陳科 呂小華 林健靜 孫軍營 袁正彬 周輝 葉健文 李中杰

（1.深圳市人民醫(yī)院暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱外科，廣東深圳 518020；2.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東湛江 524023；3.北京大學(xué)深圳醫(yī)院骨科，廣東深圳 518036）

椎間盤退變引起的下腰痛在人群中的發(fā)病率很高，已成為排名第一的職業(yè)性疾病。下腰痛是導(dǎo)致老年人癱瘓的主要原因，嚴重影響老年人的生活質(zhì)量，給患者及家屬帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)[1]。但是，有關(guān)椎間盤退變的機制仍未完全明確。越來越多的證據(jù)表明軟骨終板退變是椎間盤退變的始動因素[2]。自噬是真核生物細胞一種高度保守自我吞噬的過程。近年來，有證據(jù)顯示自噬在椎間盤退變過程中起重要作用[3]。亦有證據(jù)表明自噬還參與了椎間盤髓核細胞和關(guān)節(jié)軟骨細胞的代謝過程，從而在椎間盤退變和關(guān)節(jié)軟骨退變中發(fā)揮積極作用[4,5]。本研究擬探討自噬在椎間盤軟骨終板細胞代謝中的作用，以進一步揭示椎間盤退變的病理機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑

2周齡雄性SD大鼠購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心[實驗動物許可證編號：SYXK（粵）2015-0106]，每籠5 只，恒溫[（23±2）°C]、恒濕[（50±5）%]、每12 h 光暗循環(huán)的條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周后用于后續(xù)的原代細胞提取實驗。

細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購自美國Gibco 公司；重組大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α，50 ng/ml，常用于模擬椎間盤退變和/或關(guān)節(jié)退變炎性細胞所處的環(huán)境）購自美國Peprotech公司，巴弗洛霉素（baflomycin A1，Baf，一種常用的自噬抑制劑）、聚集蛋白聚糖（aggrecan）抗體和Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma Aldrich公司；tublin抗體購自碧云天生物技術(shù)研究所；β-actin 抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司，Ⅱ型膠原纖維α1（collagen type Ⅱalpha 1，COL2A1）抗體購自英國ABcam 公司；TRIzol RNA 抽提試劑盒購自美國Invitrogen 公司；RT-PCR 試劑盒和實時PCR 試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；mRNA 引物委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.2 大鼠原代腰椎間盤軟骨終板細胞的提取

通過頸椎脫臼法將4 周齡的雄性SD 大鼠處死，取其腰椎間盤，然后在解剖顯微鏡下放大4倍，仔細地將椎間盤的上下軟骨終板分離出來，用大量0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffer saline,PBS）沖洗后，用解剖剪將軟骨終板剪成＜1 mm3的小塊。將剪成小塊的軟骨終板用0.25%胰酶在37℃消化30 min后，用0.1 mol/L PBS 洗去殘留的胰酶，將軟骨終板碎塊移入一個裝有0.2%Ⅱ型膠原酶的試管中消化4～6 h。消化完畢后，用0.1 mol/L PBS 洗去Ⅱ型膠原酶，將細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，并添加1%青霉素鏈霉素抗生素，每隔2～3 d更換一次培養(yǎng)液。

1.3 細胞分組及處理

將細胞分為對照組、Baf組、TNF-α組、TNF-α+Baf組4組。對照組、Baf組、TNF-α組分別采用二甲基亞砜、Baf、TNF-α 作用于細胞24 h；TNF-α+Baf組先用Baf阻斷自噬，再用TNF-α作用于細胞24 h。

1.4 RT-PCR檢測COL2A1、aggrecan mRNA的表達

1.4.1 總RNA的提?。簩?孔板內(nèi)的軟骨終板細胞用PBS反復(fù)清洗，加入TRIzol試劑，反復(fù)吹打細胞，將裂解液移入一個新的1.5 ml EP管中，室溫靜止5 min后，再將上述裂解液離心，小心吸取上清液，加入氯仿后離心，吸取上清液，加入異丙醇，離心后倒掉上清液，加入75%乙醇（DEPC水配制）洗滌RNA沉淀，待沉淀干燥后，加入適量DEPC水溶解，測定RNA濃度和質(zhì)量，分裝并保存于-80℃冰箱。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)：轉(zhuǎn)錄體系為20 μl體系，具體操作步驟如下：1 μg各樣本總RNA 10 μl，Prime Script RT Enzyme Mix×Ⅰ1 μl，RT Primer Mix 1 μl，5×Prime Script Buffer 2（for Real Time）4 μl，RNase Free dH2O 4 μl，將上述液體混勻并離心后進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，PCR 反應(yīng)條件設(shè)置如下：37℃15 min，85℃5 s，4℃，反應(yīng)結(jié)束后將樣本取出，置于-20℃保存。

1.4.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)：從GeneBank 中搜索到大鼠相關(guān)COL2A1和aggrecan基因及內(nèi)參基因GAPDH序列，根據(jù)其mRNA 序列，委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成COL2A1、aggrecan 和GAPDH引物（引物名稱及序列詳見表1）。

表1 引物名稱及序列

按下列組分配制PCR反應(yīng)液（反應(yīng)液的配制在冰上進行）：SYBR Premix Ex Taq?（2×）10 μl，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μl，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μl，cDNA模板1.0 μl，dH2O（滅菌蒸餾水）8 μl?；靹蚝蟀聪率鋈椒〝U增：預(yù)變性：95℃30 s；PCR 反應(yīng)（40 個循環(huán)）：95℃5 s，55℃30 s，72℃30 s；溶解過程：95℃5 s，65℃1 min。各基因mRNA 表達用2-ΔΔCT計算結(jié)果來表示。

1.5 COL2A1和aggrecan蛋白表達的檢測

1.5.1 細胞蛋白的提?。簩?孔板內(nèi)軟骨終板細胞清洗后，加入蛋白裂解液裂解30 min，15 000 r/min（r=7.7 cm）4℃離心15 min，取上清并轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml EP 管中，取部分蛋白裂解液用于蛋白濃度測定（BCA 法），按EP 管中裂解液的體積加入適量的5×蛋白上樣緩沖液，將加好上樣緩沖液的蛋白裂解液在100℃煮沸5～10 min后4℃冰箱保存。

1.5.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測：用濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)移至用甲醇激活的PVDF 膜或者NC 上，用5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，TBST洗膜，10 min/次，共3次，將膜加入按適當(dāng)?shù)谋壤靡豢瓜♂屢合♂尩腃OL2A1、aggrecan、tubulin 和β-actin 抗體，在4℃搖床上孵育過夜，第二天用TBST 洗膜，10 min/次，共3次，二抗室溫孵育60min后用TBST洗膜，10min/次，共3 次，感興趣的蛋白條帶用ECL 化學(xué)發(fā)光液發(fā)光，應(yīng)用圖像分析軟件以內(nèi)參為對照對相應(yīng)的條帶進行定量分析。

1.5.3 細胞免疫熒光染色檢測：將24孔板內(nèi)爬附在小圓玻片上的軟骨終板細胞用0.1 mol/L PBS反復(fù)清洗3次（5 min/次），用預(yù)冷的4%多聚甲醛在4℃固定細胞30 min，PBS在搖床上洗滌細胞，5 min/次，共3次，用0.2%的Triton X-100 室溫下細胞膜打孔20 min（搖床上），PBS 洗滌細胞，5 min/次，共3 次，10%山羊血清室溫下封閉1 h，PBS洗滌細胞，5 min/次，共3次（搖床上），然后加入一抗稀釋液稀釋的一抗COL2A1（1∶200）、aggrecan（1∶200），4℃過夜，去除一抗，PBS洗滌細胞，5 min/次，共3次（搖床上），室溫避光孵育熒光標記的二抗1 h，去除二抗，再次用PBS洗滌細胞，5 min/次，共3次（搖床上避光），用Dapi 復(fù)染細胞核5～10 min，去除Dapi染液，用PBS洗滌細胞，5 min/次，共3次（搖床上避光），防淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS11.5 統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有實驗至少重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析均符合正態(tài)分布，以表示。多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD檢驗或SNK檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自噬對大鼠腰椎間盤軟骨終板細胞COL2A1 和aggrecan mRNA表達的影響

Baf 組、TNF-α 組和TNF-α+Baf 組COL2A1、aggrecan mRNA表達量均較對照組減少，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TNF-α+Baf 組COL2A1、aggrecan mRNA表達量均較Baf組、TNF-α組減少，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Baf組與TNF-α組COL2A1、aggrecan mRNA表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。這表明自噬對大鼠腰椎間盤軟骨終板細胞分泌的COL2A1、aggrecan mRNA具有保護作用。

表2 各組COL2A1和aggrecan mRNA表達量的比較（）

表2 各組COL2A1和aggrecan mRNA表達量的比較（）

注：△P＜0.05，與對照組比較；▲P＜0.05，與Baf組、TNF-α組比較

2.2 自噬對大鼠腰椎間盤軟骨終板細胞COL2A1 和aggrecan蛋白表達的影響

2.2.1 蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果：Baf 組、TNF-α 組和TNF-α+Baf組COL2A1、aggrecan 蛋白表達量均較對照組減少，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；TNF-α+Baf 組COL2A1、aggrecan 蛋白表達量均較Baf 組、TNF-α 組減少，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Baf 組與TNF-α組COL2A1、aggrecan 蛋白表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1和表3。這表明自噬對大鼠腰椎間盤軟骨終板細胞分泌的COL2A1、aggrecan蛋白具有保護作用。

表3 各組COL2A1和aggrecan蛋白表達量的比較（）

表3 各組COL2A1和aggrecan蛋白表達量的比較（）

注：△P＜0.05，與對照組比較；▲P＜0.05，與Baf組、TNF-α組比較

圖1 各組COL2A1和aggrecan蛋白的蛋白質(zhì)印跡法分析結(jié)果

2.2.2 細胞免疫熒光染色結(jié)果：細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，COL2A1 蛋白主要分布于椎間盤軟骨終板細胞質(zhì)中，在軟骨終板細胞的自噬被阻斷后，細胞分泌的COL2A1 蛋白較對照組明顯減少（圖2）。Aggrecan 蛋白主要分布于椎間盤軟骨終板細胞質(zhì)中，在軟骨終板細胞的自噬被阻斷后，細胞分泌的aggrecan 蛋白較對照組明顯減少（圖3）。這從另一個角度證實自噬對大鼠腰椎間盤軟骨終板細胞分泌的COL2A1、aggrecan蛋白有保護作用。

圖2 細胞免疫熒光染色檢測自噬對大鼠腰椎間盤軟骨終板細胞COL2A1蛋白表達的影響

圖3 細胞免疫熒光染色檢測自噬對大鼠腰椎間盤軟骨終板細胞aggrecan蛋白表達的影響

3 討論

頸肩痛、下腰痛在人群中的發(fā)病率為80%～90%，嚴重影響人們的身心健康，而椎間盤退變疾病是引起頸肩痛、下腰痛的重要原因[6]。目前，針對椎間盤退變疾病的臨床治療策略包括物理治療、抗炎藥物治療和外科手術(shù)治療[7,8]。眾所周知，外科手術(shù)治療僅限于手術(shù)解除壓迫、緩解癥狀，不能從根本上阻止椎間盤退變的發(fā)生與發(fā)展，且外科手術(shù)治療本身有術(shù)后復(fù)發(fā)、鄰近節(jié)段退變加速、手術(shù)節(jié)段機械物理特性改變等很多并發(fā)癥[9,10]。而生物學(xué)治療是一種潛在的能從根本上阻止椎間盤退變發(fā)生、發(fā)展，且恢復(fù)椎間盤正常功能與生物力學(xué)特性，使患者避免外科手術(shù)之苦的新的治療方法。但是，由于椎間盤退變的發(fā)病機制仍不清楚導(dǎo)致椎間盤的生物治療進展緩慢。軟骨終板是一個飽含水分的生物組織，位于椎間盤的上下緣，是椎間盤獲取營養(yǎng)的主要通道[11,12]。越來越多的證據(jù)表明軟骨終板退變是椎間盤退變的始動因素[2]。盡管有證據(jù)表明軟骨終板細胞過多的凋亡在軟骨終板退變中起著重要作用，然而軟骨終板退變的潛在分子機制仍不清楚[13]。

自噬是真核生物中細胞一種高度保守自我吞噬過程，與細胞凋亡密切相關(guān)[14]。細胞通過吞噬分解細胞內(nèi)不重要的成分提供能量來抵御細胞遭受到的不良刺激，但是過度的自噬往往會導(dǎo)致細胞凋亡[15,16]。近年來，一些證據(jù)顯示自噬在椎間盤退變過程中起重要作用[17]。與此同時，也有證據(jù)表明椎間盤軟骨終板細胞內(nèi)存在著自噬現(xiàn)象，且可能在軟骨終板退變中起重要作用[18,19]。

本研究通過RT-PCR、蛋白質(zhì)印跡法、細胞免疫熒光染色等方法證實軟骨終板細胞存在自噬現(xiàn)象，且自噬對大鼠腰椎間盤軟骨終板細胞分泌的COL2A1和aggrecan有保護作用，提示自噬對大鼠腰椎間盤軟骨終板細胞具有保護作用，進而可能在椎間盤軟骨終板退變乃至椎間盤退變的過程中發(fā)揮著積極的作用。

有研究表明自噬保護細胞的可能機制有：①通過自我吞噬從而抑制細胞凋亡來保護細胞；②通過減少分泌對細胞有害的物質(zhì)來保護細胞。另外，也有研究顯示：過多的自噬會導(dǎo)致另外一種細胞死亡方式——自噬性細胞死亡。在椎間盤退變中自噬的作用亦有爭議：有研究表明，椎間盤軟骨終板細胞在遭受應(yīng)激情況下，通過提高自噬來抑制細胞凋亡，進而保護椎間盤軟骨細胞，進而可能在椎間盤退變中發(fā)揮保護作用[18,20]，然而也有研究表明，隨著年齡增加或其他刺激因素的存在，椎間盤內(nèi)細胞自噬增加，自噬性細胞死亡導(dǎo)致椎間盤退變，可能在椎間盤退變中有著有害作用[21-23]。大多研究認為自噬在椎間盤退變中可以抑制椎間盤細胞凋亡，對椎間盤退變起著保護作用。也可能在椎間盤退變不同階段，自噬起的作用不同。

除了細胞凋亡會影響椎間盤退變外，椎間盤軟骨終板細胞代謝異常導(dǎo)致的細胞外基質(zhì)改變也是椎間盤退變的重要表現(xiàn)[24,25]。COL2A1 和aggrecan 是軟骨細胞代謝過程中細胞外基質(zhì)的重要組成部分，COL2A1和aggrecan等細胞外基質(zhì)的減少代表著椎間盤的退變，而TNF-α是退變椎間盤中最常見的炎性因子，常用作體外刺激椎間盤或軟骨細胞的刺激因子，以模擬體外椎間盤退變或軟骨退變[26,27]。

已有研究表明自噬參與了椎間盤髓核細胞和關(guān)節(jié)軟骨細胞的代謝過程，自噬激活可以增加髓核細胞、軟骨細胞Ⅱ型膠原和aggrecan 分泌，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase）-13分泌，從而在椎間盤退變和關(guān)節(jié)軟骨退變中發(fā)揮積極的作用[24,28]。最近有研究表明，自噬可以抑制循環(huán)牽張力對軟骨終板細胞鈣化的影響，從而在軟骨終板鈣化中發(fā)揮積極的作用，提示自噬極有可能參與了椎間盤軟骨終板細胞的代謝過程，并在其中起重要作用[19,29]。這些實驗的結(jié)論與本實驗結(jié)果相似，進一步印證了本研究結(jié)果，提示自噬在椎間盤軟骨終板退變乃至椎間盤退變的過程中發(fā)揮著積極的作用。

亦有研究報道與本研究結(jié)果不完全一致。有研究結(jié)果顯示，在炎性因子存在的情況下，自噬對軟骨細胞或椎間盤髓核細胞分泌的COL2A1和aggrecan有保護作用，而在沒有炎癥因子參與作用下，干預(yù)自噬對軟骨細胞或椎間盤髓核細胞分泌的COL2A1和aggrecan的保護作用不明顯[30-32]。本課題組分析認為，一方面這些研究的結(jié)果大都是在關(guān)節(jié)軟骨細胞或椎間盤髓核細胞上得出的，雖然椎間盤軟骨終板細胞在很多方面與關(guān)節(jié)軟骨細胞或髓核細胞非常相似，但是不完全一樣，導(dǎo)致同樣的環(huán)境或條件，細胞反應(yīng)不完全一樣。另一方面，這些研究的自噬抑制劑用的是3-MA，而本研究采用的是Baf，這也可能是導(dǎo)致結(jié)果不完全一致的原因。本研究結(jié)論需要后續(xù)更多的實驗數(shù)據(jù)支持。

當(dāng)然，本研究也存在一些缺點。首先，本研究所得到的數(shù)據(jù)均是來自于體外，體外細胞所處的環(huán)境與體內(nèi)不同，甚至有比較大的差別，因此體外的結(jié)果不一定能完全代表體內(nèi)。另外，本實驗中抑制自噬主要用自噬抑制藥物來實現(xiàn)的，進一步的基因沉默技術(shù)可被用來證實本研究結(jié)論。第三，再做相關(guān)研究時，本課題組可以設(shè)多幾個對照組，將文獻中其他自噬抑制劑也設(shè)立相應(yīng)對照組，同時可另外設(shè)立自噬促進劑，以及設(shè)立自噬基因過表達技術(shù)來進一步驗證上述結(jié)論。第四，本課題組在做細胞外基質(zhì)時可增加一些觀察指標譬如MMP-3、MMP-9和ADAMTS4 等，模擬椎間盤退變的炎性因子除了TNF-α 外，還可以采用白細胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）來進一步驗證上述結(jié)論。

總之，本研究結(jié)果證實，自噬對大鼠腰椎間盤軟骨終板細胞分泌的COL2A1 和aggrecan 有保護作用。本研究為試圖通過調(diào)節(jié)自噬來抑制椎間盤退變提供新的發(fā)展方向，為椎間盤退變的生物學(xué)治療提供新的潛在的治療靶點。