注。比如,溫度誘導(dǎo)啟動(dòng)子、光誘導(dǎo)啟動(dòng)子等。其中,微生物溫度誘導(dǎo)啟動(dòng)子主要分為高溫(熱)誘導(dǎo)和低溫(冷)誘導(dǎo)兩類,其溫敏開關(guān)涵蓋了DNA 型、RNA 型以及蛋白質(zhì)型[69-72]。而光誘導(dǎo)啟動(dòng)子則分為白光、藍(lán)光、黑暗誘導(dǎo)等多種類型,其調(diào)控蛋白等調(diào)控因子也各有不同[73-75]。盡管這些啟動(dòng)子在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的研究中已經(jīng)取得了很多令人振奮的突破,但放大到大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)水平,變溫操作的能耗問題以及光誘導(dǎo)信號(hào)的液面下衰減問題仍然困擾著產(chǎn)業(yè)界和學(xué)術(shù)界。可以預(yù)期,新型分子生物技術(shù)與新型生物裝備的結(jié)合,有望解決上述問題。

        4 組成型啟動(dòng)子的研究進(jìn)展

        相比于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子,組成型啟動(dòng)子不涉及操縱序列、阻遏蛋白、激活蛋白等轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件,因此其工作機(jī)制相對(duì)簡(jiǎn)單,但其在合成生物學(xué)、代謝工程等領(lǐng)域高性能細(xì)胞工廠以及細(xì)胞催化劑的構(gòu)建研究中同樣具有舉足輕重的作用。就方法學(xué)而言,組成型啟動(dòng)子的改造策略已經(jīng)在前文中充分討論,在此就不再贅述。

        目前,針對(duì)組成型啟動(dòng)子的研究熱點(diǎn),大致可分為兩類,均是基于目前快速突破的基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組等組學(xué)測(cè)序技術(shù)以及基于計(jì)算機(jī)輔助的生物信息學(xué)與人工智能技術(shù):一方面是面向基因編輯工具比較匱乏、基因改造相對(duì)困難的各種非模式重要工業(yè)微生物或特殊微生物,開展不同強(qiáng)度新啟動(dòng)子、不同表達(dá)時(shí)序新啟動(dòng)子的

        識(shí)別發(fā)現(xiàn)及改造研究,乃至不同微生物中RNA 聚合酶σ 因子(或其他重要轉(zhuǎn)錄元件)的種類、功能、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律及其改造方法與應(yīng)用等研究;另一方面則是面向基因背景清晰、基因編輯工具相對(duì)成熟的模式微生物(如大腸桿菌、酵母菌),基于生物信息學(xué)及人工智能工具,進(jìn)行啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu)基本規(guī)律解析、人工預(yù)測(cè)與設(shè)計(jì)、人工合成乃至人工智能從頭設(shè)計(jì)等研究[14,31,76-82]。

        例如,Jiao 等[14]針對(duì)在生物催化工業(yè)中具有重要應(yīng)用的非模式微生物紅色紅球菌,通過不同生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析,獲得了其生長(zhǎng)期高表達(dá)基因的啟動(dòng)子序列特征,發(fā)現(xiàn)了其σA識(shí)別啟動(dòng)子的保守序列。Li 等[31]則針對(duì)嗜鹽菌開展了組成型啟動(dòng)子庫(kù)的研究——從高表達(dá)的孔蛋白啟動(dòng)子出發(fā),針對(duì)其核心區(qū)間隔序列突變,獲得了梯級(jí)強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子庫(kù),以滿足細(xì)胞工廠中大量基因的不同表達(dá)強(qiáng)度需要。Trisrivirat 等[78]采用類似的策略構(gòu)建組成型啟動(dòng)子庫(kù),實(shí)現(xiàn)了生物丙烷產(chǎn)量的提高。Sun 等[79]通過采用生物信息學(xué)工具進(jìn)行RBS 設(shè)計(jì)與篩選,并耦合啟動(dòng)子序列改造,獲得了分枝桿菌的高表達(dá)元件,同時(shí)實(shí)現(xiàn)了甾醇產(chǎn)量的顯著提升。Liu等[80]通過對(duì)酵母菌中TATA-盒與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間序列的隨機(jī)突變與篩選,獲得了兩個(gè)新的強(qiáng)啟動(dòng)子并提高了β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。Zhang 等[81]基于統(tǒng)計(jì)模型預(yù)測(cè),重構(gòu)了谷氨酸棒桿菌的人工合成啟動(dòng)子庫(kù),獲得了優(yōu)選的串聯(lián)啟動(dòng)子P70,其強(qiáng)度高達(dá)tac啟動(dòng)子的1.21 倍。針對(duì)大腸桿菌啟動(dòng)子,Wang等[82]基于機(jī)器學(xué)習(xí)算法,實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌啟動(dòng)子的AI 從頭設(shè)計(jì)。人工智能、生物信息學(xué)與啟動(dòng)子領(lǐng)域的交叉研究,已經(jīng)成為啟動(dòng)子工程的新前沿之一。

        5 啟動(dòng)子工程的新前沿

        隨著合成生物學(xué)與人工智能工具的快速發(fā)展,越來越多的開創(chuàng)性研究在啟動(dòng)子工程領(lǐng)域涌現(xiàn)。具有動(dòng)態(tài)代謝調(diào)控功能的特殊啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)與改造、新性能啟動(dòng)子元件的人工智能設(shè)計(jì)與進(jìn)化等研究是啟動(dòng)子工程領(lǐng)域的代表性新前沿。

        首先,微生物的胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜,各種代謝物以及功能酶的濃度會(huì)隨著時(shí)間進(jìn)行動(dòng)態(tài)改變,采用常規(guī)的靜態(tài)代謝工程策略,如基因的過表達(dá)(上調(diào))、敲除或弱化表達(dá)(下調(diào))進(jìn)行代謝流調(diào)控,即使在優(yōu)化調(diào)控條件下,也可能造成菌體在某個(gè)時(shí)間段發(fā)生代謝失衡,或者有毒中間代謝產(chǎn)物的積累,不利于菌體生長(zhǎng)和目標(biāo)產(chǎn)物合成,從而導(dǎo)致產(chǎn)物的產(chǎn)量和得率并不理想。動(dòng)態(tài)代謝調(diào)控(dynamic regulation)的概念近年來應(yīng)運(yùn)而生,其核心思想是讓菌體細(xì)胞能夠感應(yīng)到時(shí)時(shí)變化的環(huán)境狀況或自身的胞內(nèi)信號(hào),并對(duì)其做出響應(yīng),調(diào)控相關(guān)代謝反應(yīng)以實(shí)現(xiàn)代謝途徑的動(dòng)態(tài)平衡,進(jìn)而達(dá)到目標(biāo)產(chǎn)物合成的高產(chǎn)量、高底物轉(zhuǎn)化率的統(tǒng)一。動(dòng)態(tài)代謝調(diào)控元件的開發(fā)是實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)代謝調(diào)控模式的關(guān)鍵,它們一方面具有生物傳感器的功能,另一方面也具有執(zhí)行代謝調(diào)控的功能。在目前已經(jīng)報(bào)道的多種元件中,特殊的新模式誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與群體感應(yīng)信號(hào)系統(tǒng)、核糖開關(guān)等元件一樣,都是研究人員關(guān)注的重點(diǎn)。例如,?ztürk 等[83]闡述了雙啟動(dòng)表達(dá)策略的基本原則,以滿足未來動(dòng)態(tài)代謝工程領(lǐng)域的需求。Landberg 等[84]開發(fā)了一種基因組整合型trp?T7 表達(dá)系統(tǒng),可以實(shí)現(xiàn)依賴于色氨酸或酵母提取物濃度的自誘導(dǎo),嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá);用該系統(tǒng)生產(chǎn)L-絲氨酸,補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)的絲氨酸產(chǎn)量達(dá)到26 g/L。Moreb 等[85]開發(fā)了基于E.coliPhoB 調(diào)控的磷酸鹽饑餓誘導(dǎo)啟動(dòng)子,能夠在營(yíng)養(yǎng)豐富培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基中均實(shí)現(xiàn)外源蛋白的自誘導(dǎo)嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控,使得外源蛋白在磷酸鹽耗盡時(shí)自行啟動(dòng)高表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成解耦的兩階段自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)模式。類似地,Ikegaya 等[86]也報(bào)道了來源于紅串紅球菌R.erythropolisN9T-4 的營(yíng)養(yǎng)匱乏誘導(dǎo)型調(diào)控因子。Liang 等[87]則開發(fā)了基于產(chǎn)物香草醛以及底物阿魏酸濃度的動(dòng)態(tài)代謝調(diào)控回路,實(shí)現(xiàn)了香草醛的高產(chǎn)。

        其次,人工智能工具已經(jīng)在越來越多的領(lǐng)域顯示出了強(qiáng)大的功能。在啟動(dòng)子工程方面,利用機(jī)器學(xué)習(xí)新方法進(jìn)行人工啟動(dòng)子設(shè)計(jì)、創(chuàng)制與優(yōu)化的研究現(xiàn)已蓬勃興起,并取得了突破性的成果。例如,如前所述,Wang 等[82]發(fā)表了基于機(jī)器學(xué)習(xí)的大腸桿菌啟動(dòng)子的AI 從頭設(shè)計(jì)框架與活性預(yù)測(cè)模型,結(jié)果表明,經(jīng)過兩輪優(yōu)化,70.8%的AI 設(shè)計(jì)人工啟動(dòng)子都可以被證明有效,且其序列與大腸桿菌原基因組序列的相似性很低,說明人類已經(jīng)可以基于機(jī)器學(xué)習(xí),創(chuàng)造出有效且可能更高效的啟動(dòng)子新序列。類似的,van Brempt 等[88]則通過卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的機(jī)器學(xué)習(xí)方法,獲得了啟動(dòng)子序列與功能之間的構(gòu)效關(guān)系信息,成功預(yù)測(cè)了大腸桿菌σ70啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始速率、17 nt 的啟動(dòng)子間隔區(qū)序列,以及枯草芽孢桿菌3 種不同σ 因子特異性的啟動(dòng)子序列。Zhao 等[89]通過機(jī)器學(xué)習(xí)方法,構(gòu)建了包含3665 個(gè)不同序列的人工啟動(dòng)子庫(kù),其強(qiáng)度變化范圍達(dá)到兩個(gè)數(shù)量級(jí),且最強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性達(dá)到1 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)的T7 啟動(dòng)子的1.52 倍以上。這些研究工作,將成為人工智能工具在啟動(dòng)子工程領(lǐng)域深度并全面應(yīng)用的開端。

        6 展 望

        隨著我國(guó)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的加速推進(jìn)及二氧化碳減排的迫切需求,綠色生物制造產(chǎn)業(yè)正在全面拓展與提升,合成生物學(xué)以及面向產(chǎn)業(yè)化的工程生物學(xué),已經(jīng)被認(rèn)為是本世紀(jì)最重要的生物技術(shù)平臺(tái)[1-2,90]。

        在微生物中,轉(zhuǎn)錄調(diào)控是實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因按需表達(dá)的最基礎(chǔ)、最重要因素之一[76],啟動(dòng)子則是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的核心元件[91-92]。基于啟動(dòng)子的基因高效及精準(zhǔn)表達(dá)調(diào)控在合成生物學(xué)中具有舉足輕重的地位[93-94]。伴隨著合成生物學(xué)新技術(shù)、高通量生物檢測(cè)新裝備、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)、生物信息學(xué)乃至人工智能等交叉研究領(lǐng)域的協(xié)同發(fā)展,啟動(dòng)子工程已經(jīng)取得了令人矚目的進(jìn)展和突破,但同時(shí)大量具有挑戰(zhàn)性的科學(xué)問題目前還仍然存在。例如,單一啟動(dòng)子經(jīng)常發(fā)生的基因泄露表達(dá)及干擾問題,尚缺少根本性的解決方案;大量組成型與誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的強(qiáng)度響應(yīng)范圍仍然不能滿足合成生物學(xué)研究與產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需要;眾多有價(jià)值的非模式微生物菌株的基本轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件、工作原理與調(diào)控規(guī)律還不十分清楚(比如其看家σ因子的啟動(dòng)子識(shí)別保守序列、調(diào)控生長(zhǎng)穩(wěn)定期基因表達(dá)及各種環(huán)境響應(yīng)性基因表達(dá)的新σ因子及其保守序列、新型正負(fù)調(diào)控蛋白等);響應(yīng)更多化學(xué)分子與物理信號(hào)的新誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)、誘導(dǎo)機(jī)制解析與改造應(yīng)用還具有非常廣闊的研究空間;從產(chǎn)業(yè)角度,具有安全、高效、低成本特征的新型誘導(dǎo)劑的開發(fā)及其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用仍然非常有限。此外,在不同微生物種屬之間具有廣譜通用性的啟動(dòng)子還不多見;多啟動(dòng)子串聯(lián)協(xié)同強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄的研究還剛剛起步;啟動(dòng)子與反義RNA、核糖開關(guān)、群體感應(yīng)信號(hào)等元件協(xié)同實(shí)現(xiàn)代謝途徑重構(gòu)優(yōu)化、基因線路設(shè)計(jì)構(gòu)建、新型生物傳感器設(shè)計(jì)開發(fā)、人工多細(xì)胞體系以及無細(xì)胞體系高效合成目標(biāo)化學(xué)品等研究方興未艾;人工智能從頭設(shè)計(jì)啟動(dòng)子的開創(chuàng)性研究還受限于菌種基因背景清晰度、基因編輯工具可用性、高效性以及新算法的性能與精度以及軟件開發(fā)等問題??傊瑔?dòng)子元件的科學(xué)基礎(chǔ)與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的深入研究、其改造方法與手段的全新突破、各種新型誘導(dǎo)劑分子與誘導(dǎo)模式的創(chuàng)制及產(chǎn)業(yè)化復(fù)雜環(huán)境下的高效且低成本應(yīng)用乃至其調(diào)控動(dòng)態(tài)化、設(shè)計(jì)智能化以及創(chuàng)造性從頭設(shè)計(jì)的新發(fā)展,都將是今后一段時(shí)間內(nèi)微生物啟動(dòng)子工程領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容[82,88-89,94-100]。

        隨著合成生物學(xué)的研究對(duì)象逐漸從基因元件與模塊走向全細(xì)胞復(fù)雜代謝線路從頭設(shè)計(jì)乃至生物新功能從頭創(chuàng)制,可以預(yù)見,在如下合成生物學(xué)領(lǐng)域,微生物啟動(dòng)子工程都將發(fā)揮越來越重要的作用,包括:新酶的高表達(dá)與高效制備;全細(xì)胞生物催化;基因線路設(shè)計(jì)、動(dòng)態(tài)代謝調(diào)控以及高性能細(xì)胞工廠創(chuàng)建與優(yōu)化;高靈敏度生物檢測(cè)及多功能無細(xì)胞合成體系開發(fā);高效、穩(wěn)定的人工多細(xì)胞體系創(chuàng)制及復(fù)雜環(huán)境應(yīng)用以及各種新興交叉領(lǐng)域,如生物-金屬?gòu)?fù)合催化、生物新材料、生物系統(tǒng)自動(dòng)控制、生物信息學(xué)與AI新工具等等。

        綜上所述,啟動(dòng)子工程,尤其是微生物啟動(dòng)子工程,將驅(qū)動(dòng)合成生物學(xué)研究與綠色生物制造技術(shù)的持續(xù)快速發(fā)展,從而為我國(guó)綠色化工、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥與大健康、食品及能源等領(lǐng)域的發(fā)展做出不可替代的重要貢獻(xiàn)。

        致謝:謹(jǐn)以此文致敬Daniel I.C.Wang 教授在基因工程及生化工程等領(lǐng)域的開創(chuàng)性貢獻(xiàn)。

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