吳 菁,蔣志勇,李奎生,劉 芳,呂志武,黃明沂,肖 瑤

(1深圳市寶安區(qū)福永人民醫(yī)院消化內(nèi)科,深圳 518103;2武漢大學(xué)中南醫(yī)院影像科;3南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳寶安醫(yī)院消化內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:drjinjie@126.com)

胃癌是人類消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率不斷上升[1]。很多胃癌患者在首次確診時(shí)已位于晚期,失去手術(shù)治療機(jī)會(huì),5年生存率很低[2]。探求胃癌的發(fā)病機(jī)制及新的治療策略是目前胃癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA,在真核細(xì)胞中高度保守[3]。miRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因表達(dá),影響細(xì)胞的分化、增殖和發(fā)育[4]。據(jù)報(bào)道,胃癌組織中存在多個(gè)miRNA異常表達(dá),其在胃癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程發(fā)揮重要作用[5,6]。Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn),miR-4778-3p在復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者組織中呈低表達(dá),抑制宮頸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。miR-4778-3p在胃癌組織中的表達(dá)及對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響尚不清楚。本研究旨在檢測(cè)miR-4778-3p在胃癌組織中的表達(dá),通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討miR-4778-3p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

選取2018年7月至2020年12月間本院胃腸外科行手術(shù)切除的38例胃癌組織及癌旁組織(距腫瘤邊緣>5 cm)。男性25例,女性13例,年齡51.76±8.96歲。病灶直徑<5 cm 12例,病灶直徑≥5 cm 26例。Ⅰ期4例,Ⅱ期6例,Ⅲ期28例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例。所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞株與主要試劑

胃癌MGC803細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心,收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn);miR-4778-3p mimic、miR-NC、SMC4-Wt野生型質(zhì)粒、SMC4-Mut突變型質(zhì)粒均購(gòu)于廣州銳博生物科技有限公司;Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司;胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司;qRT-PCR試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司;引物購(gòu)自武漢擎科生物技術(shù)公司;BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物科技有限公司;CCK-8試劑盒購(gòu)于武漢碧云天生物科技有限公司;一抗GAPDH、SMC4、TGFBR3和p-Smad3購(gòu)于美國(guó)Affinity公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)于武漢博士德生物科技公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

MGC803細(xì)胞復(fù)蘇后在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、飽和濕度。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC803細(xì)胞接種至24孔板,分別轉(zhuǎn)染miR-NC(control組)和miR-4778-3p mimic(miR-4778-3p組),根據(jù)Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)miR-4778-3p和染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4(chromosome structure maintenance protein 4,SMC4)mRNA相對(duì)表達(dá)量

利用TRIzol提取樣本總RNA,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA,根據(jù)qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書擴(kuò)增檢測(cè)。以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-4778-3p的相對(duì)表達(dá),以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算SMC4 mRNA的相對(duì)表達(dá)。miR-4778-3p上游引物:5′-ACTCTGCAAAGGAAGAAGA-3′,下游引物:5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;U6上游引物:5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′,下游引物:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;GAPDH上游引物:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′;SMC4上游引物:5′-CGCCTCCAGCAATGACCAAT-3′,下游引物:5′-CCCCAGCATAGGATTTGAAGTT-3′。根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-4778-3p和SMC4 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5 CCK-8法檢測(cè)MGC803細(xì)胞增殖能力

將“1.3”分control組和miR-4778-3p組MGC803細(xì)胞按照每孔1 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板,培養(yǎng)1,2,3,4,5 d后,根據(jù)CCK-8試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,使用酶標(biāo)儀讀取每孔在波長(zhǎng)490 nm處吸光度(A)值,繪制MGC803細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MGC803細(xì)胞周期變化

收集“1.3”分control組和miR-4778-3p組MGC803細(xì)胞,離心后采用預(yù)冷的PBS溶液洗3次細(xì)胞,加入預(yù)冷的乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)70%),在4 ℃下固定過(guò)夜。加入溴化乙錠(PI)和RNA酶(RNase A),在4 ℃下避光孵育20 min,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)、分析各組細(xì)胞周期變化。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

運(yùn)用miRecords和miRGator數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-4778-3p的靶基因可能是SMC4。運(yùn)用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析SMC4基因在胃癌組織和正常胃組織中的表達(dá)差異。分別將所構(gòu)建的SMC4-Wt野生型質(zhì)粒、SMC4-Mut突變型質(zhì)粒以及miR-4778-3p mimic或miR-NC共轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后分別測(cè)定螢火蟲熒光素酶值(F值)和海腎熒光素酶值(R值),R/F比值代表相對(duì)熒光素酶活性。

1.8 Western blot檢測(cè)SMC4蛋白和TGF-β/Smad信號(hào)通路表達(dá)

收集control組和miR-4778-3p組MGC803細(xì)胞,加入RIPA裂解液在冰上充分裂解。BCA蛋白測(cè)定試劑盒檢測(cè)各組蛋白濃度后,加入蛋白緩沖液制備蛋白樣本,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)膜后,在脫脂牛奶封閉2 h,在一抗SMC4(濃度1 ∶2 000)、TGFBR3(濃度1 ∶2 000)、p-Smad3(濃度1 ∶2 000)、GAPDH(濃度1 ∶1 000)中孵育過(guò)夜。在辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(濃度1 ∶10 000)孵育1 h。使用ECL顯影劑進(jìn)行顯影、拍照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中miR-4778-3p的表達(dá)水平

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-4778-3p在38例胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)分別為2.03±0.65和6.85±0.62。與癌旁組織相比,miR-4778-3p在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著降低(t=34.51,P<0.01)。

2.2 miR-4778-3p瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,control組和miR-4778-3p組MGC803細(xì)胞中miR-4778-3p表達(dá)分別為0.99±0.07和14.26±0.56,miR-4778-3p組miR-4778-3p表達(dá)量是control組的14.40倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=23.67,P<0.01),提示miR-4778-3p序列轉(zhuǎn)染成功。

2.3 miR-4778-3p對(duì)MGC803細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8法結(jié)果顯示,miR-4778-3p組MGC803細(xì)胞在第2,3,4,5天的吸光度A值明顯低于control組(均P<0.05,見圖1),表明上調(diào)miR-4778-3p能夠顯著抑制胃癌MGC803細(xì)胞的增殖能力。

與control組相比,*P<0.05,**P<0.01圖1 miR-4778-3p對(duì)MGC803細(xì)胞增殖能力的影響Figure 1 Effect of miR-4778-3p on the proliferation of MGC803 cells

2.4 miR-4778-3p對(duì)MGC803細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與control組相比,miR-4778-3p組G0-G1期細(xì)胞增多(P<0.01),S期細(xì)胞降低(P<0.01,見圖2)。miR-4778-3p能夠阻遏MGC803細(xì)胞在G0-G1期。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-4778-3p對(duì)MGC803細(xì)胞周期的影響Figure 2 The effect of miR-4778-3p on the cell cycle of MGC803

2.5 miR-4778-3p靶向結(jié)合SMC4的靶向關(guān)系

miRecords和miRGator數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-4778-3p可能的靶基因是SMC4(見圖3)。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示,SMC4基因在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于正常胃組織(P<0.01,見圖4)。雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與miR-NC組相比,miR-4778-3p組熒光素酶活性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.93,P<0.01,見圖5),表明SMC4-3′-UTR存在miR-4778-3p結(jié)合位點(diǎn)。

圖3 SMC4-3′-UTR與miR-4778-3p的結(jié)合位點(diǎn)Figure 3 The binding site of SMC4-3′-UTR and miR-4778-3p

與正常組織相比,**P<0.01圖4 GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析SMC4在胃癌組織和正常組織中的表達(dá)Figure 4 The expression of SMC4 in gastric cancer tissues and normal tissues based on GEPIA database

與miR-NC組相比,**P<0.01圖5 雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SMC4-3′-UTR與miR-4778-3p的結(jié)合Figure 5 Dual luciferase activity experiment verified the binding of SMC4-3′-UTR and miR-4778-3p

2.6 上調(diào)miR-4778-3p對(duì)MGC803細(xì)胞SMC4 mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測(cè)顯示,control組和miR-4778-3p組MGC803細(xì)胞中SMC4 mRNA表達(dá)量分別為1.00±0.14和0.22±0.06,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.03,P<0.01),提示上調(diào)miR-4778-3p顯著促進(jìn)SMC4 mRNA表達(dá)。

2.7 上調(diào)miR-4778-3p對(duì)MGC803細(xì)胞SMC4蛋白和TGF-β/Smad信號(hào)通路表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)顯示,與control組相比,miR-4778-3p組MGC803細(xì)胞中SMC4蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01),TGF-β/Smad信號(hào)通路蛋白如TGFBR3和p-Smad3表達(dá)明顯降低(P<0.01,見圖6)。

與control組相比,**P<0.01圖6 上調(diào)miR-4778-3p對(duì)SMC4蛋白和TGF-β/Smad信號(hào)通路表達(dá)的影響Figure 6 The effect of up-regulation of miR-4778-3p on the expression of SMC4 protein and TGF-β/Smad signaling pathway proteins

3 討論

越來(lái)越多的miRNA被證實(shí)在腫瘤組織和癌旁組織中存在表達(dá)差異,表現(xiàn)為類似癌基因或抑癌基因的作用[8,9]。研究顯示,miR-146b-5p[10]、miR-877-5p[11]、miR-96-5p[12]、miR-760[13]等miRNA在胃癌組織中呈高表達(dá)或低表達(dá),參與調(diào)控胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、分化等過(guò)程,與胃癌患者的臨床分期、病理分級(jí)、生存率密切相關(guān)。miR-4778-3p是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的抑癌性miRNA,其可增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性,抑制細(xì)胞活力、細(xì)胞周期及細(xì)胞轉(zhuǎn)移[7]。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-4778-3p在胃癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異,結(jié)果顯示miR-4778-3p在胃癌組織中呈低表達(dá)。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-4778-3p mimic至胃癌MGC803細(xì)胞,上調(diào)miR-4778-3p表達(dá)能顯著抑制MGC803細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期,miR-4778-3p在胃癌細(xì)胞中表現(xiàn)為抑癌基因作用。

miRNA發(fā)揮作用的主要機(jī)制是通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平特異性結(jié)合靶基因mRNA 3′-UTR,降低靶基因mRNA的穩(wěn)定性,抑制靶基因蛋白的表達(dá)[14]。miRecords和miRGator數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-4778-3p可能的靶基因是染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4(structural maintenance of chromosome protein,4,SMC4)。SMC4蛋白屬于染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白(structural maintenance of chromosome protein,SMC)家族,其在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程負(fù)責(zé)調(diào)控染色體的凝集和分離,影響細(xì)胞周期的進(jìn)展[15]。近年來(lái)研究顯示,SMC4蛋白在結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤組織高表達(dá),其可通過(guò)激活TGF-β/Smad信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展,發(fā)揮顯著的癌基因作用[16-18]。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示,SMC4基因在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于正常胃組織,可能表現(xiàn)為癌基因作用。雙熒光素酶活性分析實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-4778-3p靶向作用SMC4 mRNA的3′-UTR堿基位點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示,上調(diào)miR-4778-3p表達(dá)可靶向抑制SMC4基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá),miR-4778-3p對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響可能與下調(diào)SMC4基因表達(dá)有關(guān)。MGC803細(xì)胞中SMC4基因表達(dá)降低后,TGF-β/Smad信號(hào)通路蛋白表達(dá)明顯降低。

綜上所述,miR-4778-3p在胃癌組織中呈低表達(dá),上調(diào)miR-4778-3p通過(guò)靶向調(diào)控SMC4基因表達(dá),阻滯TGF-β/Smad信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo),有效抑制胃癌MGC803細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期。miR-4778-3p有望成為胃癌新的分子治療靶點(diǎn)。