陳 玲,王凱旋,彭馳偉,羅北嬌,陳 薇

(1桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理實驗室,桂林 541001;2桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科;*通訊作者,E-mail:daicw1104@163.com)

鐵死亡(ferroptosis)是在2012年被最先提出的一種概念[1]。它是區(qū)別于傳統(tǒng)死亡形式的鐵依賴性、脂質(zhì)過氧化物積累的新型細(xì)胞死亡形式。其在細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生化特征方面與凋亡、壞死以及自噬有著明顯不同[2,3]。近年來研究表明鐵死亡參與多種疾病的發(fā)生過程,特別是神經(jīng)退行性疾病及創(chuàng)傷性神經(jīng)系統(tǒng)損傷疾病,而神經(jīng)細(xì)胞死亡又是許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要病理事件[4-6]。腦組織中由于含有大量不飽和脂肪酸和較低水平的抗氧化酶,如谷胱甘肽過氧化物酶(GPX4)等,易受羥自由基進(jìn)攻而發(fā)生脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷[7]。因此神經(jīng)系統(tǒng)與鐵死亡密切相關(guān)。

原花青素(proantho cyanidins,PC)是一種廣泛存在于植物的天然多酚類化合物,是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素縮合而成聚合體,具有超強的抗氧化性,是目前公認(rèn)清除自由基的天然抗氧化劑[8-10]。研究表明[11,12],PC不僅能夠有效清除自由基,防止脂質(zhì)發(fā)生過氧化損傷,還能夠提高抗氧化酶的活性從而達(dá)到保護作用。目前PC已應(yīng)用于多種疾病的研究,但在神經(jīng)細(xì)胞中具體作用尚不明確。本文采用與正常神經(jīng)細(xì)胞相似的、被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞,以Erastin損傷SH-SY5Y細(xì)胞為研究模型,探討PC抑制細(xì)胞鐵死亡的神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物及試劑

1.2 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱(德國艾本德公司)、離心機(德國艾本德公司)、多功能酶標(biāo)儀(Infinite F500瑞士TECAN)、倒置熒光顯微鏡(IX73,日本OLYMPUS)、凝膠成像分析儀(美國BIO-RAD公司)。

1.3 細(xì)胞分組及處理

SH-SY5Y細(xì)胞隨機分為5組:①對照組(control組):使SH-SY5Y細(xì)胞處于DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h;②Erastin組:使用終濃度20 μmol/L Erastin處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h;③低濃度PC組:使用10 μmol/LPC和20 μmol/L Erastin混勻后共孵育SH-SY5Y細(xì)胞24 h;④中濃度PC組:使用20 μmol/L PC和20 μmol/LErastin混勻后共孵育SH-SY5Y細(xì)胞24 h;⑤高濃度PC組:使用30 μmol/L PC和20 μmol/L Erastin混勻后共孵育SH-SY5Y細(xì)胞24 h。

1.4 CCK-8法檢測SH-SY5Y細(xì)胞活力

取對數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞,以6 000個/孔均勻地接種于96孔板,當(dāng)細(xì)胞密度長到約為70%-80%時,分別使用濃度為5,10,20 μmol/LErastin及濃度為10,20,40 μmol/LPC予以相應(yīng)處理;另外將20 μmol/LErastin與不同濃度PC(10,20,30 μmol/L)混勻后共同處理細(xì)胞,同時設(shè)置對照組及溶劑對照組(DMSO組),每組6個復(fù)孔,置于培養(yǎng)箱孵育24 h后棄去培養(yǎng)基,每孔加入100 μl CCK-8工作液(CCK-8 ∶DMEM=1 ∶10),置于培養(yǎng)箱孵育1 h后,用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度值(A450 nm)。細(xì)胞存活率(%)=(實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)×100%。實驗重復(fù)5次。

1.5 活性氧試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平

以1.5×105個/孔均勻地接種于6孔板,當(dāng)細(xì)胞密度長到約為70%-80%時,使用不同濃度的PC分別與20 μmol/LErastin混勻后置于培養(yǎng)箱孵育24 h后棄去培養(yǎng)基,用PBS洗滌兩次,每孔加入1 ml稀釋好的DCFH-DA(DCFH-DA ∶無血清DMEM為1 ∶1 000),37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min(加探針和孵育過程要避光操作),無血清DMEM洗滌3次,在熒光倒置顯微鏡下觀察,應(yīng)用圖形分析軟件(Image J)計算出綠色熒光強度平均值,并對每組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次。

1.6 Image-iT脂質(zhì)過氧化試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化(lipid peroxidation,LPO)水平

以1.5×105個/孔均勻地接種于6孔板,當(dāng)細(xì)胞密度長到約為70%-80%時,使用不同濃度的PC分別與20 μmol/L Erastin混勻后置于培養(yǎng)箱孵育24 h后棄去培養(yǎng)基,用PBS洗滌2次,加入10 μmol/L BODIPYTM581/591 C11(一種熒光探針,脂質(zhì)過氧化傳感器)溶液和細(xì)胞一起在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 min(加探針和孵育過程要避光操作),PBS洗滌3次,在熒光倒置顯微鏡下觀察,應(yīng)用圖形分析軟件(Image J)計算出綠色熒光強度平均值,并對每組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次。

1.7 鐵離子比色法檢測細(xì)胞內(nèi)鐵含量變化

以8×104個/孔均勻地接種于24孔板,當(dāng)細(xì)胞密度長到約為70%-80%時,使用不同濃度的PC分別與20 μmol/LErastin混勻后置于培養(yǎng)箱孵育24 h后棄去培養(yǎng)基,用冷的PBS洗滌2次,每孔加入200 μl裂解液置于搖床裂解2 h后,加入200 μl的混液A(按說明書配制)收集混勻,60 ℃水浴孵育1 h,加入60 μl鐵離子檢測劑混勻,室溫孵育30 min,取200 μl于96孔板,用酶標(biāo)儀測定570 nm處吸光度(optical density,OD)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出鐵離子濃度。實驗重復(fù)3次。

1.8 總谷胱甘肽試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量變化

以2.5×105個/孔均勻地接種于6孔板,當(dāng)細(xì)胞密度長到約為70%-80%時,使用不同濃度的PC分別與20 μmol/L Erastin混勻后置于培養(yǎng)箱孵育24 h后棄去培養(yǎng)基,用PBS洗滌一次,離心收集細(xì)胞,加入沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑S溶液,充分渦旋,然后用液氮和37 ℃水浴進(jìn)行兩次快速凍融,4 ℃ 10 000g離心10 min得待測樣品。取10 μl待測樣品于96孔板,加入150 μl總谷胱甘肽檢查工作液(按說明書配制)后置于搖床混勻,室溫孵育5 min,加入50 μl的0.5 mg/ml NADPH溶液(按說明書配制)混勻,室溫孵育1 h,用酶標(biāo)儀測定405 nm處吸光度(optical density,OD)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出總谷胱甘肽含量。實驗重復(fù)3次。

1.9 Western blot法檢測GPX4、xCT蛋白表達(dá)

收集藥物干預(yù)后的細(xì)胞,使用加入PMSF和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞蛋白裂解液,冰上裂解,使用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞進(jìn)行超聲,4 ℃ 12 000g離心30 min,對適量上清液采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。將蛋白樣品與4×上樣緩沖液按3 ∶1體積混合,100 ℃煮沸8 min變性。通過丙烯酰胺凝膠電泳后,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉2 h后,加入GPX4、xCT抗體(1 ∶1 000)4 ℃過夜孵育,用TBST洗滌,二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h,TBST洗滌,然后用免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)進(jìn)行反應(yīng),曝光,使用Image J軟件分析結(jié)果。實驗重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 PC、Erastin分別對SH-SY5Y細(xì)胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示,不同濃度梯度的Erastin(5,10,20 μmol/L)作用細(xì)胞24 h,各組細(xì)胞增殖受到不同程度的影響,當(dāng)濃度為20 μmol/LErastin時,細(xì)胞生長受到明顯抑制,細(xì)胞活力為(50.56±2.5)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,見圖1),故此濃度為后續(xù)實驗濃度;不同濃度的PC(10,20,40 μmol/L)作用于細(xì)胞24 h,當(dāng)PC濃度為40 μmol/L時,細(xì)胞活力(84.59±2.3)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,見圖1),故后續(xù)實驗原花青素作用濃度的需小于40 μmol/L。

與對照組相比,***P<0.001圖1 Erastin或PC處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后對細(xì)胞存活率的影響Figure 1 Effect of Erastin or PC on SH-SY5Y cell survival rate at 24 h

2.2 PC對Erastin損傷SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

CCK-8結(jié)果顯示,40 μmol/L的PC抑制了SH-SY5Y細(xì)胞生長,對細(xì)胞具有一定毒性,故選擇濃度梯度(10,20,30 μmol/L)的PC分別與20 μmol/L Erastin共孵育細(xì)胞24 h,從統(tǒng)計結(jié)果圖中看出30 μmol/L的PC對Erastin損傷SH-SY5Y細(xì)胞具有保護作用并增強了細(xì)胞活力(見圖2),故在后續(xù)實驗中使用10,20,30 μmol/L作為PC對SH-SY5Y細(xì)胞的作用濃度。

與對照組相比，***P<0.001;與Erastin組相比，#P<0.05，##P<0.01圖2 不同濃度PC與20 μmol/L Erastin共孵育細(xì)胞24 h后對細(xì)胞活力的影響Figure 2 Effects of different concentrations of PC co-incubated with 20 μmol/L Erastin for 24 h on cell viability

2.3 PC對Erastin損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS、LPO的影響

實驗結(jié)果顯示,20 μmol/L Erastin損傷細(xì)胞24 h后ROS及LPO水平較對照組明顯增加(P<0.05或P<0.001),而PC處理后的細(xì)胞內(nèi)ROS及LPO水平較Erastin組明顯降低(P<0.01或P<0.001,見圖3,4),提示PC抑制細(xì)胞內(nèi)ROS和LPO的生成。

2.4 PC對Erastin損傷SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)鐵離子及GSH含量的影響

實驗結(jié)果顯示,與對照組比較,20 μmol/L Erastin損傷細(xì)胞24 h后細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了鐵離子積累(P<0.001),GSH合成減少(P<0.001),而PC處理后的細(xì)胞較Erastin組鐵離子含量降低(P<0.05),GSH含量增加(P<0.05,見圖5)。

與對照組相比,***P<0.001;與Erastin組相比,#P<0.05圖5 PC對Erastin損傷的SH-SY5Y細(xì)胞鐵和谷胱甘肽含量的影響Figure 5 Effects of PC on iron and GSH content in SH-SY5Y cells damaged by Erastin

2.5 PC對SH-SY5Y細(xì)胞GPX4和xCT蛋白表達(dá)的影響

利用Western blot檢測細(xì)胞中GPX4和xCT蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,與對照組比較,Erastin組中的GPX4及xCT蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.001);而PC處理后的組中GPX4及xCT蛋白表達(dá)較Erastin組顯著升高(P<0.001),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖6)。

與對照組比較，**P<0.01，***P<0.001；與Erastin組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001圖6 PC對鐵死亡相關(guān)蛋白GPX4和xCT表達(dá)的影響Figure 6 Effect of PC on expression of ferroptosis-related proteins GPX4 and XCT

3 討論

鐵死亡是一種新型非凋亡形式的細(xì)胞死亡方式,這種死亡是由鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化物積累到毒性水平引起的,其生化特征主要有鐵積累,谷胱甘肽耗竭脂質(zhì)過氧化積累等[13]。研究表明[14,15],鐵死亡特征已在多種疾病中被發(fā)現(xiàn),尤其是與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病,并且體內(nèi)外實驗證明干預(yù)誘導(dǎo)或抑制鐵死亡,可為治療這些疾病提供新方法。PC是目前應(yīng)用最廣泛的酚類物質(zhì),不僅具有清除自由基、抗氧化活性,還具有抗炎、抗過敏和抗腫瘤活性,此外,它們還可以螯合金屬(如鐵),激活抗氧化酶(如GPX4)等[16]。研究顯示,所含的酚類結(jié)構(gòu)對鐵超載所致腎臟、肝臟氧化損傷具有明顯的抑制作用[17,18],同時,其抗氧化性及螯合作用對鐵死亡引起的脊髓繼發(fā)性損傷具有一定的修復(fù)作用[19]。但PC在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中對鐵死亡的作用機制尚不明確,因此,本研究初步探討PC對神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡保護作用及其機制。

Erastin作為最早發(fā)現(xiàn)的鐵死亡激活劑,其誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是由鐵依賴的脂質(zhì)過氧化介導(dǎo)的,并被抗氧化劑或鐵螯合劑抑制[20]。其主要通過抑制胱氨酸/谷氨酸逆轉(zhuǎn)運體系統(tǒng)(xCT)誘發(fā)鐵死亡導(dǎo)致胱氨酸輸入減少,谷胱甘肽耗竭從而降低GPX4清除過氧化物的能力,造成LPO過度積累,最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。同時,又有研究表明Erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵離子增多,進(jìn)一步引發(fā)芬頓反應(yīng)造成ROS積累,引起脂質(zhì)過氧化[21-23]。而ROS又是細(xì)胞死亡的介質(zhì),特別是脂質(zhì)ROS是鐵死亡的必要因素。因此,本研究通過建立鐵死亡模型,研究PC對Erastin誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡的抑制作用。實驗結(jié)果表明,Erastin能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡,而與Erastin損傷組比較,PC組細(xì)胞內(nèi)ROS、LPO水平及鐵離子含量降低,GSH水平升高,表明PC能夠抑制SH-SY5Y細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生;為了進(jìn)一步探討PC的神經(jīng)保護作用,我們檢測了xCT和GPX4的蛋白表達(dá)情況,結(jié)果顯示PC上調(diào)了xCT和GPX4的蛋白水平,證實了PC對SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)保護作用。

綜上所述,PC對SH-SY5Y細(xì)胞鐵死亡的作用,可能是通過調(diào)控xCT/GPX4信號通路,保護細(xì)胞免受Erastin誘導(dǎo)的各種損傷。我們的研究結(jié)果為進(jìn)一步深入研究PC在神經(jīng)保護機制方面提供了依據(jù),但其他鐵死亡通路的相關(guān)因子還有待進(jìn)一步被研究探索。