程柏楊,潘鷺翔,朱茂榮,王盈雯,顧錦濤*

(1空軍軍醫(yī)大學藥學系生物制藥學教研室,西安 710032;2空軍軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學院;*通訊作者,E-mail:gujintao@fmmu.edu.cn)

結(jié)腸癌是目前人類消化道最常見的惡性腫瘤之一,根據(jù)最新的研究,每年有超過3 000萬人被診斷出結(jié)腸癌[1]。結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個復雜且異質(zhì)性的過程,由多種發(fā)病因素相互作用引起,包括遺傳因素和環(huán)境因素。臨床上結(jié)腸癌的治療常以手術(shù)為主、輔以放化療,化療對中晚期結(jié)腸癌有著非常重要的作用,但腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性常導致化療失敗,進而導致局部復發(fā)甚至遠處轉(zhuǎn)移[2,3]。腫瘤的耐藥性依舊是影響臨床腫瘤治療效果的重要因素,為癌癥的治療帶來了很大挑戰(zhàn)。抑制和逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌耐藥細胞的發(fā)生發(fā)展是提高臨床療效的關(guān)鍵[4]。因此,尋找影響腫瘤耐藥相關(guān)的關(guān)鍵分子,對開發(fā)新的治療靶點及預后評估具有重要意義[5]。結(jié)腸癌的發(fā)生和進展與多種基因的突變密切相關(guān),因此,在基因和分子水平研究結(jié)腸癌可以為臨床治療提供重要的診療靶點。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一種長度大于200 bp且沒有蛋白編碼功能的RNA[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn),lncRNA可以通過與不同的分子如mRNA、小分子RNA、蛋白質(zhì)等發(fā)揮作用,進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。盡管對腫瘤藥物抗性機制的研究不斷進展,但是對由lncRNA介導的耐藥機制的認識仍然相當有限。FTX(five prime to Xist)基因是人類X染色體上的一個非蛋白質(zhì)編碼基因,是位于X染色體失活(XCI)的保守轉(zhuǎn)錄本。FTX除了編碼兩個microRNA分子(miRNAs)外,還編碼一個高度保守的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,即lncRNA FTX。研究表明lncRNA FTX在調(diào)控Xist(X染色體失活中心)表達中起著重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)lncRNA FTX與卵巢癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的進展密切相關(guān)[8,9],但沒有系統(tǒng)闡述lncRNA FTX與腫瘤化療耐藥關(guān)系的研究。本研究旨在通過研究lncRNA FTX對結(jié)腸癌伊立替康耐藥細胞增殖和遷移能力的影響,進而從分子水平闡述lncRNA FTX與結(jié)腸癌伊利替康耐藥的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑

結(jié)腸癌細胞系HCT-116購于中科院上海細胞研究所,McCoy’s 5A、磷酸鹽緩沖液(PBS)培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司,鹽酸伊立替康(美國Selleck),CCK-8試劑盒購自上海陶素生化科技有限公司,嘌呤霉素、Trizol試劑購自美國Thermo公司,RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司,兔源多克隆抗體GAPDH、c-myc、Vimentin、MTA-1,辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗及DAB顯色液均購自英國Abcam公司,RT-qPCR引物均由北京擎科生物科技有限公司設計合成。慢病毒載體構(gòu)建包裝并購于上海吉凱基因科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫分析 lnCAR數(shù)據(jù)庫(https://lncar.renlab.org/)是由中山大學的學者開發(fā)的收集整理了來自GEO數(shù)據(jù)庫(基因表達綜合數(shù)據(jù)庫)中腫瘤樣本的lncRNA差異表達分析及生存分析。我們從該數(shù)據(jù)庫中獲取了80例臨床樣本(CR-S174)FTX的表達情況以及70例結(jié)腸癌患者(CR-O18)的預后,并進行統(tǒng)計學分析。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 配制含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的McCoy’s 5A完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HCT-116細胞,于37 ℃、5% CO2和95%空氣飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),0.25%胰酶消化傳代。

1.2.3 誘導耐藥并檢測細胞藥敏性、計算耐藥指數(shù) 采用伊立替康藥物濃度梯度遞增誘導法建立人結(jié)腸癌耐藥細胞系HCT-116/CPT-11R。將HCT-116細胞按2×105個/孔接種于六孔板中,加入濃度為1 μmol/L的伊立替康完全培養(yǎng)基培養(yǎng),加藥24 h后撤藥,待細胞長至對數(shù)生長期再加藥,間歇培養(yǎng)-撤藥,重復處理2次后逐步提高給藥濃度至5,10,20,50 μmol/L。連續(xù)培養(yǎng)9個月,獲得能在50 μmol/L中穩(wěn)定生長的耐藥細胞株HCT-116/CPT-11R。

接種1×104對數(shù)生長期的HCT-116細胞和HCT116/CPT-11R于96孔板中,培養(yǎng)24 h后棄上清,分別加入100 μl不同濃度梯度含伊立替康培養(yǎng)基,設6個復孔培養(yǎng)24 h后棄上清,通過CCK-8法檢測細胞生長情況。分別計算伊立替康對兩種細胞的生長抑制率,細胞生長抑制率=(1-實驗組OD450/對照組OD450)×100%;分析細胞半數(shù)抑制濃度(50% inhibitory concentration,IC50)和耐藥指數(shù)(resistant index,RI),RI=耐藥細胞的IC50/敏感細胞的IC50)。

1.2.4 慢病毒感染 取對數(shù)生長期HCT-116/CPT-11R細胞,消化、重懸、計數(shù),并按5×104個/孔接種于六孔板后正常培養(yǎng)。待細胞密度達20%-30%時更換培養(yǎng)基,設置5個組,空白對照組(NC)、陰性對照組(sh-NC)、慢病毒感染組1(sh-FTX1)、慢病毒感染組2(sh-FTX2)及慢病毒感染組3(sh-FTX3)。根據(jù)上海吉凱基因公司2019慢病毒操作手冊中人結(jié)腸癌細胞HCT-116的復感染指數(shù)(MOI)=20,分別加入PBS、空白慢病毒及敲低FTX的3種慢病毒(病毒滴度4×108TU/ml),同時加入感染增強液HiTransG P。sh-FTX1序列:5′-CAGCATCCTGCACCTAGTTAT-3′;sh-FTX2序列:5′-GAGGGACAAATCCCATTTGAA-3′;sh-FTX3序列:5′-GTGCCGCTGTTAGACGAAGTA-3′;sh-NC序列:5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。培養(yǎng)8 h后更換完全培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染72 h后最后用濃度為4 μg/ml的嘌呤霉素篩選,2 d后更換完全培養(yǎng)基,傳代后熒光顯微鏡下觀察感染效率。

1.2.5 RT-qPCR法檢測各組細胞中l(wèi)ncRNA FTX的表達 為了探討lncRNA FTX在結(jié)腸細胞、結(jié)腸癌細胞系以及構(gòu)建的結(jié)腸癌耐藥株中的表達,我們提取總RNA,采用RT-qPCR的方法檢測NCM460、HCT-116、HCT-116/CPT-11R細胞中l(wèi)ncRNA FTX的表達。

將NCM460、HCT-116和HCT-116/CPT-11R細胞以及慢病毒感染后的四組細胞接種于六孔板中,待細胞處于對數(shù)生長期時,收集細胞,用Trizol提取試劑分別提取總RNA并進行定量。

將提取的總RNA用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應條件為37 ℃ 15 min,95 ℃ 10 s。按照qPCR試劑盒說明書配制反應體系,反應條件為95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40次循環(huán)后記錄數(shù)據(jù),引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt方法分析FTX的相對表達量。

表1 實時定量PCR引物序列

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western blot)實驗檢測c-myc、Vimentin、MTA-1蛋白的表達水平 將空白對照組、陰性對照組和和sh-FTX組細胞分別接種于10 cm2培養(yǎng)皿中,待細胞融合度達80%左右時分別收集細胞,使用RIPA裂解液提取各組總蛋白,測定蛋白濃度并定量。

以GAPDH為內(nèi)參進行十二烷基硫酸鈉聚烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),轉(zhuǎn)膜于甲醇活化后的PVDF膜上,再用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,隨后用一抗GAPDH、c-myc、Vimentin、MTA-1(1 ∶1 000稀釋),于4 ℃搖床孵育過夜,用洗膜緩沖液(Tris buffered saline tween,TBST)清洗3遍,每遍10 min,然后室溫孵育辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1 ∶3 000稀釋)2 h;TBST清洗3遍,每遍10 min,最后用ECL化學發(fā)光儀顯色。

1.2.7 CCK-8實驗檢測細胞增殖能力 使用10 cm2培養(yǎng)皿培養(yǎng)HCT-116細胞,當細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時用3 ml胰蛋白酶消化,離心收集細胞,加入培養(yǎng)基重懸制成細胞懸液,用細胞計數(shù)儀計數(shù)后,按5×103個/孔接種至96孔板中,設置5個時間梯度,在接種后0,24,48,72,96,120 h時,分別在每孔加入培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液,于培養(yǎng)箱中孵育90 min后測定吸光度。

1.2.8 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力 6 cm2培養(yǎng)皿培養(yǎng)NC組、sh-NC組和和sh-FTX組細胞至對數(shù)生長期,分別用1 ml胰蛋白酶消化后離心收集細胞沉淀,加入細胞培養(yǎng)基重懸制成細胞懸液,用細胞計數(shù)儀計數(shù)后按1×103個細胞/孔接種到六孔板中,放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d。吸去培養(yǎng)基,PBS清洗兩次后,用4%的多聚甲醛固定15 min,然后用結(jié)晶紫進行染色30 min,最后用PBS沖洗多余的結(jié)晶紫,晾干后拍照、計數(shù)。

1.2.9 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取對數(shù)期細胞分別消化后接種于六孔板于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細胞融合率達80%左右時,使用20 μl的無菌槍頭在六孔板中央劃痕,用PBS清洗兩遍,除去掉落懸浮的細胞后換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。然后在0 h和48 h后分別在倒置光學顯微鏡下觀察劃痕愈合程度,分別選取視野拍照。最后分別計算遷移融合率,比較與對照組的遷移程度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應用GraphPad Prism 8進行作圖并且通過SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析,正態(tài)分布的計量資料結(jié)果采用均數(shù)±標準誤表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫分析

統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,結(jié)腸癌患者腫瘤組織樣本中FTX表達高于正常組織樣本(P=0.001 6,見圖1A);且生存分析結(jié)果顯示FTX低表達組的生存率高于FTX高表達組,其中低表達組患者的5年生存率約為高表達組的2倍(P<0.05,見圖1B)。

A.腫瘤組織和正常組織中FTX的表達B.不同表達水平FTX的結(jié)腸癌患者生存曲線圖1 lnCAR數(shù)據(jù)庫中結(jié)腸癌患者FTX差異表達及生存分析Figure 1 FTX differential expression and survival analysis in patients with colon cancer in lnCAR database

2.2 耐藥細胞株HCT-116/CPT-11R的構(gòu)建及耐藥性檢測

通過逐步增加伊立替康濃度,梯度誘導HCT-116細胞產(chǎn)生耐藥性,細胞在不同濃度伊立替康培養(yǎng)基中生長抑制率變化見圖2。計算出HCT-116和HCT-116/CPT-11R的IC50分別是(7.43±0.68)μmol/L和(134.56±4.60)μmol/L,耐藥指數(shù)為18.13(RI>5,P<0.05),說明HCT-116/CPT-11R耐藥細胞株對伊立替康產(chǎn)生耐藥性,并符合耐藥株的基本特性。

圖2 CCK-8檢測不同濃度伊立替康對細胞的生長抑制率Figure 2 Cell growth inhibition rates of HCT-116 and HCT-116/CPT-11R after treatment with different concentrations of irinotecan by CCK-8

2.3 lncRNA FTX在耐藥株中的表達

結(jié)果顯示,結(jié)腸癌細胞HCT-116 lncRNA FTX表達量顯著高于正常結(jié)腸細胞NCM460(P<0.01),而HCT-116/CPT-11R顯著高于結(jié)腸癌細胞HCT-116,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖3)。

與NCM460相比,**P<0.01;與HCT-116相比,#P<0.05圖3 lncRNA FTX在正常結(jié)腸、結(jié)腸癌及結(jié)腸癌耐藥細胞中的表達量Figure 3 Expression level of lncRNA FTX in colon, colon cancer and colon cancer drug-resistant cells

2.4 lncRNA FTX shRNA轉(zhuǎn)染效率和干擾效果

空白慢病毒(sh-NC)及敲低FTX的3種慢病毒(sh-FTX1、sh-FTX2、sh-FTX3)感染HCT-116/CPT-11R細胞,分別收集總RNA,利用RT-qPCR測定lncRNA FTX的敲低效率。結(jié)果顯示,sh-FTX1、sh-FTX2及sh-FTX3的相對表達量分別0.458±0.096,0.765±0.080,0.669±0.091,其中與sh-NC相比,sh-FTX1敲低效果最好(P=0.001 0,見圖4),因此選擇sh-FTX1敲低細胞株進行后續(xù)的實驗。

與sh-NC組相比,***P<0.005圖4 RT-qPCR檢測lncRNA FTX shRNA敲低效果Figure 4 The knockdown effect of lncRNA FTX shRNA detected by RT-qPCR

2.5 lncRNA FTX對細胞增殖能力的影響

CCK-8結(jié)果表示,敲低lncRNA FTX后細胞的活力被顯著抑制,在72 h時三組細胞空白對照NC、陰性對照sh-NC以及sh-FTX的吸光度分別是0.660±0.059,0.642±0.074和0.224±0.009,sh-FTX組與sh-NC組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.005,見圖5)?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果發(fā)現(xiàn),低表達lncRNA FTX的細胞克隆形成能力被顯著抑制(28±8.544),敲低lncRNA FTX的細胞克隆形成率以及克隆的大小都遠低于空白對照組(56±8.544)和sh-NC組(59±7.000),且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.005,見圖6)。

與sh-NC組相比,***P<0.005圖5 CCK-8實驗檢測轉(zhuǎn)染sh-FTX耐藥株HCT-116/CPT-11R細胞活力Figure 5 Cell viability of HCT-116/CPT-11R transfected with sh-FTX by CCK-8

圖6 克隆形成檢測轉(zhuǎn)染sh-FTX耐藥株HCT-116/CPT-11R的克隆形成能力Figure 6 Clonal formation assay of HCT-116/CPT-11R transfected with sh-FTX

2.6 lncRNA FTX對細胞遷移能力的影響

細胞劃痕實驗結(jié)果顯示,NC及轉(zhuǎn)染sh-NC、sh-FTX的HCT-116/CPT-11R細胞分別遷移(237.583±13.45)μm，(237.120±19.77)μm和(27.073±3.45)μm,且sh-FTX組相比于NC組和空白對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.005,見圖7),說明敲低lncRNA FTX顯著抑制HCT-116/CPT-11R的遷移能力。

圖7 lncRNA FTX對HCT-116/CPT-11R細胞遷移的影響(×100)Figure 7 Effect of lncRNA FTX on HCT-116/CPT-11R cell migration (×100)

2.7 Western blot實驗檢測腫瘤細胞增殖、侵襲相關(guān)蛋白表達水平

收集細胞分別提取總蛋白,Western blot檢測發(fā)現(xiàn),與對照組相比,sh-FTX組HCT-116/CPT-11R的增殖相關(guān)蛋白c-myc以及遷移相關(guān)蛋白Vimentin、MTA-1的表達明顯被抑制,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖8)。說明lncRNA FTX可能是通過調(diào)控以上相關(guān)蛋白促進結(jié)腸癌細胞增殖和遷移。

圖8 Western blot實驗檢測細胞中相關(guān)蛋白的表達Figure 8 The expression of related protein in cells was detected by Western blot assay

3 討論

近年來,結(jié)腸癌在中國的發(fā)病率逐漸上升,根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)提供的GLOBOCAN 2018癌癥發(fā)病率和死亡率估計值,結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率僅次于肺癌、女性乳腺癌和前列腺癌[10]。早期結(jié)腸癌可以采取內(nèi)鏡微創(chuàng)治療,而對于中晚期結(jié)腸癌患者化療是重要的治療手段,常用的化療藥物有伊立替康、5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑等[11,12]。伊立替康是一種拓撲異構(gòu)酶Ⅰ抑制劑,發(fā)揮細胞毒作用,能選擇性地作用于拓撲異構(gòu)酶Ⅰ,對DNA空間構(gòu)型、復制、重組、轉(zhuǎn)錄及有絲分裂等過程具有十分重要的干預功能,使DNA單鏈及雙鏈斷裂,從而誘導癌細胞凋亡[13]。但由于腫瘤細胞的DNA修復能力的增強,尤其DNA pol-β是DNA修復的關(guān)鍵,進而為腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性提供了分子基礎(chǔ)[14]。由于耐藥性的產(chǎn)生,化療效果并不是特別理想。因此,從基因和分子水平了解結(jié)腸癌的發(fā)病及耐藥機制對其防治具有重要意義。

近年來,長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)作為基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”被報道其可在不同層次水平調(diào)控基因的表達,并在各種疾病中發(fā)揮功能。其中,本文討論的lncRNA FTX在多種腫瘤中的異常表達與癌癥發(fā)生發(fā)展以及預后密切相關(guān),其分子機制是X通過調(diào)控下游分子的表達來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15,16]。我們通過對從lnCAR數(shù)據(jù)庫中獲取的結(jié)腸癌患者FTX的表達情況以及不同表達組的生存率進行統(tǒng)計學分析,驗證了結(jié)腸癌患者FTX的高表達會降低其生存率。除此之外,有前期研究表明:lncRNA FTX通過調(diào)節(jié)miR-342-3p和AEG-1對膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵襲起關(guān)鍵作用;在肺腺癌細胞中,lncRNA FTX通過調(diào)節(jié)miR-335-5p/NUCB2軸促進肺腺癌細胞增殖和遷移[16];另外,lncRNA FTX可以通過調(diào)節(jié)下游分子miR-192-5p促進大腸癌的進展。然而,目前尚未有l(wèi)ncRNA FTX與結(jié)腸癌耐藥株的相關(guān)報道。我們一線化療藥伊立替康誘導構(gòu)建結(jié)腸癌耐藥株HCT-116/CPT-11R,并發(fā)現(xiàn)其lncRNA FTX表達量顯著高于非耐藥株及普通結(jié)腸細胞。并通過RNA干擾實驗,在耐藥細胞中轉(zhuǎn)染lncRNA FTX shRNA下調(diào)其表達,發(fā)現(xiàn)耐藥株細胞的增殖、遷移能力均明顯減弱,其作用機制可能通過上調(diào)增殖、遷移相關(guān)基因c-myc[17]、Vimentin[18]、MTA-1[19]的表達而實現(xiàn)。

綜上所述,結(jié)腸癌耐藥株HCT-116/CPT-11R中l(wèi)ncRNA FTX呈高表達,敲低lncRNA FTX明顯下調(diào)了c-myc、Vimentin、MTA-1蛋白的表達,從而抑制結(jié)腸癌耐藥細胞株的增殖及遷移能力。lncRNA在結(jié)腸癌化療耐藥發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用,具有成為結(jié)腸癌耐藥新的靶向分子的價值。但本文僅在細胞水平驗證了lncRNA FTX與耐藥株的相關(guān)性,一方面還缺乏足夠的臨床標本進行驗證,另一方面還需要從體內(nèi)水平證明這一現(xiàn)象,進一步探討lncRNA FTX在結(jié)腸癌伊立替康耐藥中的作用。