王小蕊 董非斐 何碧凝 黎克行

(三亞市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，海南 三亞 572000)

甲狀腺癌是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤，乳頭狀甲狀腺癌(PTC)是甲狀腺癌最常見(jiàn)的病理類型，約占所有甲狀腺癌的80%〔1〕。近年來(lái)，隨著甲狀腺癌綜合治療技術(shù)的不斷提高，大多數(shù)PTC患者預(yù)后良好，但局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者經(jīng)臨床治療后預(yù)后效果較差〔2〕。因此，探索甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋求新的靶向治療位點(diǎn)，對(duì)改善甲狀腺癌患者的預(yù)后、提高其生存率具有重要意義。IQ結(jié)構(gòu)域GTP酶激活蛋白(IQGAP)1是一種進(jìn)化保守的多域支架蛋白，可參與調(diào)控細(xì)胞附著、細(xì)胞遷移、細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞分裂等多種細(xì)胞過(guò)程〔3〕。有報(bào)道〔4〕稱IQGAP1在PTC中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)IQGAP1表達(dá)可明顯抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖能力、遷移和侵襲。miRNA是多種細(xì)胞過(guò)程的重要調(diào)控因子，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，異常表達(dá)的miRNA參與癌癥的發(fā)生發(fā)展。有研究〔5〕表明，miR-506-3p在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-506-3p可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。但尚無(wú)miR-506-3p在甲狀腺癌中的相關(guān)研究，且miR-506-3p是否通過(guò)調(diào)控IQGAP1表達(dá)影響甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲目前尚不可知。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討miR-506-3p靶向IQGAPl表達(dá)對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料和方法

1.1材料與主要試劑、儀器 甲狀腺癌細(xì)胞SW579、FTC-133、KAT-18和正常甲狀腺上皮細(xì)胞TEC購(gòu)于美國(guó)ATCC。胎牛血清(FBS)和RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol抽提試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；PCR引物、miR-506-3p模擬物，miR-NC、si-IQGAP1載體、si-NC、WT-IQGAP1及MUT-IQGAP1由北京華大基因公司構(gòu)建和測(cè)序；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Promega公司；細(xì)胞組織快速裂解液(RIPA)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Western洗滌液及吐溫-20購(gòu)于上海碧云天公司；兔抗IQGAPl、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、P21、P27、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和MMP-14抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；抗兔二抗購(gòu)于武漢博士德公司。噻唑藍(lán)(MTT)試劑、Transwell小室和酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nicon公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 選取甲狀腺癌細(xì)胞株SW579、FTC-133、KAT-18和甲狀腺上皮細(xì)胞TEC，在37℃，濕度飽和，CO2體積分?jǐn)?shù)5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含10% FBS RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW579細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔板上，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí)，按照LipofectamineTM2000說(shuō)明書(shū)將miR-506-3p、miR-NC、si-IQGAP1、si-NC、pcDNA-IQGAP1和pcDNA轉(zhuǎn)染SW579細(xì)胞。細(xì)胞分組為miR-506-3p組(轉(zhuǎn)染miR-506-3p mimics)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、si-IQGAP1組(轉(zhuǎn)染si-IQGAP1)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、miR-506-3p+pcDNA組(轉(zhuǎn)染miR-506-3p和pcDNA)和miR-506-3p+pcDNA-IQGAP1組(轉(zhuǎn)染miR-506-3p和pcDNA-IQGAP1)。

1.3qRT-PCR檢測(cè) 按照Trizol說(shuō)明書(shū)分別提取甲狀腺癌細(xì)胞株SW579、FTC-133、KAT-18和甲狀腺上皮細(xì)胞TEC及各組SW579細(xì)胞的總RNA，檢測(cè)其濃度和純度后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNAs，隨后進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。引物序列如下：miR-506-3p正義：5′-ACACTCATAAGGCACCCTTC-3′；反義：5′-TCTACTCAGAAGGGGAGTAC-3′。U6正義：5′-CTCGCTTCGGCAGCAC-A-3′；反義：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。IQGAP1-正義：5′-AGAACGTGGCTTATGAGTACCT-3′；反義：5′-CCAGTCGCCTTGTATCTGGT-3′。GAPDH正義：5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′；反義：5′-CGCUUCACGAAUUUGCGUGUCAU-3′。miR-506-3p和IQGAP1 mRNA的檢測(cè)分別以U6和GAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct法測(cè)定miR-506-3p和IQGAP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SW579細(xì)胞，按照1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，獲得各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞。分別于培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，每孔加入20 μl的MTT溶液室溫反應(yīng)4 h后，吸去孔內(nèi)上清液，每孔再加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，緩慢搖動(dòng)5 min至完全溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)各孔的OD值(以空白孔進(jìn)行調(diào)零)。

1.5Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲和侵襲 取轉(zhuǎn)染48 h的各組SW579細(xì)胞，胰酶消化后離心吸去上清，用無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，于上室中加入200 μl細(xì)胞懸液，下室加入500 μl含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，將Transwell小室放置于37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，擦去上室膜上未遷移的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定下室膜10 min。自然晾干后，0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色5 min。棄染液，雙蒸水洗2次。取出后于倒置顯微鏡(40×)下觀察拍照，統(tǒng)計(jì)上、下、左、右、中5個(gè)不同視野的總細(xì)胞數(shù)取平均值。

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：將基質(zhì)膠和RPMI1640培養(yǎng)基按1∶8稀釋后(60 μl)鋪于培養(yǎng)小室上，風(fēng)干后備用，其他步驟同Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)。

1.6雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 利用靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)Targetscan網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/vert/)預(yù)測(cè)miR-506-3p的靶基因。發(fā)現(xiàn)miR-506-3p的5′端可與IQGAP1的3′-UTR特異性結(jié)合，猜測(cè)IQGAP1是miR-506-3p的靶基因。為驗(yàn)證這一猜想，構(gòu)建野生型WT-IQGAP1和突變型MUT-IQGAP1的IQGAP1 3′-UTR熒光素酶報(bào)告載體。利用LipofectamineTM2000將miR-506-3p和miR-NC分別與WT-IQGAP1和MUT-IQGAP1共轉(zhuǎn)染SW579細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒光素酶活性。

1.7Western印跡檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染48 h的各組SW579細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞總蛋白，并用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，用洗滌液洗膜2 min后加入吐溫-20室溫封閉2 h，吸盡封閉液后，在4℃下加入抗IQGAP1、GAPDH、CyclinD1、P21、P27、MMP-2、MMP-9和MMP-14一抗(1∶500)孵育過(guò)夜，用洗滌液洗膜3次后，在室溫下用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶500)孵育膜2 h，洗膜3次后于暗室加入顯色液進(jìn)行顯色并拍照，用Image Quant軟件分析目的條帶灰度值。以GAPDH作為內(nèi)參。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-506-3p和IQGAP1在甲狀腺癌細(xì)胞和正常甲狀腺上皮細(xì)胞中的表達(dá) 與正常甲狀腺上皮細(xì)胞TEC比較，甲狀腺癌細(xì)胞SW579、FTC-133和KAT-18中miR-506-3p的表達(dá)均顯著降低，IQGAP1 mRNA和IQGAP1蛋白的表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1，表1。

表1 miR-506-3p和IQGAP1在甲狀腺癌細(xì)胞和正常甲狀腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)

圖1 IQGAP1蛋白表達(dá)

2.2miR-506-3p過(guò)表達(dá)對(duì)甲狀腺癌SW579細(xì)胞增殖的影響 與miR-NC組比較，miR-506-3p組甲狀腺癌SW579細(xì)胞中miR-506-3p的表達(dá)顯著升高(P<0.001)，表明成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)miR-506-3p的SW579細(xì)胞株。與miR-NC組比較，miR-506-3p組甲狀腺癌SW579細(xì)胞在24 h的增殖活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h的增殖活力顯著減弱，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CyclinD1的表達(dá)顯著降低，P21和p27蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.001)。表明過(guò)表達(dá)miR-506-3p可抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖。見(jiàn)圖2，表2。

圖2 增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 miR-506-3p過(guò)表達(dá)對(duì)甲狀腺癌SW579細(xì)胞增殖的影響

2.3miR-506-3p過(guò)表達(dá)對(duì)甲狀腺癌SW579細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-506-3p組甲狀腺癌SW579細(xì)胞中遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少，侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9和MMP-14的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。表明過(guò)表達(dá)miR-506-3p可抑制甲狀腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。見(jiàn)圖3、表3。

圖3 遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)miR-506-3p過(guò)表達(dá)對(duì)甲狀腺癌SW579細(xì)胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫，×200)

表3 miR-506-3p過(guò)表達(dá)對(duì)甲狀腺癌SW579細(xì)胞遷移、侵襲的影響

2.4抑制IQGAP1表達(dá)對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 si-IQGAP1組甲狀腺癌細(xì)胞SW579中IQGAP1蛋白的表達(dá)較si-NC組顯著降低(P<0.05)，表明成功構(gòu)建了IQGAP1抑制表達(dá)的甲狀腺癌SW579細(xì)胞株。與si-NC組比較，si-IQGAP1組甲狀腺癌SW579細(xì)胞在24 h、48 h和72 h的增殖活力顯著減弱，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CyclinD1和侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達(dá)顯著降低，P21蛋白的表達(dá)顯著升高(均P<0.05)。表明抑制IQGAP1表達(dá)可抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。見(jiàn)表4，圖4。

表4 抑制IQGAP1表達(dá)對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖4 IQGAP1和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5miR-506-3p靶向調(diào)控IQGAP1的表達(dá) miR-506-3p與IQGAP1-3′UTR之間存在特異性結(jié)合位點(diǎn)。野生型IQGAP1基因表達(dá)載體WT-IQGAP1和miR-506-3p mimics共轉(zhuǎn)染甲狀腺癌細(xì)胞SW579后，miR-506-3p組SW579細(xì)胞熒光素酶活性(0.42±0.04)與再轉(zhuǎn)染miR-NC組(1.03±0.09)顯著降低(P<0.05)；而突變型IQGAP1基因表達(dá)載體MUT-IQGAP1和miR-506-3p mimics共轉(zhuǎn)染甲狀腺癌細(xì)胞SW579后，miR-506-3p組SW579細(xì)胞熒光素酶活性(1.04±0.09)與再轉(zhuǎn)染miR-NC組(1.05±0.08)差異不顯著(P>0.05)。與miR-NC組(0.63±0.06)比較，miR-506-3p組SW579細(xì)胞IQGAP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.24±0.03)顯著減低；與anti-miR-NC組(0.61±0.06)比較，anti-miR-506-3p組SW579細(xì)胞IQGAP1蛋白的相對(duì)表達(dá)量(0.96±0.08)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖5。表明在SW579細(xì)胞中，IQGAP1是miR-506-3p的靶基因，miR-506-3p可負(fù)性調(diào)控IQGAP1的表達(dá)。

1～4：miR-NC組，miR-506-3p組，anti-miR-NC組，anti-miR-506-3p組圖5 miR-506-3p靶向調(diào)控IQGAP1的表達(dá)

2.6IQGAP1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-506-3p過(guò)表達(dá)對(duì)SW579細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用 與miR-NC組比較，miR-506-3p組SW579細(xì)胞IQGAP1蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，在24 h的增殖活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h的增殖活力顯著減弱，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CyclinD1和侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達(dá)顯著降低，P21蛋白的表達(dá)顯著升高(均P<0.05)；與miR-506-3p+pcDNA組比較，miR-506-3p+pcDNA-IQGAP1組SW579細(xì)胞IQGAP1蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，在24 h的增殖活力變化不明顯(P>0.05)，在48 h和72 h的增殖活力顯著增強(qiáng)，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著增加，細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CyclinD1和侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達(dá)顯著升高，P21蛋白的表達(dá)顯著降低(均P<0.05)。表明過(guò)表達(dá)IQGAP1可逆轉(zhuǎn)miR-506-3p過(guò)表達(dá)對(duì)SW579細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。見(jiàn)圖6、表5。

1～4：miR-NC組，miR-506-3p組，miR-506-3p+pcDNA組，miR-506-3p+pcDNA-IQGAP1組圖6 IQGAP1和增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 IQGAP1過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-506-3p過(guò)表達(dá)對(duì)SW579細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用

3 討 論

人類IQGAP蛋白家族包括IQGAP1、IQGAP2和IQGAP3 3個(gè)成員，其中IQGAP1已被證實(shí)廣泛存在于人體組織中。作為支架蛋白，IQGAP1通過(guò)與各種效應(yīng)因子或調(diào)節(jié)因子結(jié)合，在調(diào)控細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和細(xì)胞黏附方面發(fā)揮重要作用〔6〕。研究顯示〔7～9〕，IQGAP1在肺癌、乳腺癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌等多種癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，與癌癥的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。如IQGAP1在胰腺癌中明顯上調(diào)，下調(diào)IQGAP1表達(dá)，可抑制胰腺細(xì)胞SW1990的增殖和轉(zhuǎn)移，并抑制腫瘤的形成〔10〕。miR-506是靈長(zhǎng)類動(dòng)物睪丸X染色體連鎖miRNA簇成員之一〔11〕，研究表明〔12〕，miR-506在不同類型的癌癥中發(fā)揮不同的作用。如miR-506在黑色素瘤中起癌基因作用，過(guò)表達(dá)miR-506可促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和遷移。然而，過(guò)表達(dá)miR-506-3p抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔13〕；過(guò)表達(dá)miR-506-3p也可抑制鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移〔14〕。

本研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了Su等〔15〕甲狀腺癌細(xì)胞中IQGAP1高表達(dá)的結(jié)論。提示在甲狀腺癌中，上調(diào)miR-506-3p或下調(diào)IQGAP1可能通過(guò)抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9和MMP-14蛋白表達(dá)，促進(jìn)P21和P27蛋白表達(dá)抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。這與Liu等〔16〕敲除IQGAP1基因可抑制甲狀腺癌細(xì)胞侵襲的結(jié)論一致。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和Western印跡檢測(cè)證實(shí)，IQGAP1是miR-506-3p的靶基因，miR-506-3p可負(fù)向調(diào)控IQGAP1的表達(dá)，這與Lin等〔17〕研究結(jié)果一致。轉(zhuǎn)染成功構(gòu)建的IQGAP1過(guò)表達(dá)載體pcDNA-IQGAP1后，發(fā)現(xiàn)miR-506-3p對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的抑制作用在一定程度得到逆轉(zhuǎn)。提示miR-506-3p在甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用，miR-506-3p靶向調(diào)控IQGAP1表達(dá)參與其中。近年來(lái)，已發(fā)現(xiàn)miR-217、miR-539和miR-126等多種miRNA可通過(guò)下調(diào)其靶基因抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移〔18～20〕。

綜上，miR-506-3p可抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與miR-506-3p靶向下調(diào)IQGAP1有關(guān)，表明miR-506-3p可能是甲狀腺癌的一個(gè)有效的治療靶點(diǎn)。