錢然

摘要：嗅鞘細(xì)胞是嗅覺系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞，它是脊髓損傷后進(jìn)行神經(jīng)修復(fù)治療的一種有前途的方法。嗅鞘細(xì)胞分泌神經(jīng)因子的濃度不同，會對嗅鞘細(xì)胞體外存活率有影響，我們評估了不同濃度神經(jīng)因子對嗅鞘細(xì)胞活力的影響，并用化合物Endiandrin A（End A）對嗅鞘細(xì)胞進(jìn)行活力影響的評估，以確定它是否能在神經(jīng)因子的存在下存活。我們發(fā)現(xiàn)，End A能在神經(jīng)因子的存在下，顯著地提高嗅鞘細(xì)胞的存活，這些結(jié)果首次證明End A能調(diào)節(jié)嗅膠質(zhì)細(xì)胞，從而有利于神經(jīng)修復(fù)，從而改善移植后的生存。

關(guān)鍵詞：嗅鞘細(xì)胞;神經(jīng)因子;脊髓損傷

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后神經(jīng)細(xì)胞遭到破壞，神經(jīng)功能恢復(fù)困難，如果早期治療不當(dāng)，功能改善往往不如人意。而嗅鞘細(xì)胞（olfactory ensheathing cells，OECs） 移植被認(rèn)為是治療SCI最有希望的方法[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2]，嗅上皮干細(xì)胞可以產(chǎn)生新的神經(jīng)因子，能使鼻和腦重新建立聯(lián)系。本文主要評估化合物End A對OECs活力的影響，以確定它在神經(jīng)因子的存在下，OECs最強(qiáng)活力時的最佳濃度。

1.材料和方法

1.1 OECs培養(yǎng)

小鼠的OECs在含有10%胎牛血清、G5補(bǔ)充劑、慶大霉素、L-谷氨酰胺和5%CO2的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周，再重新移植進(jìn)行分析。

1.2 Endiandrin A

由Endiandra Domin的分離物質(zhì)End A（A末端）由澳大利亞布里斯班格里菲斯大學(xué)Eskitis研究所提供，分子式為C20H24O4。在DMSO中制備10Mm的儲備溶液，將儲備溶液在培養(yǎng)基中稀釋至0.1至10μM的濃度。

1.3 MTS檢測細(xì)胞活力

用cellTiter 96水溶液試劑MTS法測定細(xì)胞活力和增殖。簡言之，將OECs以1.5x104細(xì)胞的密度接種于96孔板中，使細(xì)胞粘附過夜。將A末端和甲基普雷德尼松酮以不同濃度（0.1-10μM）添加到96孔中，孵育24小時[3]。加入一份MTS溶液（10μL），然后在37℃，黑暗中培養(yǎng)2小時。用酶標(biāo)儀在490nm處記錄吸光度，用0.1%DMSOv/v處理對照組以及含有培養(yǎng)基但沒有細(xì)胞的孔，測定吸光度的百分比計算細(xì)胞活力。每項試驗一式三份，活力結(jié)果以百分比表示。體外培養(yǎng)的OECs用抑制劑孵育24h，然后用End A末端處理12、24和36h，進(jìn)行MTS測定。

2. 結(jié)果

2.1.神經(jīng)因子對OECs活力的影響

用不同濃度的神經(jīng)因子孵育OECs （0.97-1000μg/mL）24小時，以確定可能對細(xì)胞產(chǎn)生毒性的大小。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)神經(jīng)因子的濃度在62.5-1000μg之間，會顯著降低細(xì)胞活力（圖1）。對OECs誘導(dǎo)25%細(xì)胞生長抑制（IC25）的神經(jīng)因子劑量為125μg/mL。

2.2.End A對存在神經(jīng)因子的OECs活力的影響

我們評估了End A對在神經(jīng)因子（IC25）濃度下OECs活力的影響。與對照組相比，End A濃度在10μM能有效地提高細(xì)胞活力約40%，并且在存在神經(jīng)因子的情況下，與對照組沒有加神經(jīng)因子的相比，OECs顯示出多約20%的增殖能力（圖2）。

3.討論

SCI后的再生修復(fù)是一個很大的難題，影響因素眾多，移植OECs治療SCI是一項充滿前景的工作。不過現(xiàn)在人們發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)依靠嗅鞘細(xì)胞移植獲得的臨床效果很有限，聯(lián)合應(yīng)用其他藥物，發(fā)揮協(xié)同作用來完成治療脊髓損傷是將來的發(fā)展方向。

本實(shí)驗研究了①不同濃度神經(jīng)因子對嗅鞘細(xì)胞活力的影響，研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷產(chǎn)生高濃度（>62μg/mL）（圖1）的神經(jīng)因子會降低OECs增殖，說明嗅神經(jīng)因子的濃度與嗅鞘細(xì)胞獨(dú)特的作用密不可分[4]。②并用化合物End A對嗅鞘細(xì)胞進(jìn)行活力影響的評估，以確定它在神經(jīng)因子的存在下，OECs最強(qiáng)活力時的最佳濃度。在測試的End A濃度中（圖2），10μM End A在刺激OEC活力方面最有效。在低濃度（0.1μM）時，End A仍能促進(jìn)細(xì)胞增殖，但作用不顯著。

綜上所述，End A是潛在的發(fā)揮OECs活力的藥物，并且在End A濃度為10μM時作用效果最好。從基礎(chǔ)和臨床等多方面深入研究SCI和OECs，對今后解決SCI后再生修復(fù)這一醫(yī)學(xué)難題具有深遠(yuǎn)意義。

參考文獻(xiàn)

[1]Franssen，E.H.，F(xiàn).M.de Bree，and J.Verhaagen，Olfactory ensheathing glia：their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord.Brain Res Rev，2007.56（1）：p.236-58.

[2]Chen，X.，H.Fang，and J.E.Schwob，Multipotency of purified，transplanted globose basal cells in olfactory epithelium.J Comp Neurol，2004.469（4）：p.457-74.

[3]Leal-Filho，M.B.，Spinal cord injury：From inflammation to glial scar.Surg Neurol Int，2011.2：p.112.

[4]Raisman，G.，Olfactory ensheathing cells and repair of brain and spinal cord injuries.Cloning Stem Cells，2004.6（4）：p.364-8.