李 旭,沈千賀

(1西安市中醫(yī)醫(yī)院麻醉科,西安 710021;2長(zhǎng)慶油田職工醫(yī)院麻醉科;*通訊作者,E-mail:shen-qianhe@126.com)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是最嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷之一。諸多因素可以導(dǎo)致SCI進(jìn)一步惡化,例如缺血、水腫、氧自由基和炎癥反應(yīng)[1]。術(shù)后原發(fā)性和繼發(fā)性損傷最終會(huì)導(dǎo)致肢體運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能喪失,給患者及家庭帶來(lái)極大痛苦[2]。目前,由于對(duì)脊髓損傷致病機(jī)制的認(rèn)知有限,所以臨床尚缺乏精準(zhǔn)且有效的治療方案。近年來(lái)大量研究表明,在脊髓損傷后微小RNA(miR)的表達(dá)水平發(fā)生顯著改變,其在神經(jīng)損傷和修復(fù)中發(fā)揮極其重要的調(diào)控作用[3-5]。有學(xué)者通過(guò)基因微陣列芯片分析發(fā)現(xiàn),miR-466c-3p在脊髓損傷大鼠組織中呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì),但具體分子機(jī)制尚未闡明[6]。本研究旨在探索miR-466c-3p在脊髓損傷中的調(diào)控作用及其在運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)過(guò)程中可能的分子機(jī)制,為脊髓損傷的治療提供新的思路和靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物分組及動(dòng)物模型構(gòu)建

選擇成年(約6周)SD雌性大鼠,平均體質(zhì)量(225±16)g,安置在SPF環(huán)境。SD大鼠是從西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買,動(dòng)物研究方案經(jīng)我院動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。大鼠被隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組、SCI組、miR-466c-3p NC組和miR-466c-3p mimics組,每組均有10只大鼠。

將SCI組、miR-466c-3p NC組和miR-466c-3p mimics組大鼠用戊巴比妥進(jìn)行麻醉,然后切除椎板T9-T10暴露脊髓,注意不要損傷硬腦膜。隨后將大鼠進(jìn)行固定,使用紐約大學(xué)沖擊器[7](直徑2.5 mm,質(zhì)量10 g),采用25 mm高度打擊脊髓造成脊髓出血,大鼠雙后腿縮回、尾巴痙攣性擺動(dòng)表明SCI模型成功建立。假手術(shù)組的大鼠僅去除椎板和棘突,不進(jìn)行擊打操作。miR-466c-3p mimics組大鼠脊髓損傷后,立即鞘內(nèi)注射miR-466c-3p mimics(1 μl/h,20 nmol/ml),持續(xù)3 d。miR-466c-3p NC組大鼠脊髓損傷后注射等量的miR-466c-3p negative control,其他兩組相同。

1.2 大鼠行為參數(shù)評(píng)價(jià)

選擇BBB評(píng)分方法,評(píng)價(jià)大鼠的行為參數(shù),以評(píng)估其后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。評(píng)分選用雙盲法,由3位經(jīng)驗(yàn)豐富的的評(píng)分人分別獨(dú)立完成,取其平均值作為最終的評(píng)分。

1.3 RNA提取及qRT-PCR

四組大鼠分別在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后第1,3,5,7,14天)取脊髓組織,選用Trizol(ThemoFisher,美國(guó))分離提取總RNA,并進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara,日本)將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。之后取適量cDNA配置實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系,引物序列見表1,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

生物信息學(xué)分析采用Traget(http://www.targetscan.org/vert-72/)在線分析,以確定miR-466c-3p和MAPK1之間的有利結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建包含miR-466c-3p和MAPK1-3′ UTR結(jié)合位點(diǎn)的MAPK1-3′ UTR(MAPK1-WT),以及不含該結(jié)合位點(diǎn)的MAPK1-3′ UTR(MAPK1-MUT)載體質(zhì)粒。將293T細(xì)胞接種于96孔板中(接種密度104/孔),使用Lipofectamine試劑(ThermoFisher,美國(guó))進(jìn)行共轉(zhuǎn)染,分為對(duì)照組(載體質(zhì)粒+miR-466c-3p mimics negative control)和實(shí)驗(yàn)組(載體質(zhì)粒+miR-466c-3p mimics)。轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞進(jìn)行裂解,檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性,本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠脊髓損傷模型評(píng)估

與假手術(shù)組相比,SCI組大鼠在術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后第1,3,7,14,21,28天)的BBB評(píng)分均顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

表2 兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分比較

2.2 大鼠脊髓組織中miR-466c-3p的表達(dá)水平

與假手術(shù)組相比,SCI組在術(shù)后第3,5,7,14天的miR-466c-3p的表達(dá)水平均顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);術(shù)后第1天,兩組大鼠脊髓組織中miR-466c-3p的表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P>0.05,見圖1A)。

進(jìn)行藥物干預(yù)后,與miR-466c-3p NC組相比,miR-466c-3p mimics組在藥物干預(yù)后第3,5,7,14天miR-466c-3p的表達(dá)水平均顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);藥物干預(yù)后第1天,比較兩組大鼠脊髓組織中miR-466c-3p的表達(dá)水平,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖1B)。

與假手術(shù)組相比,*P<0.05,**P<0.01與miR-466c-3p NC組相比,*P<0.05,**P<0.01A.干預(yù)前大鼠miR-466c-3p的表達(dá)水平B.干預(yù)后大鼠miR-466c-3p的表達(dá)水平圖1 大鼠脊髓組織中miR-466c-3p的表達(dá)水平Figure 1 The expression level of miR-466c-3p in rat spinal cord tissue

2.3 miR-466c-3p促進(jìn)大鼠脊髓損傷運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)

進(jìn)行藥物干預(yù)后,與miR-466c-3p NC組相比,miR-466c-3p mimics組在藥物干預(yù)后第7,14,21,28天的BBB評(píng)分均顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);藥物干預(yù)后第1,3天兩組大鼠的BBB評(píng)分,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見表3)。

表3 兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分比較

2.4 miR-466c-3p和MAPK1的靶向關(guān)系

通過(guò)生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)miR-466c-3p的潛在靶點(diǎn)為MAPK1,且兩者的序列存在連續(xù)7個(gè)堿基的互補(bǔ)(見圖2A)。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組MAPK1-WT的相對(duì)熒光酶活性顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);比較兩組MAPK1-MUT相對(duì)熒光酶活性,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖2B)。

B.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果圖2 miR-466c-3p和MAPK1的靶向關(guān)系Figure 2 Targeting relationship between miR-466c-3p and MAPK1

2.5 大鼠脊髓組織中MAPK1表達(dá)水平

與假手術(shù)組相比,SCI組在術(shù)后第3,5,7,14天的MAPK1的表達(dá)水平均顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);術(shù)后第1天,兩組大鼠脊髓組織中MAPK1的表達(dá)水平,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖3A)。

與miR-466c-3p NC組相比,miR-466c-3p mimics組在給藥停止后第3,5,7,14天MAPK1的表達(dá)水平均顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);給藥停止后第1天,兩組大鼠脊髓組織中MAPK1的表達(dá)水平,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖3B)。

圖3 大鼠脊髓組織中MAPK1的表達(dá)水平Figure 3 The expression level of MAPK1in rat spinal cord tissue

2.6 大鼠脊髓組織中miR-466c-3p和MAPK1表達(dá)水平的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示:脊髓損傷大鼠的脊髓組織中,miR-466c-3p和MAPK1的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.893,P<0.05,見圖4)。

圖4 大鼠脊髓組織中miR-466c-3p和MAPK1表達(dá)水平的相關(guān)性Figure 4 Correlation between the expression levels of miR-466c-3p and MAPK1 in rat spinal cord tissue

3 討論

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷,可以導(dǎo)致永久性殘疾,包括癱瘓、喪失敏感性、身體下部運(yùn)動(dòng)不受控制等[8]。miRNA是長(zhǎng)度約21-24個(gè)核苷酸的非編碼RNA,主要通過(guò)與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)結(jié)合,進(jìn)而調(diào)控靶基因的蛋白表達(dá)[9,10]。近年來(lái),對(duì)miRNAs的研究提示其可能在SCI功能恢復(fù)中扮演極其關(guān)鍵的角色,其表達(dá)趨勢(shì)主要包括三種:①持續(xù)上調(diào);②持續(xù)下調(diào);③早期上調(diào),后期下調(diào)。生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn),SCI相關(guān)miRNAs下游靶基因主要參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[11],這為脊髓損傷的治療提供了新思路。

本研究結(jié)果顯示,miR-466c-3p在脊髓損傷大鼠組織中表達(dá)水平呈持續(xù)降低趨勢(shì),這提示其可能在脊髓損傷基本相關(guān)基因的調(diào)控中起著重要作用。最新的研究發(fā)現(xiàn),miR-466c-3p可以靶向N9小膠質(zhì)細(xì)胞中Bcl-2基因,并可通過(guò)抑制線粒體凋亡途徑對(duì)神經(jīng)元凋亡發(fā)揮保護(hù)作用,進(jìn)而改善脊髓損傷后的功能恢復(fù),提示miR-466c-3p可能是SCI的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)[12]。本研究結(jié)果表明,miR-466c-3p mimic組給藥干預(yù)后,miR-466c-3p表達(dá)水平顯著上調(diào)且BBB評(píng)分顯著高于miR-466c-3p NC組,證明miR-466c-3p有利于脊髓損傷后的功能恢復(fù)。

絲裂原激活的蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)是MAPK信號(hào)傳導(dǎo)的重要蛋白。它通過(guò)使絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸去磷酸化導(dǎo)致MAPK失活。MAPK1作為MAPK信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)因子,在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和分化中發(fā)揮重要作用[13,14]。2019年一項(xiàng)研究表明,在脊髓損傷小鼠血清中miRNA-127-5p顯著下調(diào)而MAPK1上調(diào),下調(diào)的miRNA-127-5p通過(guò)靶向MAPK1而加劇了脊髓損傷[15]。最新的研究證明,在SCI患者和脊髓損傷小鼠血清中,miRNA-433-5p顯著下調(diào)而MAPK1上調(diào),過(guò)表達(dá)miRNA-433-5p可能通過(guò)靶向MAPK1減緩炎癥反應(yīng),從而促進(jìn)脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[16]。而本研究發(fā)現(xiàn),MAPK1是miR-466c-3p的一個(gè)靶基因,其在脊髓損傷大鼠組織中表達(dá)顯著上調(diào),MAPK1和miR-466c-3p的脊髓損傷后大鼠組織中的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。

綜上可知,大鼠脊髓損傷后miR-466c-3p表達(dá)水平顯著下調(diào),過(guò)表達(dá)miRN433-5p可能通過(guò)靶向MAPK1促進(jìn)脊髓損傷大鼠功能的恢復(fù)。這些結(jié)果提示,miR-466c-3p有可能成為脊髓損傷的潛在治療靶點(diǎn)。但本文屬于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究,缺乏臨床樣本,在后續(xù)的研究中,我們將收集并擴(kuò)大臨床標(biāo)本,為miR-466c-3p作為脊髓損傷分子標(biāo)志物提供更可靠的理論依據(jù);另一方面,我們將從細(xì)胞及分子水平,探討miRNA-466c-3p靶向MAPK1促進(jìn)脊髓損傷功能的恢復(fù)作用機(jī)制。