趙 鵬,李鵬飛,秦俊霞,張馨中,秦小衛(wèi)*

(1山西省人民醫(yī)院皮膚性病科,太原 030012;2山西醫(yī)科大學轉化醫(yī)學研究中心;*通訊作者,E-mail:pfkzhaopeng@163.com)

斑禿(alopecia areata,AA)是一種高度流行的慢性復發(fā)性自身免疫性疾病,其特點是頭皮或身體其他部位突然出現(xiàn)脫發(fā)斑[1,2],在一般人群中的終生風險估計為1.7%-3.8%[3]。AA可發(fā)生于任何年齡,尤其好發(fā)于青少年,一般輕者的愈合較好,其中約50%病例有復發(fā),特別是初發(fā)于兒童者其復發(fā)較多,而全禿發(fā)生于兒童者時則很難恢復[4]。AA也是一種具有高度情感影響的疾病,對患者心理健康的影響也非常嚴重,能夠降低患者及其家屬的生活質量[5-7]。雖然近年來我們對AA在病理生物學的研究上取得了很大進展,但對其還并不完全了解,也沒有針對AA的有效治療方法[8,9]。因此,我們需要更好地對AA的發(fā)病機制進行了解。研究顯示AA患者病變部位和血清中的IL-17在AA患者表達明顯高于對照組[10,11],表明IL-17信號通路在斑禿的病變過程中起著一定作用;而miR-6819-3p在AA患者的血清中表達降低[12],提示其的表達變化會對AA的發(fā)病產(chǎn)生影響。就此,本實驗擬對AA患者病變部位miR-6819-3p及其靶基因的表達情況以及與IL-17信號通路的關系進行研究。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象和試劑

研究分為斑禿組與正常對照組,其中斑禿組為2020年6-12月于山西省人民醫(yī)院皮膚性病科診療的斑禿患者,共20例,入組標準:①依據(jù)病史、臨床表現(xiàn)及輔助檢查確診為斑禿;②初次就診,未接受過藥物治療。排除標準:①取材部位有皮膚感染患者;②全禿或普禿患者。正常對照組來自10例本科室外科手術所獲得的正常頭皮組織。取材尺寸約為1 cm×1 cm。本研究經(jīng)過山西省人民醫(yī)院倫理委員會批準,所有受試者均已告知本研究目的及內(nèi)容并簽署知情同意書。

1.2 miR-6819-3p及其靶基因的生物信息學分析

利用miRWalk[13]網(wǎng)站獲取miR-6819-3p的預測靶基因,并通過Metascape[14]網(wǎng)站篩選其中與IL-17信號通路相關的靶基因,并利用ViennaRNA軟件包[15]中的RNAduplex程序分析miR-6819-3p與其預測靶基因的作用位點,之后用KEGG[16,17]網(wǎng)站的Color Pathway工具及STRING[18]數(shù)據(jù)庫(http://STRING-db.org/)來分析這些靶基因在IL-17信號通路中的位置和相互作用關系。

1.3 熒光定量PCR檢測

按照TRIzol試劑說明書,分別對斑禿組和正常對照組的總RNA進行提取。利用RTase M-MLV進行逆轉錄反應,獲得各組相應的cDNA,引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 19.0軟件,采用獨立樣本t檢驗來比較組間差異,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-6819-3p與其靶基因的預測結合位點

利用miRWalk網(wǎng)站和ViennaRNA軟件包中的RNAduplex程序分析,獲得了miR-6819-3p與的CSF3、CXCL8、FOS、FOSB、JUN和NFKBIA等基因的預測結合位點,結果見圖1,提示這些基因是miR-6819-3p的靶基因。

圖1 miR-6819-3p與IL-17信號通路基因間的預測結合位點Figure 1 Predicted binding sites between miR-6819-3p and its target genes in IL-17 signaling pathway

2.2 斑禿患者病變部位miR-6819-3p及其IL-17信號通路中靶基因的表達情況

熒光定量PCR結果顯示,與對照組相比,miR-6819-3p在斑禿患者病變部位的表達量降低,是正常組織的0.057 2,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);CSF3、CXCL8、FOS、FOSB、JUN和NFKBIA等基因在斑禿患者病變部位的表達量均呈現(xiàn)不同程度的增加,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖2)。miR-6819-3p與CSF3、CXCL8、FOS、FOSB、JUN和NFKBIA等基因的表達情況相反,提示miR-6819-3p對這些基因可能具有調控作用。

與正常組比較，*P<0.05圖2 斑禿患者病變部位miR-6819-3p及其IL-17信號通路中靶基因的表達情況Figure 2 Expression of mir-6819-3p and its target genes in IL-17 signaling pathway in alopecia areata lesions

2.3 miR-6819-3p預測靶基因在IL-17信號通路中的分布及相互作用關系

利用KEGG網(wǎng)站的Color Pathway工具對CSF3、CXCL8、FOS、FOSB、JUN和NFKBIA等基因在IL-17信號通路中的位置進行了標識,結果顯示這些靶基因均屬于IL-17信號通路(見圖3),是IL-17發(fā)揮作用的下游關鍵基因。

圖3 KEGG網(wǎng)站Color Pathway工具對miR-6819-3p預測靶基因在IL-17信號通路中的位置標識圖Figure 3 The location of miR-6819-3p predicted target genes in IL-17 signaling pathway used by Color Pathway of KEGG

利用STRING數(shù)據(jù)庫對miR-6819-3p預測靶基因間的相互作用分析顯示,這些基因間存在著密切的相互作用關系(見圖4)。

圖4 STRING數(shù)據(jù)庫對miR-6819-3p預測靶基因間蛋白互作分析Figure 4 The protein interactions between miR-6819-3p predicted target genes by STRING database

3 討論

目前國內(nèi)外多數(shù)學者認為AA是一種T淋巴細胞介導的自身免疫性疾病,近年對AA的研究也主要集中在細胞免疫與AA發(fā)病的關系方面。已有研究發(fā)現(xiàn)AA皮損毛囊周圍浸潤的T淋巴細胞及細胞因子在AA發(fā)病中起著重要的作用。Th17細胞是一種近年新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞亞群,是一種新型的CD4+效應T細胞,在炎癥性疾病及自身免疫病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的免疫調節(jié)作用[19]。國外學者研究發(fā)現(xiàn)在AA患者的頭皮中,特別是在毛囊周圍,有Th17細胞浸潤[20],IL-17A較對照組升高[21,22],AA患者外周血Thl7細胞比例較健康對照顯著升高[23],且AA活動期組外周血清IL-17水平明顯高于穩(wěn)定期組和正常對照組[24],兒童AA患者外周血與健康兒童比較,外周血Th17細胞比例、IL-17水平增高[25],這些均表明IL-17信號通路可能參與了AA的發(fā)病機制。

有研究發(fā)現(xiàn),miR-6819-3p在AA患者的血清中表達降低[12],我們的研究也表明,在AA病變部位miR-6819-3p的表達較正常組降低,提示其表達降低在AA的發(fā)病過程中起著一定作用。進一步生物信息學的研究發(fā)現(xiàn),CSF3、CXCL8、FOS、FOSB、JUN和NFKBIA等為miR-6819-3p的預測靶基因,且這些基因均屬于IL-17信號通路。我們的實驗同時也證實CSF3、CXCL8、FOS、FOSB、JUN和NFKBIA在AA病變部位的表達增加,與miR-6819-3p的表達情況相反,提示miR-6819-3p對這些基因可能具有調控作用,CSF3、CXCL8、FOS、FOSB、JUN和NFKBIA在AA病變部位表達的增加可能是miR-6819-3p表達降低的結果。

研究顯示,FOS、FOSB、JUN編碼的蛋白質是AP-1轉錄因子亞單位[26,27],而IL-17以AP-1依賴的方式通過p38/c-Fos和JNK/c-Jun激活炎癥反應[28],并能刺激產(chǎn)生CXCL8[29,30]和CSF3[31],促進NFKBIA的表達[32]。這些均表明IL-17與miR-6819-3p這些預測靶基因間存在著密切的調控關系,且這些基因都在IL-17信號通路的下游,因此miR-6819-3p可以通過對這些靶基因以及IL-17信號通路的調控在AA的發(fā)病中發(fā)揮作用。

AA是一種身體局部出現(xiàn)的病癥,病變部位基因表達的變化更能直觀地反應疾病發(fā)生的機制,同時可以根據(jù)這些改變進行局部的針對性治療,應較全身用藥更加安全有效。本研究首次為miR-6819-3p及其預測靶基因在AA發(fā)病機制中的功能作用提供了證據(jù),并提示這些基因可以成為AA診斷和治療中的生物靶標。在下一步的研究中,我們將采用雙熒光素酶報告基因檢測技術等方法進一步對miR-6819-3p的靶基因進行篩選驗證。